Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học evaluation of genetic diversity of tea tree melaleuca alternifolia collected from dong thap muoi center based on issr inter simple sequence repeats marker

Luận văn tốt nghiệp kỹ thuật nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học evaluation of genetic diversity of tea tree melaleuca alternifolia, điều tra thực trạng, phân tích số liệu,

• Tác giả: Vo Lam Hai Nam
• Người hướng dẫn: Pham Duc Toan, Ph.D
• Trường học: Nong Lam University
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Đánh Giá Đa Dạng Di Truyền Cây Tràm Trà (Melaleuca alternifolia) Tại Trung Tâm Đồng Tháp Mười Dựa Trên Chỉ Thị ISSR
• Loại tài liệu: graduation thesis
• Năm xuất bản: 2019 - 2023
• Địa điểm: Thu Duc City

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENT
• CONFIRMATION COMMITMENT
• ABSTRACT
• TÓM TẮT
• 1. CHAPTER 1: INTRODUCTION
• 1.1. Introduction to Melaleuca alternifolia
• 1.2. Origin and Distribution of Tea Tree
• 2. CHAPTER 2: ANALYSIS OF GENETIC DIVERSITY BASED ON MOLECULAR MARKERS
• 2.1. The Concept of Genetic Diversity
• 2.2. A few techniques for researching genetic diversity
• 2.3. Introducing the genetic classification tree building software NTSYSpe 2
• 2.4. Some domestic and international research on Melaleuca alternifolia
• 2.4.1. Domestic research
• 2.4.2. International research
• 3. CHAPTER 3: MATERIAL AND METHOD
• 3.1. Materials and Method
• 3.2. Evaluation of leaf morphological marker
• 3.3. Sample extraction and DNA testing of Melaleuca alternifolia leaf
• 3.4. Product qualification by electrophoresis technique
• 3.5. PCR-ISSR reaction
• 4. CHAPTER 4: RESULTS AND DISCUSSION
• 4.1. Results of total DNA extraction from tea tree leaves
• 4.2. Results of PCR-ISSR
• 4.3. Measured primer temperatures for ISSR-PCR reaction
• 4.4. PCR product with ISSR
• 4.5. Genetic diversity analysis of 50 tea tree samples
• 5. CONCLUSION AND SUGGESTIONS
• REFERENCES
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Đánh Giá Đa Dạng Di Truyền Cây Tràm Trà

Cây tràm trà (Melaleuca alternifolia) là một loài cây có giá trị kinh tế cao, nổi bật với khả năng kháng khuẩn và sản xuất tinh dầu. Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá sự đa dạng di truyền của cây tràm trà tại Trung Tâm Đồng Tháp Mười, nơi có điều kiện tự nhiên thuận lợi cho sự phát triển của loài cây này. Việc đánh giá đa dạng di truyền không chỉ giúp bảo tồn nguồn gen mà còn hỗ trợ trong việc phát triển các sản phẩm từ cây tràm trà.

1.1. Cây Tràm Trà Đặc Điểm và Ứng Dụng

Cây tràm trà có nhiều ứng dụng trong y học và công nghiệp. Tinh dầu từ cây tràm trà được sử dụng rộng rãi trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe và làm đẹp. Đặc biệt, các thành phần chính như Eucalyptol và a-Terpineol mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Đánh Giá Đa Dạng Di Truyền

Đánh giá đa dạng di truyền giúp xác định các biến thể gen trong quần thể cây tràm trà. Điều này không chỉ hỗ trợ trong việc bảo tồn mà còn tạo điều kiện cho việc phát triển giống cây mới có chất lượng tốt hơn.

II. Vấn Đề Đặt Ra Trong Nghiên Cứu Đa Dạng Di Truyền

Mặc dù cây tràm trà có nhiều tiềm năng, nhưng việc nghiên cứu và bảo tồn nguồn gen của nó vẫn gặp nhiều thách thức. Các vấn đề như sự suy giảm môi trường sống, biến đổi khí hậu và thiếu thông tin về di truyền học của cây tràm trà đang đặt ra nhiều khó khăn cho các nhà nghiên cứu.

2.1. Thách Thức Trong Bảo Tồn Di Truyền

Sự suy giảm môi trường sống do hoạt động con người và biến đổi khí hậu đang đe dọa đến sự tồn tại của cây tràm trà. Việc bảo tồn nguồn gen trở nên cấp thiết hơn bao giờ hết.

2.2. Thiếu Thông Tin Về Di Truyền Học

Thông tin về di truyền học của cây tràm trà tại Việt Nam còn hạn chế. Điều này gây khó khăn trong việc áp dụng các phương pháp nghiên cứu hiện đại để đánh giá đa dạng di truyền.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Đánh Giá Đa Dạng Di Truyền

Nghiên cứu sử dụng chỉ thị ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) để đánh giá đa dạng di truyền của 50 mẫu cây tràm trà. Phương pháp này cho phép xác định các biến thể gen một cách chính xác và hiệu quả.

3.1. Quy Trình Lấy Mẫu và Phân Tích DNA

Quy trình lấy mẫu bao gồm việc thu thập lá cây tràm trà và tiến hành tách chiết DNA. Sau đó, các mẫu DNA được phân tích bằng phương pháp PCR với các primer ISSR đã được chọn lọc.

3.2. Phân Tích Kết Quả và Xây Dựng Cây Phân Nhóm

Kết quả phân tích được thực hiện bằng phần mềm NTSYSpc 2.1, sử dụng hệ số tương đồng DICE và phương pháp phân nhóm UPGMA để xây dựng cây phân nhóm di truyền cho các mẫu cây tràm trà.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Đánh Giá Đa Dạng Di Truyền

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự đa dạng di truyền giữa các mẫu cây tràm trà không quá cao. Hệ số khoảng cách di truyền của các mẫu nằm trong khoảng từ 0.19 đến 0.77, cho thấy sự tương đồng giữa các mẫu cây.

4.1. Phân Tích Đa Dạng Di Truyền

Tổng cộng có 104 băng được tạo ra, trong đó 93 băng đa hình chiếm tỷ lệ 88.6%. Điều này cho thấy sự hiện diện của nhiều biến thể gen trong quần thể cây tràm trà.

