Đặt vấn đề từ trang 1 đến trang 3; Chƣơng 1. Tổng quan tài liệu từ trang 4 đến 28; Chƣơng 2. Đối tƣợng và Phƣơng pháp nghiên cứu, từ trang 29 đến 40; Chƣơng 3. Kết quả nghiên cứu và Bàn luận, từ trang 41 đến 71; Kết luận và Kiến nghị, từ trang 72 đến 73.
e 4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu vai trò enzyme glucose 6 phosphat dehydrogenase Gen mã mã hóa cho enzyme glucose 6 phosphat dehydrogenase (G6PD) nằm trên cánh dài đầu mút của nhiễm sắc thể giới tính X, ở vị trí P28, nên gen G6PD là một gen di truyền liên kết giới tính. Gen mã hóa G6PD bao gồm 13 exon xen kẽ là các intron có chiều dài khoảng 16Kb, trong đó exon-1 không mã hóa. G6PD đƣợc hai tác giả Otto Warburg và Christan phát hiện lần đầu tiên vào năm 1930 ở trên hồng cầu ngựa, hồng cầu của một số động vật, vi sinh vật, men bia và hồng cầu ngƣời.
Khi đó, những nghiên cứu về G6PD thƣờng là những điều tra cơ bản về các thể loại, chủ yếu là dựa vào hoạt độ xúc tác, độ di chuyển điện di và một số đặc tính của enzym [33]. Quá trình tinh khiết G6PD bắt đầu từ năm 1936, sau đó nó mới đƣợc phân lập và tinh khiết từ dịch đồng thể của men bia. Năm 1966, tác giả Yoshida lần đầu tiên tách chiết đƣợc G6PD từ hồng cầu ngƣời. Từ những thông tin về cấu trúc ban đầu, khối lƣợng phân tử và các thông số động học của G6PD mới dần đƣợc thu thập.
G6PD thuộc loại enzym oxy hóa khử, với ký hiệu quốc tế là 1.49, nằm trong hệ thống oxy hóa, nó xúc tác phản ứng oxy hóa G6P. Enzyme G6PD là một enzym quan trọng, xúc tác phản ứng đầu tiên của chu trình pentose phosphate - con đƣờng oxy hóa trực tiếp ở hồng cầu [1],[2]. Về mặt năng lƣợng con đƣờng này cung cấp không đáng kể vì chỉ có 10% glucose đƣợc thoái hóa ở đây, nhƣng về mặt sinh lý nó lại tạo ra NADPH, một chất khử mạnh liên quan mật thiết với các quá trình chuyển hóa và sự toàn vẹn của hồng cầu. Quá trình tách chiết enzyme ra khỏi hồng cầu cũng ngày càng đạt đƣợc độ tinh sạch cao hơn.
Cùng với sự phát triển của chuyên ngành sinh học phân tử, các dạng đột biến gen của G6PD càng đƣợc phát hiện nhiều. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của enzyme G6PD 1. Cấu trúc của enzyme G6PD là một enzyme polymer đƣợc tạo thành từ nhiều monomer. Một monomer G6PD bao gồm 515 amino acid với khối lƣợng phân tử khoảng 59.
Enzyme hoạt động tồn tại dƣới dạng chính là dimer (chuỗi kép) và chứa cầu nối NADP [34]. Sự biến đổi từ các monomer không hoạt động sang dạng hoạt động dimer, tetramer đòi hỏi phải có sự hiện diện của NADP. Cấu trúc bậc 2 của enzyme G6PD có dạng xoắn α. G6PD có thể tồn tại dƣới nhiều dạng nhƣ monomer, dimer, trimer, tetramer và hexamer, nghĩa là có các olygomer bao gồm 1,2,3,4 hoặc 6 chuỗi polypeptide [6].
Nhƣ vậy trong enzyme hoạt động, NADP vừa là phần cấu trúc nối hai monomer vừa là chất tham gia phản ứng. Vị trí kết nối coenzym này chƣa đƣợc xác định song kiểm tra các đột biến đã chỉ ra đó là điểm amino acide 386 và 387, tƣơng ứng với lysine và arginine. Cơ chế hoạt động của G6PD G6PD xúc tác phản ứng thứ nhất của con đƣờng hexose monophosphate (HMP), nó oxy hoá G6P thành 6 phospho gluconolactone và chuyển NADP thành NADPH. HMP là đƣờng duy nhất tạo NADPH trong HC, NADPH là một coenzym quan trọng giúp bảo vệ HC chống lại chất oxy hoá.
