Một Số Đặc Tính Sinh Học Của Virus TGEV Và PEDV Dùng Trong Sản Xuất Vacxin Nhược Độc

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng tgev transmissible gastroenteritis virus và pedv porcine, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất giải

• Tác giả: Nguyễn Thị Minh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Giáp
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Một số đặc tính sinh học của chủng TGEV (transmissible gastroenteritis virus) và PEDV (porcine epidemic diarrhea virus) dùng sản xuất vacxin nhược độc đa giá
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Lời cam đoan
• 1.2. Mục lục
• 1.3. Danh mục chữ viết tắt
• 1.4. Danh mục bảng
• 1.5. Danh mục hình
• 1.6. Trích yếu luận văn
• 1.7. Thesis abstract
• 2. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 3. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• 3.1. Mục tiêu chung
• 3.2. Mục tiêu cụ thể
• 4. Ý NGHĨA KHOA HỌC
• 5. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 5.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH TIÊU CHẢY DO VIRUS
• 5.1.1. Tình hình nghiên cứu về PEDV, TGEV tại Việt Nam
• 5.1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Virus TGEV và PEDV Thách Thức và Cơ Hội

Ngành chăn nuôi đóng góp lớn vào kinh tế nông nghiệp Việt Nam, với chăn nuôi lợn là chủ đạo. Bệnh tiêu chảy do virus TGEV và PEDV gây ra là một thách thức lớn, ảnh hưởng đến năng suất và gây thiệt hại kinh tế. Hiện nay, các loại vacxin nhược độc đang được quan tâm nghiên cứu và sử dụng. Tuy nhiên, hiệu quả bảo hộ của các vacxin thương mại có thể bị hạn chế do sự khác biệt về di truyền giữa các chủng virus. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển vacxin nhược độc từ các chủng virus phân lập tại Việt Nam là rất cần thiết. Đề tài này tập trung vào việc đánh giá các đặc tính sinh học của virus TGEV và PEDV để phục vụ cho sản xuất vacxin hiệu quả hơn.

1.1. Tầm quan trọng của việc kiểm soát bệnh TGEV và PEDV

Kiểm soát bệnh TGEV và PEDV là yếu tố then chốt để đảm bảo sức khỏe đàn lợn và ổn định kinh tế nông nghiệp. Theo số liệu thống kê năm 2018, Việt Nam có trên 28 triệu con lợn, và mỗi nái trung bình đẻ 10 con/lứa. Để tiêm phòng đủ tổng đàn, cần một lượng lớn vacxin. Việc sử dụng vacxin hiệu quả giúp giảm thiểu thiệt hại do dịch bệnh, tăng năng suất chăn nuôi và cải thiện đời sống người nông dân.

1.2. Giới thiệu về vacxin nhược độc trong phòng bệnh TGEV và PEDV

Vacxin nhược độc là một giải pháp tiềm năng để phòng bệnh TGEV và PEDV. Loại vacxin này sử dụng các chủng virus đã được làm suy yếu, giúp kích thích hệ miễn dịch của lợn mà không gây ra bệnh. Tuy nhiên, việc lựa chọn và đánh giá các chủng virus phù hợp để sản xuất vacxin là rất quan trọng. Các đặc tính sinh học của virus, như độc lực virus, khả năng gây bệnh và tính ổn định di truyền, cần được nghiên cứu kỹ lưỡng.

II. Thách Thức Trong Sản Xuất Vacxin Nhược Độc cho TGEV PEDV

Việc sản xuất vacxin nhược độc hiệu quả cho TGEV và PEDV đối mặt với nhiều thách thức. Sự biến đổi di truyền nhanh chóng của virus có thể làm giảm hiệu quả bảo hộ của vacxin. Các chủng virus phân lập tại Việt Nam có thể khác biệt so với các chủng được sử dụng trong vacxin thương mại, dẫn đến khả năng bảo hộ chéo hạn chế. Ngoài ra, việc đảm bảo tính an toàn và hiệu quả của vacxin là rất quan trọng. Cần có các nghiên cứu kỹ lưỡng để đánh giá độc lực virus, khả năng gây bệnh và tính ổn định di truyền của các chủng virus được sử dụng.