4.2. Phân Nhóm Các Mẫu Cây

Kết quả phân nhóm cho thấy 50 mẫu cây tràm trà được chia thành 5 nhóm khác nhau dựa trên hệ số khoảng cách di truyền trung bình 0.44, cho thấy sự phân hóa di truyền trong quần thể.

V. Kết Luận và Hướng Tương Lai Trong Nghiên Cứu

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc đánh giá đa dạng di truyền của cây tràm trà là cần thiết để bảo tồn và phát triển giống cây này. Các kết quả thu được sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm nâng cao chất lượng và giá trị kinh tế của cây tràm trà.

5.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Đa Dạng Di Truyền

Đánh giá đa dạng di truyền không chỉ giúp bảo tồn nguồn gen mà còn hỗ trợ trong việc phát triển các sản phẩm từ cây tràm trà, đáp ứng nhu cầu thị trường.

5.2. Định Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về di truyền học của cây tràm trà, áp dụng các công nghệ hiện đại để nâng cao hiệu quả trong việc bảo tồn và phát triển giống cây này.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây tràm trà (Melaleuca alternifolia Cheel) là loài cây thân gỗ nhỏ thuộc họ Đào kim nương (Myrtaceae), có nguồn gốc bản địa từ vùng Đông Nam Queensland và bờ biển phía Bắc New South Wales, nước Úc. Đây là nguồn nguyên liệu thực vật quan trọng để chiết xuất tinh dầu tràm trà thương mại phục vụ các lĩnh vực dược phẩm và mỹ phẩm. Hai thành phần hoạt tính chính tạo nên giá trị y học và khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tràm trà là Terpinen-4-ol (chiếm tỷ lệ từ 30% trở lên theo tiêu chuẩn Úc AS 2782-1985) và 1,8-Cineole/Eucalyptol (giới hạn dưới 15% để tránh kích ứng da).

Tại Việt Nam, cây tràm trà được nhập nội khảo nghiệm từ năm 1993 và hiện nay được quy hoạch phát triển tại vùng đất phèn thuộc huyện Mộc Hóa và huyện Thạnh Hóa, tỉnh Long An. Trong đó, Trung tâm Nghiên cứu Bảo tồn và Phát triển Dược liệu Đồng Tháp Mười (huyện Mộc Hóa) đang lưu giữ và canh tác khoảng 15 ha tràm trà nhằm cung cấp nguyên liệu cho nhà máy Mộc Hóa Tràm sản xuất tinh dầu đạt chuẩn GPP. Tuy nhiên, các thông tin di truyền về nguồn gen tràm trà nhập nội tại Việt Nam còn rất hạn chế. Việc chỉ dựa vào các đặc tính hình thái bên ngoài gặp nhiều khó khăn trong việc nhận diện và phân loại do hình thái thực vật dễ bị biến đổi bởi điều kiện môi trường thổ nhưỡng và khí hậu.

Nhằm hỗ trợ công tác di thực, nhân giống và bảo tồn nguồn gen dược liệu, khóa luận tốt nghiệp ngành Công nghệ Sinh học tại Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh thực hiện đề tài nhằm giải quyết các mục tiêu và nội dung nghiên cứu cụ thể:

1. Mục tiêu nghiên cứu: Phân tích di truyền và xác định mối quan hệ di truyền của các cá thể tràm trà (Melaleuca alternifolia) thu thập tại Trung tâm Nghiên cứu Bảo tồn và Phát triển Dược liệu Đồng Tháp Mười dựa trên chỉ thị sinh học phân tử ISSR (Inter Simple Sequence Repeats), cung cấp cơ sở dữ liệu cho công tác di thực và bảo tồn.
2. Nội dung nghiên cứu:
   • Nội dung 1: Đánh giá đặc điểm sinh trưởng và hình thái lá của 50 mẫu tràm trà thu thập tại Trung tâm.
   • Nội dung 2: Ứng dụng chỉ thị phân tử ISSR để đánh giá mức độ đa dạng di truyền và thiết lập sơ đồ phân nhóm di truyền của 50 mẫu tràm trà nghiên cứu.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
   • Đối tượng: 50 mẫu lá tràm trà (Melaleuca alternifolia), ký hiệu từ TT01 đến TT50.
   • Địa bàn thu mẫu: Trung tâm Nghiên cứu Bảo tồn và Phát triển Dược liệu Đồng Tháp Mười, huyện Mộc Hóa, tỉnh Long An.
   • Thời gian và địa điểm thực nghiệm: Khóa luận được thực hiện từ tháng 07/2023 đến tháng 10/2023 tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử A204, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường (RIBE), Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và nguyên lý chỉ thị phân tử

Đa dạng di truyền phản ánh toàn bộ sự biến dị di truyền giữa các cá thể trong cùng một quần thể hoặc giữa các quần thể khác nhau. Để đánh giá đa dạng di truyền thực vật, các phương pháp tiếp cận bao gồm:

• Chỉ thị hình thái: Đánh giá các biến dị biểu hiện ra kiểu hình (chiều cao cây, kích thước, màu sắc lá), tuy nhiên phương pháp này chịu ảnh hưởng lớn từ môi trường và các hiện tượng sinh học phức tạp (lai tự nhiên, đa bội hóa).
• Chỉ thị phân tử DNA: Khắc phục nhược điểm của chỉ thị hình thái do không phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng hay tác động ngoại cảnh. Các kỹ thuật phổ biến gồm RFLP (dựa trên lai phân tử), RAPD, AFLP, SSR và ISSR (dựa trên phản ứng PCR).
• Kỹ thuật ISSR (Inter Simple Sequence Repeat): Là phương pháp nhân bản vùng DNA nằm giữa hai trình tự lặp lại đơn giản (SSR) giống nhau nhưng ngược hướng bằng phản ứng PCR với một mồi đơn (độ dài 16–25 nucleotide, có neo từ 1–4 nucleotide ngẫu nhiên ở đầu 3' hoặc 5'). Kỹ thuật này có độ lặp lại và độ ổn định cao hơn RAPD do mồi dài hơn và nhiệt độ gắn mồi cao hơn (45°C–65°C), đồng thời không đòi hỏi phải biết trước toàn bộ trình tự bộ gen như chỉ thị SSR.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Đánh giá hình thái lá: Thu thập 2–3 cành từ các cây tràm trà đã đánh số; đo đạc các chỉ tiêu chiều cao cây, bán kính tán cây, hình dạng lá, chiều dài và chiều rộng lá bằng thước đo chuyên dụng; quan sát màu sắc lá non và lá già.
• Tách chiết DNA tổng số: Sử dụng mẫu lá non theo quy trình biến tính/tách chiết tối ưu hóa tại Viện RIBE. Quy trình gồm 12 bước sử dụng đệm ly giải [Tris 200 mM (pH = 8), EDTA 25 mM, NaCl 250 mM, SDS 0,5%], ủ nhiệt 65°C trong 40 phút; làm sạch protein và tạp chất hữu cơ bằng dung dịch PCI (Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol theo tỷ lệ 25:24:1) và CI (Chloroform : Isoamyl alcohol theo tỷ lệ 24:1); kết tủa DNA bằng Isopropanol lạnh ở -20°C trong 30 phút; rửa tủa hai lần bằng Ethanol 70%; hòa tan tủa trong 50 µL đệm TE 1X và bảo quản ở -20°C.
• Kiểm tra chất lượng DNA: Điện di DNA tổng số trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm TAE 0,5X ở điện thế 100V trong 15 phút, quan sát và chụp ảnh dưới buồng đọc gel ánh sáng tử ngoại (UV).
• Khảo sát nhiệt độ gắn mồi và tối ưu hóa phản ứng PCR-ISSR: Sàng lọc 20 mồi ISSR trên một mẫu DNA ngẫu nhiên ở 6 mức nhiệt độ bắt cặp từ 50°C đến 55°C trên máy luân nhiệt Applied Biosystems 2720 nhằm chọn ra các mồi cho dải băng đa hình rõ nét nhất.
• Thực hiện phản ứng PCR-ISSR: Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong tổng thể tích 12,5 µL (gồm 6,5 µL Master Mix 2X của hãng Meridian Bioscience, 1 µL DNA khuôn pha loãng, nước khử ion). Chu trình luân nhiệt gồm: Giai đoạn biến tính ban đầu ở 94°C trong 2 phút; 40 chu kỳ lặp lại gồm biến tính 94°C trong 30 giây, gắn mồi ở nhiệt độ thích hợp ($T_a$) trong 45 giây, kéo dài ở 72°C trong 2 phút; giai đoạn kéo dài cuối cùng ở 72°C trong 10 phút.
• Điện di sản phẩm PCR: Sản phẩm khuếch đại được điện di trên gel agarose 1,5% trong đệm TAE 1X ở hiệu điện thế 100V trong 45 phút, sử dụng thang chuẩn DNA ladder 1 kb để định cỡ kích thước phân tử.

Xử lý và phân tích số liệu

Dữ liệu điện di được chuyển đổi thành ma trận nhị phân (binary matrix) trên phần mềm Excel, trong đó sự xuất hiện của băng DNA được mã hóa là "1" và sự vắng mặt của băng DNA được mã hóa là "0". Tỷ lệ băng đa hình ($P$) được tính bằng công thức:

$$P = \frac{n_{pj}}{n_t} \times 100%$$

(Trong đó $n_{pj}$ là số băng đa hình; $n_t$ là tổng số băng ghi nhận).

Hệ số tương đồng di truyền giữa hai mẫu ($S_{xy}$) được tính theo công thức hệ số tương đồng Dice:

$$S_{xy} = \frac{2 \times xy}{x + y}$$

(Trong đó $xy$ là số băng chung giữa hai mẫu; $x$ và $y$ lần lượt là tổng số băng của mẫu $x$ và mẫu $y$).

Khoảng cách di truyền ($D_{xy}$) được xác định qua công thức:

$$D_{xy} = 1 - S_{xy}$$

Sơ đồ phân nhánh di truyền (dendrogram) được thiết lập bằng phương pháp nhóm cặp không trọng số theo giá trị trung bình số học (UPGMA) thông qua thuật toán phân nhóm tuần tự không chồng chéo (SAHN) trên phần mềm thống kê NTSYSpc phiên bản 2.1.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Mở đầu (Introduction)

Chương 1 giới thiệu vị trí phân loại, giá trị kinh tế và dược liệu của cây tràm trà (Melaleuca alternifolia). Tác giả nêu rõ thực trạng khai thác nguồn tinh dầu tràm trà tại Việt Nam, đặc biệt là tại vùng đất phèn Mộc Hóa, Long An; đồng thời chỉ ra tính cấp thiết của việc áp dụng chỉ thị phân tử ISSR kết hợp phân tích hình thái để đánh giá chính xác quỹ gen tràm trà nhập nội, phục vụ trực tiếp cho công tác bảo tồn và chọn tạo giống.

Chương 2: Tổng quan tài liệu (Literature Review)

Chương 2 trình bày chi tiết các cơ sở lý luận và tài liệu nghiên cứu liên quan:

• Đặc điểm thực vật và sinh thái học: Tràm trà là cây bụi/gỗ nhỏ cao từ 2–7 m (có thể đạt 15 m), vỏ trắng nhiều lớp dạng xốp mỏng. Lá mọc so le, hình mác hẹp, chứa nhiều túi tinh dầu. Cây chịu được đất phèn, đất cát ven biển và đất ngập nước.
• Thành phần hóa học tinh dầu: Phân tích 3 nhóm chemotype của tràm trà theo hàm lượng Terpinen-4-ol và 1,8-Cineole, các ứng dụng kháng khuẩn, trị nấm và kháng viêm trong y dược.
• Tổng quan về các loại chỉ thị phân tử: So sánh ưu nhược điểm của các kỹ thuật phân tích DNA (RFLP, RAPD, SSR, AFLP, ISSR) và nguyên lý hoạt động của phần mềm xử lý dữ liệu NTSYSpc 2.1.
• Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước: Ghi nhận các nghiên cứu trước đây như nghiên cứu của Butcher và cs. (1992), Rossetto và cs. (2003) tại Úc về cấu trúc di truyền quần thể tràm trà bằng chỉ thị SSR, và nghiên cứu của Trần Thị Ngọc Trâm và cs. (2021) tại Thừa Thiên Huế đánh giá 49 mẫu tràm bằng chỉ thị RAPD với hệ số tương đồng di truyền cao (đạt 0,963). Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào công bố về việc ứng dụng chỉ thị ISSR trên đối tượng tràm trà M. alternifolia.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (Material and Method)

Chương này mô tả chi tiết danh mục 50 mẫu tràm trà thu thập tại Trung tâm Nghiên cứu Bảo tồn và Phát triển Dược liệu Đồng Tháp Mười (bảng mã mẫu từ TT01 đến TT50), danh sách 20 mồi ISSR khảo sát, hóa chất, thiết bị phòng thí nghiệm và quy trình thao tác chuẩn từ tách chiết DNA, kiểm tra nồng độ, thiết lập phản ứng PCR đến quy cách mã hóa dữ liệu nhị phân.