GSHPx loại bỏ các chất oxy hoá ra khỏi HC theo chu trình: Hình 1. Sơ đồ quá trình tổng hợp glutathione có sự tham gia enzyme G6PD e 6 Ba enzyme trên hoạt động theo chu trình: Tiêu hủy ROOH nhằm tránh gốc tự do, giảm G6PD sẽ làm giảm yếu tố bảo vệ HC. Đặc biệt, HC giàu catalase mà catalase là một enzyme oxy hóa phản ứng: Km của G6PD dành cho NADP là rất thấp (khoảng 2-4 mcmol/L và enzyme này bị ức chế bởi NADPH. Tỷ số NADPH/NADP+ kiểm soát phản ứng theo nguyên tắc tự động.
Ở dạng không hoạt động tỷ số NADPH/NADP + rất cao và G6PD gần nhƣ bị ức chế hoàn toàn. Khi NADPH bị oxy hoá, lúc đó oxidic glutathion bị giảm xuống trong phản ứng làm giảm glutathion. NADPH sẽ chuyển thành NADP+ và G6PD trở nên xúc tác phản ứng chuyển NADP + thành NADPH làm chất gây ra oxy hoá bị đào thải. Trƣờng hợp giảm G6PD cơ thể sẽ mất khả năng đáp ứng với các tác nhân oxy hoá.
Đặc điểm di truyền, cấu trúc và đột biến trên G6PD 1. Đặc điểm di truyền Thiếu hụt G6PD là một bệnh di truyền liên kết nhiễm sắc thể (NST) X không có alen tƣơng ứng trên Y. Trƣớc khi những nghiên cứu cơ bản về di truyền của G6PD đƣợc biết, bằng xét nghiệm thử độ ổn định của glutathion. Sơ đồ di truyền về khiếm khuyết thiếu enzyme G6PD e 7 Nghiên cứu phả hệ của Afro- về các gia đình ngƣời Mỹ cho thấy sự bất thƣờng glutathion là di truyền từ mẹ sang con trai dù ở những trƣờng hợp đó những biến đổi của glutathion không đƣợc phát hiện ở mẹ.
Bằng những kỹ thuật phù hợp ngƣời ta đã xác định đƣợc nguyên nhân của bất thƣờng di truyền đó là ở những bà mẹ có đột biến trên gen mã hoá G6PD dạng dị hợp tử [40]. Sau này với nhiều phát hiện cơ bản về G6PD, thiếu G6PD có di truyền liên kết với NST X đã đƣợc khẳng định bằng cách đánh giá hoạt độ enzym, nghiên cứu về sự di chuyển điện di, nghiên cứu di truyền của bệnh mù màu. Cho đến nay có nhiều gia đình mà sự bất thƣờng trong di truyền liên kết NST X vẫn đƣợc thu thập và ghi nhận. Những bất thƣờng này đƣa đến kết luận là 1 trong 2 quy định cấu trúc G6PD nằm trên NST X có thể đã bị đột biến ở mẹ.
Gần đây, ngƣời ta đã phát hiện ra trên gen mã hóa cho G6PD là một trong những gen nằm trên cánh dài NST X (q28). Đó là tập hợp những gen fragile X, Hemophilia A, đen quy định màu sắc khi nhìn mà khi đột biến gây bệnh mù màu [44]. Nhƣ vậy, tình trạng thiếu G6PD là bệnh di truyền liên kết NST X do mẹ truyền cho con trai.2 Đặc điếm về gen liên quan G6PD Locus liên quan đến quy định cấu trúc G6PD nằm trên nhánh dài vùng 2 băng 8 của NST X (X. Gen đƣợc tách và giải trình tự bởi Persico [44].
Gen có 13 exon, dài 20kb, exon đầu tiên không đƣợc mã hoá và intron giữa exon 2 và 3 dài hơn mức bình thƣờng, khoảng 9. Trình tự của gen G6PD đã đƣợc biết toàn bộ. Vị trí 5' của gen là một vùng giàu 2 nucleotide: Cytidine và Guanidine (CpG). Vùng CpG này đƣợc bảo tồn giữa ngƣời và chuột.