2.1. Sự biến đổi di truyền của virus TGEV và PEDV

Virus TGEV và PEDV có khả năng biến đổi di truyền nhanh chóng, tạo ra các biến chủng mới. Điều này gây khó khăn cho việc phát triển vacxin có khả năng bảo hộ rộng rãi. Các nghiên cứu cần tập trung vào việc xác định các vùng gen ổn định của virus để phát triển vacxin có khả năng bảo hộ lâu dài.

2.2. Khả năng bảo hộ chéo của vacxin hiện tại

Các vacxin thương mại hiện tại có thể không bảo hộ hiệu quả chống lại các chủng virus phân lập tại Việt Nam. Điều này là do sự khác biệt về di truyền giữa các chủng virus. Việc phát triển vacxin từ các chủng virus địa phương có thể cải thiện khả năng bảo hộ chéo và giảm thiểu thiệt hại do dịch bệnh.

2.3. Yêu cầu về an toàn và hiệu quả của vacxin nhược độc

Vacxin nhược độc cần phải an toàn và hiệu quả. Vacxin không được gây ra bệnh cho lợn và phải kích thích hệ miễn dịch đủ mạnh để bảo vệ chống lại sự nhiễm trùng. Các thử nghiệm lâm sàng cần được thực hiện để đánh giá tính an toàn và hiệu quả của vacxin trước khi đưa vào sử dụng rộng rãi.

III. Phương Pháp Đánh Giá Đặc Tính Sinh Học Của TGEV và PEDV

Để sản xuất vacxin nhược độc hiệu quả, cần có các phương pháp đánh giá đặc tính sinh học của TGEV và PEDV. Các phương pháp này bao gồm xác định hiệu giá virus, đánh giá tính nhược độc hóa, và đánh giá tính ổn định di truyền. Hiệu giá virus cho biết số lượng virus có khả năng lây nhiễm trong một mẫu. Tính nhược độc hóa cho biết khả năng gây bệnh của virus đã được làm suy yếu. Tính ổn định di truyền cho biết khả năng virus duy trì các đặc tính sinh học của nó qua nhiều thế hệ.

3.1. Xác định hiệu giá virus bằng phương pháp pha loãng tới hạn

Phương pháp pha loãng tới hạn là một phương pháp phổ biến để xác định hiệu giá virus. Phương pháp này dựa trên việc pha loãng mẫu virus và xác định nồng độ pha loãng cuối cùng có khả năng gây nhiễm trùng tế bào. Hiệu giá virus được biểu thị bằng TCID50 (50% Tissue Culture Infective Dose), là nồng độ virus có khả năng gây nhiễm trùng 50% số tế bào được sử dụng.

3.2. Đánh giá tính nhược độc hóa bằng phương pháp gây bệnh thực nghiệm

Phương pháp gây bệnh thực nghiệm được sử dụng để đánh giá tính nhược độc hóa của virus. Lợn được gây nhiễm với virus đã được làm suy yếu và theo dõi các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích. Nếu virus không gây ra bệnh hoặc chỉ gây ra các triệu chứng nhẹ, thì virus được coi là nhược độc.

3.3. Đánh giá tính ổn định di truyền bằng phương pháp Realtime RT PCR

Phương pháp Realtime RT-PCR được sử dụng để đánh giá tính ổn định di truyền của virus. Phương pháp này cho phép định lượng số lượng virus trong mẫu và xác định các biến đổi di truyền trong bộ gen của virus. Nếu virus duy trì các đặc tính sinh học của nó qua nhiều thế hệ, thì virus được coi là ổn định di truyền.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Của Chủng TGEV và PEDV

Nghiên cứu đã đánh giá đặc tính sinh học của chủng virus TGEV AVAC/VR/TGE.15 (P130) và virus PEDV AVAC/VR/PED.98 (P100). Kết quả cho thấy cả hai chủng virus đều có hiệu giá ổn định và tính nhược độc hóa. Lợn được gây nhiễm với các chủng virus này không có triệu chứng lâm sàng nghiêm trọng và không có bệnh tích đáng kể. Ngoài ra, các chủng virus này cũng ổn định di truyền qua nhiều thế hệ.