Thông số thí nghiệm	Chi tiết thông số
Dung dịch đệm ly trích	Tris 200 mM (pH = 8), EDTA 25 mM, NaCl 250 mM, SDS 0,5%
Dung dịch tách pha hữu cơ	PCI (25:24:1) và CI (24:1)
Thành phần phản ứng PCR	Tổng thể tích 12,5 µL: 6,5 µL Master Mix 2X, 1 µL DNA mẫu, nước cất
Chu trình nhiệt PCR	94°C (2 phút) → 40 chu kỳ [94°C (30s) - $T_a$ (45s) - 72°C (2 phút)] → 72°C (10 phút)
Nồng độ gel điện di	Gel agarose 1% (kiểm tra DNA tổng số), Gel agarose 1,5% (sản phẩm PCR-ISSR)

Chương 4: Kết quả và thảo luận (Results and Discussion)

Chương 4 cung cấp toàn bộ số liệu thực nghiệm và thảo luận kết quả:

• Đặc điểm hình thái lá: 50 mẫu tràm trà có kích thước chiều dài lá dao động từ 0,5 cm đến 2,8 cm; chiều rộng lá từ 0,1 cm đến 0,2 cm (1–2 mm); chiều cao cây từ 100 cm đến 290 cm; bán kính tán từ 30 cm đến 101 cm. Mẫu TT23 có kích thước lá lớn nhất (dài 1,2–2,8 cm, rộng 1,1–2,0 cm), trong khi mẫu TT28 có kích thước lá nhỏ nhất (dài 0,8 cm, rộng 0,1 cm). Nhìn chung, sai khác hình thái lá giữa các cá thể không đủ lớn để làm căn cứ phân loại tin cậy.
• Kết quả tách chiết DNA: 50 mẫu lá tràm trà đều thu được DNA tổng số nguyên vẹn, thể hiện qua các vệt băng sáng rõ trên gel điện di agarose 1%, đáp ứng tiêu chuẩn để thực hiện phản ứng PCR khuếch đại.
• Sàng lọc mồi ISSR: Trong số 20 mồi ISSR khảo sát ở dải nhiệt độ 50°C–55°C, tác giả đã chọn ra 12 mồi có khả năng nhân bản tốt, vạch băng rõ nét và cho tỷ lệ đa hình cao ở nhiệt độ bắt cặp tối ưu 54°C.
• Phân tích sản phẩm PCR-ISSR: 12 mồi ISSR khuếch đại tổng cộng 104 băng DNA, trong đó có 93 băng đa hình (chiếm tỷ lệ 88,6%) và 11 băng đồng hình (chiếm 11,4%). Kích thước các phân đoạn DNA khuếch đại dao động trong khoảng từ 400 bp đến 3000 bp.
  • Mồi UBC811 tạo ra nhiều băng nhất (12 băng) và đạt tỷ lệ đa hình 100% (kích thước 400–2900 bp).
  • Các mồi UBC814, UBC841, UBC856 cũng đạt tỷ lệ đa hình tuyệt đối 100%.
  • Mồi UBC873, UBC845 và UBC890 nhân bản số lượng băng ít nhất (7 băng mỗi mồi), với tỷ lệ đa hình dao động từ 71,4% đến 85,7%.
• Phân tích khoảng cách di truyền và phân nhóm:
  • Hệ số khoảng cách di truyền giữa các cặp mẫu dao động từ 0,19 đến 0,77 (trung bình là 0,44), tương ứng với hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,23 đến 0,81 (trung bình là 0,56).
  • Khoảng cách di truyền nhỏ nhất (0,19 - tương đồng 0,81) xuất hiện ở các cặp mẫu: TT04 - TT07, TT12 - TT14, TT13 - TT21, TT08 - TT18, TT26 - TT27, thể hiện quan hệ họ hàng rất gần gũi.
  • Khoảng cách di truyền lớn nhất (0,77 - tương đồng 0,23) ghi nhận giữa hai mẫu TT13 và TT37, thể hiện sự khác biệt di truyền lớn nhất trong tập hợp mẫu.
  • Cây phân loại di truyền UPGMA tại ngưỡng khoảng cách di truyền trung bình 0,44 chia 50 mẫu tràm trà thành 5 nhóm rõ rệt:
    • Nhóm I (38 mẫu): Gồm phần lớn các mẫu (TT01 đến TT05, TT07 đến TT19, TT21 đến TT30, TT41 đến TT50) với khoảng cách di truyền trung bình nội nhóm là 0,42 (tương đồng 0,58), cho thấy mức độ biến dị di truyền trong quần thể chính là tương đối thấp.
    • Nhóm II (1 mẫu): Gồm duy nhất mẫu TT20, đứng riêng biệt nhưng có vị trí di truyền gần với Nhóm I.
    • Nhóm III (7 mẫu): Gồm các mẫu TT06, TT33, TT34, TT36, TT38, TT39, TT40 với khoảng cách di truyền nội nhóm là 0,43 (tương đồng 0,66).
    • Nhóm IV (2 mẫu): Gồm các mẫu TT31 và TT32 với khoảng cách di truyền nội nhóm là 0,41.
    • Nhóm V (2 mẫu): Gồm các mẫu TT35 và TT37 với khoảng cách di truyền nội nhóm là 0,35 (tương đồng 0,65).