Một số ARNm đã đƣợc phát hiện nhƣng chức năng của nó chƣa hiểu hết. ARNm chứa 138 nucleotide nằm trên intron 7 của đầu 3'. Trên thử nghiệm in vitro ngƣời ta đã tạo ra đƣợc G6PD từ loại vi khuẩn E. Đột biến trên G6PD và biểu hiện bệnh thiếu G6PD Khi gen cấu trúc bị đột biến sẽ gây nên thiếu G6PD về mặt chất lƣợng.
e 8 Còn khi gen điều hoà hoặc gen khởi động bị đột biến sẽ gây ra thiếu G6PD về số lƣợng. Sự biến đổi về mặt số lƣợng và chất lƣợng của phân tử enzym đều dẫn đến thay đổi hoạt độ của enzym. Trong nữ giới, mỗi tế bào đều có hai gen mã hóa cho G6PD (một gen nhận từ bố, một gen nhận từ mẹ). Những ngƣời nữ dị hợp tử vì mang gen đột biến là lặn nên có thể có kiểu hình bình thƣờng, tuy nhiên có thể có các biểu hiện bệnh lý ở mức độ nhẹ hoặc vừa, một số lại biểu hiện rất nặng.
Nguyên nhân là do một trong hai nhiễm sắc thể trong tế bào nữ đã bị bất hoạt từ giai đoạn sớm của thời kỳ phôi thai, sau đó theo sự phân bào nó đƣợc nhân lên tạo thành cơ thể ở dạng khảm giữa tế bào có nhiễm sắc thể lành và mang đến bệnh với các tỷ lệ khác nhau. Vì vậy, những ngƣời này có hai quần thể hồng cầu: Hình 1. Sơ đồ di truyền nhiễm sắc thể liên quan đến thiếu enzyme G6PD Một nhóm hồng cầu bình thƣờng và một thiếu hụt G6PD. Tỷ lệ của chúng thay đổi trong phạm vi rộng 50:50.
ở một số ít trƣờng hợp các hồng cầu bất thƣờng chỉ chiếm 1%, nhƣng cũng có khi lên đến 99%. Nam giới chỉ có một NST X di truyền từ mẹ nên nếu thừa hƣởng đến bị đột biến họ sẽ có kiểu trên bán hợp tử và biểu hiện sự thiếu hụt G6PD [33],[34]. Năm 1993, Beutler tìm thấy 58 dạng đột biến tƣơng ứng 97 biến thể. Năm e 9 2002, ngƣời ta đã tìm ra đƣợc hơn 140 đột biến hay phức hợp đột biến tƣơng ứng trên 442 biến thể của G6PD, 299 biến thể trong đó đƣợc phân loại bởi Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG).
Họ mô tả một biến thể mới phải hoàn toàn khác với những biến thể đã từng đƣợc biết và công bố dựa trên chỉ số nhƣ hoạt độ enzyme, di chuyển điện di, hằng số cho G6PD và NADP [12]. Vì hầu hết đột biến về G6PD đều có bất thƣờng về điện di, động học hoặc cả hai nên ngƣời ta cho rằng đột biến tác động đến enzyme phải đƣợc tìm thấy trên vùng mã hoá. Ngày nay, nhờ kỹ thuật sinh học phân tử, đặc biệt phân tích chuỗi trùng hợp (PCR) mà sự xác định ra đột biến trở nên chính xác và có thể phát hiện nhiều đột biến trên một cá thể. Trong điều kiện sống bình thƣờng, sự thiếu hụt G6PD ít có biểu hiện lâm sàng vì quá trình khử đƣợc bảo đảm nhờ hệ thống enzym phụ thuộc NAD+, do vậy hàm lƣợng glutathion dạng khử chỉ giảm nhẹ, tỷ lệ methaemoglobin (MetHb) thấp.
Ở những ngƣời thiếu hụt G6PD sự già hóa theo tuổi thọ của hồng cầu thƣờng sớm hơn bình thƣờng [17], đời sống của HC giảm 20% do có hiện tƣợng tan máu nhẹ ngay cả khi không dùng một thuốc nào. Bù lại cơ thể tăng cƣờng sản xuất HC non trong tuỷ xƣơng. Dƣới tác dụng của thuốc hoặc chất oxy hoá dẫn đến hệ thống enzyme khử phụ thuộc NAD+ không còn đáp ứng đủ nhu cầu quá trình khử, lúc này enzyme thuộc NADP trở nên quan trọng. Hai hệ thống này tăng cƣờng hoạt động để bảo vệ HC.
Những ngƣời thiếu G6PD cơ chế bảo vệ HC chống lại tác nhân oxy hoá bị giảm nên hay xảy ra tan huyết.