4.1. Tính ổn định hiệu giá của chủng giống PEDV và TGEV

Chủng giống virus PEDV AVAC/VR/PED.98 (P100) và virus TGEV AVAC/VR/TGE.15 (P130) có hiệu giá ổn định trong khoảng 7.5 log10 TCID50/ml (PEDV) và 8.7 log10 TCID50/ml (TGEV). Điều này cho thấy các chủng virus này có thể được sử dụng để sản xuất vacxin với hiệu quả ổn định.

4.2. Đặc điểm nhược độc hóa của chủng virus PEDV và TGEV

Các chủng virus PEDV AVAC/VR/PED.98 (P100) và virus TGEV AVAC/VR/TGE.15 (P130) được xác nhận là nhược độc thông qua thử nghiệm gây bệnh. Lợn được gây nhiễm với các chủng virus này không có triệu chứng lâm sàng nghiêm trọng và không có bệnh tích đáng kể. Điều này cho thấy các chủng virus này an toàn để sử dụng trong vacxin.

4.3. Đặc điểm ổn định di truyền của chủng giống PEDV và TGEV

Các chủng virus PEDV AVAC/VR/PED.98 và virus TGEV AVAC/VR/TGE.15 có tính ổn định trình tự gen quyết định kháng nguyên chính trong vòng 20 lần tiếp đời. Điều này cho thấy các chủng virus này có thể được sử dụng để sản xuất vacxin với hiệu quả lâu dài.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Sản Xuất Vacxin Nhược Độc Phòng TGEV PEDV

Kết quả nghiên cứu này cung cấp cơ sở khoa học cho việc sử dụng hai chủng giống TGEV và PEDV để sản xuất vacxin nhược độc nhị giá. Vacxin này có thể giúp phòng ngừa cả hai bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm và tiêu chảy cấp ở lợn, giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi. Việc sử dụng các chủng virus địa phương có thể cải thiện khả năng bảo hộ chéo và tăng cường hiệu quả của vacxin.

5.1. Tiềm năng sản xuất vacxin nhược độc nhị giá từ TGEV và PEDV

Việc sử dụng hai chủng giống TGEV và PEDV để sản xuất vacxin nhược độc nhị giá có tiềm năng lớn trong việc phòng ngừa cả hai bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm và tiêu chảy cấp ở lợn. Vacxin này có thể giúp giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi và cải thiện sức khỏe đàn lợn.

5.2. Lợi ích của việc sử dụng chủng virus địa phương trong vacxin

Việc sử dụng các chủng virus địa phương trong vacxin có thể cải thiện khả năng bảo hộ chéo và tăng cường hiệu quả của vacxin. Các chủng virus địa phương có thể tương đồng về di truyền với các chủng virus đang lưu hành trong khu vực, giúp vacxin có khả năng bảo vệ tốt hơn.

VI. Kết Luận và Hướng Phát Triển Vacxin TGEV PEDV Tương Lai

Nghiên cứu này đã đánh giá thành công đặc tính sinh học của hai chủng giống TGEV và PEDV, mở ra triển vọng cho việc sản xuất vacxin nhược độc hiệu quả. Trong tương lai, cần có thêm các nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình sản xuất vacxin, đánh giá hiệu quả bảo hộ của vacxin trong điều kiện thực địa, và theo dõi sự biến đổi di truyền của virus để đảm bảo vacxin luôn có hiệu quả.

6.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu và ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu đã đánh giá thành công đặc tính sinh học của hai chủng giống TGEV và PEDV, cung cấp cơ sở khoa học cho việc sản xuất vacxin nhược độc nhị giá. Kết quả nghiên cứu này có ý nghĩa khoa học quan trọng trong việc phát triển các giải pháp phòng ngừa bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm và tiêu chảy cấp ở lợn.