Chương 5: Kết luận và kiến nghị (Conclusion and Suggestions)

Tóm tắt các kết luận cốt lõi về hình thái lá và kết quả phân tích di truyền bằng chỉ thị phân tử ISSR; đồng thời đề xuất định hướng tiếp tục ứng dụng các hệ thống chỉ thị phân tử khác nhằm mở rộng hiểu biết về đa dạng sinh học của loài này tại Việt Nam.

---

Kết quả và đóng góp

Bảng tổng hợp kết quả khuếch đại của 12 mồi ISSR

Tên mồi	Trình tự mồi ($5' \rightarrow 3'$)	Tổng số băng	Số băng đa hình	Tỷ lệ đa hình (%)	Kích thước băng (bp)
UBC811	$(GA)_8C$	12	12	100,0%	400 – 2900
UBC848	$(CA)_8AGG$	10	9	90,0%	400 – 2500
UBC841	$(GA)_8CTC$	9	9	100,0%	500 – 2800
UBC850	$(GT)_8CTC$	9	8	88,8%	500 – 2800
UBC854	$(TC)_8AGG$	9	8	88,9%	450 – 2900
UBC856	$(AC)_8CTT$	9	9	100,0%	400 – 2600
UBC880	$(GGAGA)_3$	9	7	77,8%	500 – 2800
UBC814	$(CT)_8A$	8	8	100,0%	600 – 3000
UBC825	$(AG)_8T$	8	6	75,0%	500 – 2500
UBC845	$(CT)_8RG$	7	6	85,7%	700 – 2500
UBC873	$(GACA)_4$	7	5	71,4%	450 – 2000
UBC890	$ACGACTACG(GT)_6$	7	6	85,7%	400 – 2000
Tổng cộng	—	104	93	88,6%	400 – 3000

Đóng góp khoa học và thực tiễn

• Đây là công trình thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam đánh giá mức độ đa dạng di truyền của cây tràm trà (Melaleuca alternifolia) bằng chỉ thị phân tử ISSR.
• Chứng minh tính hiệu quả của bộ 12 mồi ISSR trong việc phân tích tính đa hình di truyền trên tràm trà với tỷ lệ băng đa hình đạt 88,6%.
• Xác định được mối quan hệ di truyền và mức độ tương đồng giữa 50 cá thể tràm trà tại Khu bảo tồn dược liệu Đồng Tháp Mười, chỉ ra rằng mức độ đa dạng di truyền tổng thể của tập đoàn mẫu này chưa cao (khoảng cách di truyền trung bình 0,44; đa số tập trung ở Nhóm I với 38/50 mẫu).
• Cung cấp dữ liệu nhận diện phân tử quan trọng giúp đơn vị bảo tồn và doanh nghiệp sản xuất tinh dầu định hướng việc tuyển chọn cá thể ưu việt, tránh hiện tượng thoái hóa giống do giao phối cận huyết khi nhân giống phục vụ sản xuất dược liệu.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

• Việc đánh giá hình thái chỉ tập trung chủ yếu vào các chỉ tiêu kích thước và màu sắc lá cây, chưa phân tích toàn diện các chỉ tiêu cơ quan sinh sản (hoa, quả, hạt) do thời điểm thu mẫu bị giới hạn.
• Nghiên cứu chỉ sử dụng một loại chỉ thị phân tử trội (ISSR), chưa kết hợp với các chỉ thị đồng trội như SSR hoặc giải trình tự gen để phân biệt chính xác cá thể đồng hợp tử và dị hợp tử.
• Số lượng mẫu nghiên cứu (50 mẫu) chỉ giới hạn trong phạm vi một khu bảo tồn tại huyện Mộc Hóa, tỉnh Long An, chưa so sánh đối chứng với các vùng trồng tràm trà khác tại miền Bắc hoặc quần thể bản địa tại Úc.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Ứng dụng thêm các hệ thống chỉ thị sinh học phân tử khác (chỉ thị SSR, phân tích trình tự vùng barcode DNA như rbcL, matK, ITS) để thu thập thông tin di truyền sâu hơn.
• Kết hợp đánh giá di truyền phân tử với phân tích hàm lượng và thành phần hóa thực vật của tinh dầu (tỷ lệ Terpinen-4-ol và 1,8-Cineole qua sắc ký khí GC-MS) trên từng cá thể nhằm thiết lập mối liên kết giữa kiểu gen và đặc tính dược liệu giá trị.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên cao học ngành Công nghệ Sinh học, Nông nghiệp, Lâm nghiệp và Dược liệu: Học hỏi quy trình thực nghiệm sinh học phân tử hoàn chỉnh từ bước lấy mẫu, ly trích DNA thực vật chứa nhiều tinh dầu/polyphenol, tối ưu hóa điều kiện PCR-ISSR đến phương pháp xử lý số liệu nhị phân bằng phần mềm NTSYSpc 2.1.
• Các nhà nghiên cứu và cán bộ bảo tồn nguồn gen: Cung cấp thông số kỹ thuật chi tiết của 12 cặp mồi ISSR (trình tự, nhiệt độ bắt cặp, dải kích thước sản phẩm khuếch đại) có thể áp dụng trực tiếp cho các loài khác thuộc chi Melaleuca hoặc họ Myrtaceae.
• Các đơn vị sản xuất và chế biến tinh dầu dược liệu: Cung cấp cơ sở khoa học để đánh giá độ đồng nhất di truyền của nguồn nguyên liệu tràm trà tại vùng Đồng Tháp Mười, hỗ trợ công tác quy hoạch vùng trồng và chọn lọc giống đạt chuẩn.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Chỉ thị phân tử ISSR có ưu điểm gì nổi bật so với các chỉ thị RAPD hay SSR trong nghiên cứu này?

Chỉ thị ISSR sử dụng các đoạn mồi đơn dài hơn (16–25 bp) so với mồi RAPD (10 bp) và có nhiệt độ gắn mồi cao hơn (45°C–65°C), giúp phản ứng PCR có tính ổn định và độ lặp lại cao hơn nhiều so với RAPD. Bên cạnh đó, ISSR khuếch đại nhiều locus đa hình mà không đòi hỏi phải biết trước toàn bộ trình tự nucleotide của hệ gen như chỉ thị SSR, giúp tiết kiệm chi phí và rút ngắn thời gian thực nghiệm.

2. Có bao nhiêu mồi ISSR được lựa chọn để phân tích trên toàn bộ 50 mẫu tràm trà và kết quả đa hình ra sao?

Tác giả đã sàng lọc từ 20 mồi ban đầu và chọn ra 12 mồi ISSR cho kết quả tốt nhất gồm: UBC811, UBC814, UBC825, UBC841, UBC845, UBC848, UBC850, UBC854, UBC856, UBC873, UBC880 và UBC890. Tổng số có 104 băng DNA được tạo ra, trong đó 93 băng là băng đa hình, chiếm tỷ lệ 88,6%. Bốn mồi đạt tỷ lệ đa hình 100% là UBC811, UBC814, UBC841 và UBC856.

3. Mối quan hệ di truyền giữa 50 mẫu tràm trà tại Khu bảo tồn Đồng Tháp Mười được thể hiện qua các chỉ số nào?

Mối quan hệ di truyền được thể hiện qua hệ số khoảng cách di truyền dao động từ 0,19 đến 0,77 (trung bình 0,44) và hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,23 đến 0,81 (trung bình 0,56). Cặp mẫu có khoảng cách di truyền nhỏ nhất (0,19 - họ hàng gần nhất) là TT04 - TT07, TT12 - TT14, TT13 - TT21. Cặp mẫu có khoảng cách di truyền lớn nhất (0,77 - khác biệt nhất) là TT13 - TT37.

4. Sơ đồ cây phân loại di truyền UPGMA đã phân chia 50 mẫu tràm trà thành mấy nhóm chính?

Tại ngưỡng khoảng cách di truyền trung bình 0,44, 50 mẫu tràm trà được phân thành 5 nhóm:

• Nhóm I: 38 mẫu (chiếm đa số, độ tương đồng cao).
• Nhóm II: 1 mẫu (TT20).
• Nhóm III: 7 mẫu (TT06, TT33, TT34, TT36, TT38, TT39, TT40).
• Nhóm IV: 2 mẫu (TT31, TT32).
• Nhóm V: 2 mẫu (TT35, TT37).

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Võ Lâm Hải Nam đã áp dụng thành công kỹ thuật chỉ thị phân tử ISSR để đánh giá mức độ đa dạng di truyền của 50 mẫu tràm trà (Melaleuca alternifolia) thu thập tại Khu bảo tồn Dược liệu Đồng Tháp Mười, tỉnh Long An. Thông qua 12 mồi ISSR chọn lọc, nghiên cứu đã khuếch đại 104 băng DNA với tỷ lệ đa hình đạt 88,6%, đồng thời xây dựng cây phân nhóm di truyền chia tập đoàn mẫu thành 5 nhóm ở khoảng cách di truyền trung bình 0,44. Kết quả cho thấy mức độ đa dạng di truyền giữa các cá thể tràm trà trong khu bảo tồn là không quá cao và có sự tương đồng di truyền lớn, cung cấp cơ sở khoa học quan trọng cho việc quản lý, nhân giống và bảo tồn nguồn gen tràm trà phục vụ công nghiệp dược liệu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY-HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES EVALUATION OF GENETIC DIVERSITY OF TEA TREE (Melaleuca alternifolia) COLLECTED FROM DONG THAP MUOI CENTER BASED ON ISSR (INTER SIMPLE SEQUENCE REPEATS) MARKER Majors : BIOTECHNOLOGY Student : VO LAM HAI NAM Student code : 19126251 Academic year : 2019 - 2023 Thu Duc City, 03/2024 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY-HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES GRADUATION THESIS EVALUATION OF GENETIC DIVERSITY OF TEA TREE (Melaleuca alternifolia) COLLECTED FROM DONG THAP MUOI CENTER BASED ON ISSR (INTER SIMPLE SEQUENCE REPEATS) MARKER Advisor Student Pham Duc Toan, Ph.D Vo Lam Hai Nam Thu Duc City, 03/2024 ACKNOWLEDGEMENT Fixed: The thesis was completed at Nong Lam University. Throughout the thesis completion process, I received invaluable assistance. First and foremost, I want to express my sincere gratitude to Mr. Pham Duc Toan for his guidance, knowledge, and experience during the thesis's creation.

I also extend my appreciation to the teachers of the Faculty of Science and Biotechnology at Nong Lam University, who shared valuable knowledge with me during my last academic term. Lastly, I want to thank my family and friends who consistently encouraged and supported me during the writing of this thesis. Additionally, I'd like to express my gratitude to the respondents who enthusiastically participated in answering the survey questions, contributing significantly to the completion of this graduate thesis. Once again, I sincerely thank you all! CONEIRMATION COMMITMENT My name is Vo Lam Hai Nam, Student ID: 19126251, Class: DH19SHC, Faculty of Biological Sciences, Nong Lam University.

I hereby affirm that this is my personally conducted Graduation Thesis. All data and information presented in the research are completely truthful and objective. I fully take responsibility before the Council for these commitments. Thu Duc City, February 2024 Student’s signature 1 ABSTRACT The tea tree (Melaleuca alternifolia), which has strong antibacterial therapeutic qualities is a valuable essential oil tree in Australia.

Subsequently, the tea tree was brought into Vietnam with the intention of using its medical qualities, particularly at the Dong Thap Muoi medicinal reserve located in Moc Hoa district, Long An province. In order to support acclimatization and conservation efforts, the study's objective was to assess the genetic diversity of 50 melaleuca samples that were gathered within the reserve using ISSR molecular biological markers. DNA was taken from leaf samples for this investigation, and 20 ISSR primers were used in PCR investigate any sample. Used all 50 tea tree samples, a PCR-ISSR reaction was performed using the 12 primers (UBC811, UBC814, UBC825, UBC841, UBC845, UBC848, UBC850, UBC854, UBC856, UBC873, UBC880, and UBC890) that were chosen for their high polymorphism rate following the reaction.

In order to create a genetic classification tree, the outcomes will be based on the DICE similarity coefficient and UPGMA clustering type using NTSYSpc 2. Out of the 104 bands that were generated, 93 (88. The tea tree samples have genetic distance coefficients ranging from 0.77 and genetic similarity coefficients from 0. A genetic distance coefficient of 0.44 was used to split the 50 tea tree samples into 5 groups based on the research results.