6.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo để cải thiện vacxin TGEV PEDV

Trong tương lai, cần có thêm các nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình sản xuất vacxin, đánh giá hiệu quả bảo hộ của vacxin trong điều kiện thực địa, và theo dõi sự biến đổi di truyền của virus để đảm bảo vacxin luôn có hiệu quả. Các nghiên cứu về miễn dịch học cũng cần được đẩy mạnh để hiểu rõ hơn về cơ chế bảo vệ của vacxin.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ngành chăn nuôi đóng vai trò then chốt trong nền nông nghiệp Việt Nam khi đóng góp khoảng 25% vào tổng thu nhập quốc nội của toàn ngành, trong đó chăn nuôi lợn chiếm vị trí chủ đạo với hơn 78% tổng sản lượng thịt. Theo số liệu thống kê năm 2018, tổng đàn lợn cả nước đạt quy mô trên 28 triệu con với nhu cầu tiêm phòng dịch bệnh hàng năm lên tới hàng chục triệu liều vacxin. Tuy nhiên, hai hội chứng truyền nhiễm nguy hiểm gồm tiêu chảy cấp ở lợn do virus Porcine Epidemic Diarrhea Virus và viêm dạ dày ruột truyền nhiễm do virus Transmissible Gastroenteritis Virus liên tục gây ra các đợt dịch nghiêm trọng. Tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong ở lợn con theo mẹ dưới 7 ngày tuổi trong thực tế thường dao động từ 80% đến 100%, gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho các trang trại.

Hầu hết các chế phẩm vacxin thương mại nhập khẩu hiện nay đều có nguồn gốc từ các chủng virus cổ điển như CV777 hoặc DR13. Sự sai khác di truyền trên 10% ở chuỗi amino acid của glycoprotein bề mặt giữa chủng vacxin ngoại nhập và các chủng thực địa lưu hành tại Việt Nam khiến hiệu lực bảo hộ chéo chỉ đạt mức thấp hoặc trung bình. Xuất phát từ yêu cầu cấp thiết của thực tiễn chăn nuôi, đề tài nghiên cứu đã được triển khai với mục tiêu đánh giá toàn diện các đặc tính sinh học chủ chốt gồm: độ ổn định hiệu giá virus, tính nhược độc an toàn trên cơ thể vật chủ và độ ổn định di truyền của hai chủng virus thuần Việt AVAC/VR/PED.98 và AVAC/VR/TGE.15.

Nghiên cứu được thực hiện liên tục trong khoảng thời gian từ tháng 10 năm 2018 đến tháng 09 năm 2019 tại Công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam phối hợp cùng Phòng thí nghiệm Vi sinh vật - Truyền nhiễm thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Kết quả nghiên cứu mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc, thiết lập bộ dữ liệu chuẩn mực để sản xuất thành công dòng vacxin nhược độc nhị giá thế hệ mới, đáp ứng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nghiêm ngặt và giúp các trang trại giảm thiểu trên 90% nguy cơ thiệt hại do hai mầm bệnh đường ruột nguy hiểm này gây ra.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên hai nền tảng lý thuyết sinh học kinh điển: thuyết miễn dịch niêm mạc qua sữa mẹ và thuyết biến dị di truyền của nhóm Coronavirus. Về mặt miễn dịch học, lợn sơ sinh không nhận được kháng thể qua nhau thai mà phụ thuộc hoàn toàn vào nguồn globulin miễn dịch từ sữa đầu. Trong sữa đầu của lợn nái, hàm lượng kháng thể IgG chiếm trên 60% tổng lượng kháng thể và được hấp thu qua ruột non trong 24 đến 48 giờ đầu. Sau đó, kháng thể IgA trở thành dạng miễn dịch chiếm ưu thế trong sữa thường, bám dính trên bề mặt niêm mạc lông nhung ruột non để trung hòa trực tiếp virus xâm nhập qua đường tiêu hóa.