The results showed that the genetic diversity was not too high among the 50 tea tree samples used in the study. Keywords: Dong Thap Muoi medicinal revese, genetic diversity, ISSR primer, Melaleuca alternifolia, The tea tree 11 TÓM TẮT Cây tram trà (Melaleuca alternifolia), một loài cây cho tinh dau có giá trị kinh tế cao của nước Úc bởi tính chất được liệu kháng khuẩn tốt mà nó mang lại. Sau đó, cây được du nhập về Việt Nam nhằm khai thác tính chất được liệu này, đặc biệt là tại khu bảo tồn dược liệu Đồng Tháp Mười ở huyện Mộc Hóa, tỉnh Long An. Do đó, nghiên cứu được tiễn hành nhằm mục tiêu đánh giá sự đa dạng di truyền của 50 mẫu tràm trà được thu thập tại khu bảo tồn dựa trên chỉ thị sinh học phân tử ISSR để phục vụ cho công tác di thực và bảo tồn.

Trong nghiên cứu này, tiễn hành ly trích DNA từ mẫu lá và thực hiện phản ứng PCR khảo sát một mẫu bất kì với 20 primer ISSR. Sau phản ứng, chọn lọc được 12 primer (UBC811, UBC814, UBC825, UBC841, UBC845, UBC848, UBC850, UBC854, UBC856, UBC873, UBC880, UBC890) cho tỉ lệ đa hình cao và thực hiện tiếp phản ứng PCR — ISSR với tat cả 50 mau tram trà. Kết qua thu được dựa vào hệ số tương đồng DICE, kiểu phân nhóm UPGMA trên phần mềm NTSYSpe 2.1 dé dựng cây phân nhóm di truyền. Tổng cộng có 104 băng được tạo ra trong đó 93 băng đa hình chiếm tỷ lệ 88,6%.

Hệ số khoảng cách di truyền của các mẫu tram trà nằm trong khoảng từ 0,19 — 0,77 (hệ số tương đồng di truyền từ 0,23 — 0,81). Kết quả nghiên cứu đã chia 50 mẫu tràm trà thành 5 nhóm ở hệ số khoảng cách di truyền trung bình 0,44. Kết quả cho thấy sự đa đạng di truyền không quá cao giữa 50 mẫu tràm trà được sử dụng trong nghiên cứu. Từ khóa: Cây tràm trà, đa dạng di truyền, ISSR primer, khu bảo tồn dược liệu Đồng Tháp Mười, Melaleuca alternifolia.

1V TABLE OF CONTENTS Page ACKNOW LED GB iessesesencesaverassoseseramacemcscrmanneus 153440 0S44G833593iA5V054G5414428S0ISDANGĐSG4BEQESSESSSSESSSUGMGI i CONFIRMATION COMMITMENT siseccascoresvareneasnenneszexeannnearneremsnerernseenenneasserenuanecnaerrnncoenes il ABS'TRAGÌ, BiosssessoiintEGOEAGDEDLEBDERNEBIEIISNGS)SNIESIGRHPRSGEIAGGIUENGIHSSLIOIRIEKIESSSESRRSlRSSiaEESdlgifedipiossel 11 TOM0y v0 —. iv LIST OF ABBREVIATIONS 000. Vil LIST OF TABLES. vill LAST OP FIGURBSieeaieesenessseiiiosgaatsitsi230s605/38085810950 aut st ctr eee eset ea ix CHAPTER.

1, INTRODUCTION xe eeoeeng ta nannies amma 1 |Past Kore (0 (cl (0) 0 eee ee 1 I9) ó1. Introduction to Melaleuca: altermifol tas i.:ccsccssesssscnnacorvennanosssvnysinsuneecaeteententn tess teateneranebaretese 8 2.1 Origin and Distribution of Tea Tree cscs ssasescccusensersseursanauenannenrennnamataseamenain 3 212; BOHICAl TEAUITES ocscccssemsansnaemeunneneeeeneneueN ean a ERE ERRORS 4 2. ItröđdũUétiöñ/Tô 164 Tree €SSEHHBI Ol occcssscsensencenerservenmeseessmoeneemanervemaemmmnnnersenueveanenrenens 4 2. Analysis of genetic diversity based on molecular markers .1; THe Conceptiol geefle CIVELSILY scccccaowecssnesemmnsuctomneceeaneatiranettenieriysberteuncnasinees die HgE.

A few techniques for researching genetic (1V€TSIỀY. Morphological indicator-based approach .3: Molecular markers for feS@ateh icscsencansscecsseneuaacssnaaneaummmsmeanune nen emansmnaneaNe 6 2. Introducing the genetic classification tree building software NTSYSpe 2. Some domestic and international research on Melaleuca alternifol1a.du1+ Domestic researc lisssascmcresscemenrenes sername mea aT EEE EERE 12 2.2, International researeh ssssxszrrsses2sexsg11si014415S0316110113180039991413595533330459333458Đ89038 1590 meen 12 CHAPTER 3.

MATERIAL AND METHOID. Materials and Method. HH HH HE HH sen acini LRH H0 NHA adinctantaenserenen 13 SE, hcl] Gls eee ee eh ee Ce a eee 15 3. Evaluation of leaf morphological marker.

Sample extraction and DNA testing of Melaleuca alternifolia leaf. Product qualification by electrophoresis technique. PCR-ISSR reaction .ceeeceececcescesceseesceseeseeseeseeseeseeseseceeeeceeeeeesseeaeeeeseeseeeaeseeeeneeeee 17 BiceelBALE ci 112)LS) (eee eee 19 CHAPTER 4. RESULTS AND DISCUSTION .ccc:c:scsccsessssesteeseectecestassnessesesnesnesenectenses 20 Ads R@SUINS) spnyapxsI01Ri305XGG0SNDIBiQ iioriSipSGIENGHINGIARIIEGMRGIENERQQ SGEISGGRGINENỹRIGSGSSRSXNSRNUGIGNREAISNdDSSasa 20 4.

Results of total DNA extraction from tea tree leaves.3, Results of PCR-ISSR T634GLDDssssssssesssssitiaisoiiGi13045E633684G8488553854301551484BESLGESSES3SG8333584868 23 4. Measured primer temperatures for ISSR-PCR reaction. PCR product with ISSR: HIẢIGBOeeeeeeieenigi41150210011110145021011045010215T1L6T215EEEEESE SE 25 4. Genetic diversity analysis of 50 tea tree safnpÏes.

2s re 27 VyAb on. CONCLUSION AND SUGGESTIONS. 2c 2S Series 35 So, loyal! Vics (0): |e eee ee ee ee ees 35 5,2, SUSPESHONS seconsencseeennnemnnmenenenem mene eee aOR 35 REFERENCES csscsssessussseswecusaneenenen rene EA03831015005E28EL-ISGISLRSHOINSSHESEESS14SE34SESEESEEHSSAESSTSSSESESEEESBESSSENGE 36 44ND eee ee ee eT ee ee ee 39 VI LIST OF ABBREVIATIONS Bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism ISSR Inter Simple Sequence Repeat SSR Simple Sequence Repeat SDS Sodium dodecyl sulfat EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid PCI Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol Cl Chloroform/Isoamyl alcohol TAE Tris — Acetate -EDTA TE Tris - EDTA NTSYSpc Numerical Taxonomy System personal computer UPGMA Unweighted Pair -group Method with Arithmetic Mean SAHN Sequential agglomerative hierarchical non-overlapping Vii LIST OF TABLES Page Table 3. List of 50 tea tree samples collected at Dong Thap Muoi Medicinal Materials Conservation Center, Long An province used for research.(Continue) List of 50 tea tree samples collected at Dong Thap Muoi Medicinal Materials Conservation Center, Long An province used for research.

List of 20 primers for PCR reaction - ISSR. cece cece ceseeecesceeeeeeeeeeeeeeeseteeeeeeees 18 Table 3. Thermal cycling for POR TeaCtl OD wx. cxesvessessasenverenssaxsnexnsesansnace exeastenessiraoaviannesecerenses 18 Table 4.1 Records the leaf dimensions of 50 Melaleuca samples.(countine) Records the leaf dimensions of 50 Melaleuca samples.1(countine) Records the leaf dimensions of 50 Melaleuca samples.

12 primer ISSR were selected to preformed ISSR-PC. Summary of band numbers of 12 primers surVeyed. -- --- + s+sc+xs+scsesexss 25 Table 4. Genetic distance coefficient of 50 tea tree saimpÏes.(countine) Genetic distance coefficient of 50 tea tree samples.(countine) Genetic distance coefficient of 50 tea tree samples.(countine) Genetic distance coefficient of 50 tea tree samples.

------‹ 31 Vili LIST OF FIGURES Page Figure 21. THC t a từ ÊnseseesesesessetoniiEnsgtiSiESGSSE3.Đ073HI2ESSREG/2871800/G002080808 3 Figure 2. Diagram illustrating ISSR primer fVp€s. Representative tea tree leaf sarmpÏÌe.

Total DNA electrophoresis results of 50 tea tree samples. Electrophoresis results of PCR products of 1 DNA sample with 20 ISSR BEIGES: At S54 Gace ascecuresasssesemneresnsayse exseeraness quarsenarraseunemensasmaneseerserasnsmercneneeens 24 Figure 4. Electrophoresis results of PCR products of 50 tea tree samples with primer UB C811. cssssecsusscssseusesseseameanenscsnaats ste mason eitanea man naam emer mae 80005 00550 26 Figure 4.

Electrophoresis results of PCR products of 50 tea tree samples with primer IBC 8205 ongeiisxii6 0E G52000705.5:LS582158 TV8860067300XLXSR02Đ5HSSSS0WGGEAE2/2EL498320128E09Đ8I70007E080516:38980 27 Figure 4. Genetic clustering dendrogram drawn using UPGMA method.Introduction Tea Tree (Melaleuca alternifolia) is a species of tree in the Myrtaceae family, mainly grown to produce essential oil. Melaleuca alternifolia, an Australian native, prefers wet soil and lots of sunshine. At the moment, this plant is widely grown in numerous locations including Vietnam.

Melaleuca is a small woody plant 2 - 3 m tall and up to 15 m tall often grown on coastal sandy soil or alkaline soil in high terrain. Tea tree has many nutritional values and today is used in many different fields such as cosmetics and pharmaceuticals. Tea tree has two main active ingredients that play an important role in disinfecting: Eucalyptol accounting for 42-52% and a- Terpineol accounting for 5- 12%. While Eucalyptol has a pleasant fragrance and mild antiseptic properties that are often used by many cosmetic companies, a- Terpineol is used to produce antiseptic and antifungal products.

Because this tree species has highly valuable essences, it is exploited and imported to Vietnam research and discovery are still restricted due to the paucity of information on the genetic resources of Melaleuca trees in our nation. It's essential to comprehend how trees behave. However, it is sometimes exceedingly challenging to identify the links between Melaleuca varieties when just using phenotypic criteria to evaluate Melaleuca variations. In addition, Moc Hoa Tram 1s an expert in manufacturing products using essential oils that completely use the Dong Thap Muoi medicinal reserve region in Moc Hoa district, Long An province, where the alum soil terrain is well-suited for the benefits of tree cultivation.

There are numerous techniques available now to investigate plants genetic diversity. Here are resources for crop genetics, including Simple Sequence Repeat (SSR), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP), and Inter Simple Sequence Repeat (ISSR). These techniques are interconnected, and their analysis contributes to understanding genetic diversity. Additionally, morphological markers are used to assess genetic diversity, although they can be influenced by environmental factors, resulting in phenotypic variations.Objective Genetic analysis and phylogenetics of Melaleuca alternifolia individual based on ISSR molecular markers in order to migrate and conserve the Melaleuca alternifolia for medicinal purposes in Dong Thap Muoi Medicinal Conservation, Moc Hoa district, Long An province.Research contents Content 1: Evalution of growth and development of survey 50 Melaleuca alternifolia collected from Dong Thap Muoi Center for Reseacher Conservation and Development of Medicinal Plants.

Content 2: Using the ISSR marker to evaluate the genetic diversity of 50 Melaleuca alternifolia samples. Introduction to Melaleuca alternifolia 2.1 Origin and Distribution of Tea Tree Gender: Plantae Branch: Angiospermae Class: Eudicots Ordo: Myrtales Familia: Myrtaceae Genus: Melaleuca Figure 2.