Về mặt vi sinh vật học phân tử, cả hai tác nhân PEDV và TGEV đều thuộc giống Alphacoronavirus trong họ Coronaviridae, sở hữu bộ gen RNA đơn dương kích thước lớn từ 28 đến 30 kb. Mô hình nghiên cứu tập trung vào 4 khái niệm then chốt:

1. Glycoprotein gai bề mặt (Protein S) với kích thước 1.383 amino acid ở PEDV và 1.447 đến 1.449 amino acid ở TGEV, đóng vai trò nhận diện thụ thể aminopeptidase N và chứa các epitope kích thích sinh kháng thể trung hòa chính.
2. Hiệu giá gây nhiễm nuôi cấy mô 50% (TCID50) xác định khả năng nhân lên của virus.
3. Bệnh tích tế bào đặc hiệu (CPE) trên các dòng tế bào mẫn cảm in vitro.
4. Tỷ lệ biểu hiện gen tương đối qua phương pháp 2^-ΔΔCT.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng cỡ mẫu gồm toàn bộ đàn lợn sơ sinh chưa bú sữa đầu, được chọn lọc nghiêm ngặt và kiểm tra âm tính 100% với PEDV và TGEV bằng kỹ thuật RT-PCR. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích kết hợp phân lô đối chứng ngẫu nhiên được áp dụng để loại bỏ triệt để các yếu tố gây nhiễu từ kháng thể mẹ truyền. Lợn sơ sinh được gây nhiễm thực nghiệm với liều virus chuẩn của lọ vacxin là 10^5,0 TCID50/ml nhằm đánh giá độc lực ở giai đoạn vật chủ mẫn cảm nhất. Dịch ngoáy hậu môn được thu thập định kỳ 12 giờ một lần trong suốt 72 giờ để theo dõi động thái bài thải mầm bệnh. Toàn bộ các đoạn ống tiêu hóa (tá tràng, không tràng, hồi tràng, manh tràng, kết tràng và trực tràng) được mổ khám thu thập trọn vẹn tại thời điểm 72 giờ sau gây nhiễm.

Phương pháp realtime RT-PCR định lượng tương đối (2^-ΔΔCT) được lựa chọn nhờ độ nhạy vượt trội và khả năng so sánh chính xác mức độ nhân lên của virus giữa các mô bào mà không đòi hỏi xây dựng đường chuẩn tuyệt đối phức tạp. Trình tự gen S hoàn chỉnh được khuếch đại thông qua 5 phân đoạn gối đầu nhau khoảng 500 nucleotide bằng các cặp mồi đặc hiệu, sau đó giải trình tự trực tiếp và phân tích bằng các công cụ tin sinh học chuyên dụng BioEdit 7.1 và MEGA 7.26 theo thuật toán Neighbor-Joining. Toàn bộ quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa trong suốt 12 tháng tại hệ thống phòng thí nghiệm đạt chuẩn an toàn sinh học.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình phân tích thực nghiệm đã xác định 4 phát hiện quan trọng về đặc tính sinh học của hai chủng virus giống:

Thứ nhất, tính ổn định hiệu giá và đặc tính bệnh tích tế bào: Chủng AVAC/VR/PED.98 duy trì hiệu giá nhân lên ổn định từ 7,1 đến 7,5 log10 TCID50/ml trên thảm tế bào Vero, tạo thể hợp bào đa nhân điển hình xuất hiện sớm sau 12 đến 24 giờ gây nhiễm. Trong khi đó, chủng AVAC/VR/TGE.15 đạt hiệu giá cao từ 8,5 đến 8,7 log10 TCID50/ml trên tế bào ST, hình thành các đám tế bào co tròn và bong tróc đặc trưng sau 40 đến 64 giờ. Mức độ biến thiên hiệu giá giữa các lần tiếp đời độc lập luôn duy trì dưới 0,4 log10 TCID50/ml, nhỏ hơn nhiều so với ngưỡng quy chuẩn cho phép là 1,0 log10 TCID50/ml.

Thứ hai, tính nhược độc an toàn tuyệt đối trên vật chủ: 100% lợn sơ sinh gây nhiễm chủng nhược độc ở liều 10^5,0 TCID50/ml hoàn toàn khỏe mạnh, không có biểu hiện nôn mửa hay tiêu chảy, vùng hậu môn và giấy lót chuồng khô ráo 100%. Ngược lại, lô lợn gây nhiễm chủng cường độc biểu hiện tiêu chảy dữ dội 100%, phân lỏng màu vàng xám làm ướt sũng chuồng nuôi chỉ sau 24 giờ.

Thứ ba, sự bài thải và tổn thương mô ruột được kiểm soát triệt để: Hàm lượng virus nhược độc bài thải qua phân giảm từ 85% đến 95% so với chủng cường độc khi đo lường qua chu kỳ nhiệt Ct. Kiểm tra mô bệnh học sau 72 giờ cho thấy lợn tiêm chủng nhược độc bảo tồn hoàn toàn cấu trúc vi nhung mao với tỷ lệ chiều cao lông nhung trên độ sâu lớp tuyến ruột đạt mức sinh lý bình thường 7:1, trong khi nhóm cường độc bị teo nhung mao nghiêm trọng với tỷ lệ sụt giảm xuống mức 1:1.

Thứ tư, độ ổn định di truyền qua 20 lần cấy truyền liên tiếp: Phân tích trình tự gen S từ đời cấy chuyển P100 đến P150 của PEDV và từ P130 đến P150 của TGEV cho thấy độ tương đồng nucleotide và amino acid đạt trên 99,8%, không ghi nhận bất kỳ đột biến nào tại các epitope trung hòa quyết định kháng nguyên.

Thảo luận kết quả

Sự suy giảm độc lực rõ rệt của hai chủng virus bắt nguồn từ quá trình thích nghi nuôi cấy tế bào liên tục qua 100 đời đối với PEDV và 130 đời đối với TGEV. Quá trình cấy truyền kéo dài đã làm suy yếu khả năng phá hủy tế bào nhung mao ruột của virus ngoài thực địa nhưng vẫn duy trì hoàn hảo khả năng nhân lên in vitro ở hiệu giá cao. Khi so sánh với các nghiên cứu quốc tế về chủng vacxin CV777 (châu Âu) hay P-5V (Nhật Bản), chủng giống AVAC/VR/PED.98 và AVAC/VR/TGE.15 thể hiện mức độ tương đồng di truyền rất cao với các phân lập thực địa tại các vùng chăn nuôi trọng điểm của Việt Nam, khắc phục hoàn toàn nhược điểm kém bảo hộ chéo của các vacxin ngoại nhập.

Dữ liệu thực nghiệm của nghiên cứu có thể được tổng hợp trực quan qua đồ thị đường biểu diễn sự ổn định hiệu giá qua các thế hệ cấy truyền từ P100 đến P150, kết hợp biểu đồ cột nhóm thể hiện sự chênh lệch bài thải virus định lượng (2^-ΔΔCT) và bảng so sánh cấu trúc vi thể ruột non (tỷ lệ 7:1 ở nhóm nhược độc so với 1:1 ở nhóm cường độc). Những kết quả này chứng minh hai chủng virus đáp ứng đầy đủ các tiêu chí khắt khe nhất để làm giống gốc phục vụ sản xuất công nghiệp vacxin đa giá nhược độc.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm chuyển hóa các kết quả nghiên cứu khoa học vào thực tiễn sản xuất và phòng chống dịch bệnh, bốn giải pháp chiến lược được đề xuất:

Thứ nhất, chuẩn hóa quy trình công nghệ nhân giống quy mô công nghiệp: Đề nghị Công ty Cổ phần AVAC Việt Nam chủ trì nâng cấp hệ thống bioreactor nuôi cấy tế bào Vero và tế bào ST, kiểm soát chính xác nhiệt độ nuôi cấy 37°C và nồng độ 5% CO2, bảo đảm duy trì hiệu giá thu hoạch vacxin đạt ngưỡng tối thiểu 10^7,0 TCID50/ml cho mỗi mẻ sản xuất trong thời gian 6 tháng tới.

Thứ hai, triển khai khảo nghiệm lâm sàng diện rộng trên đàn nái sinh sản: Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm phối hợp cùng các doanh nghiệp chăn nuôi xây dựng phác đồ tiêm phòng thử nghiệm 2 liều vào tuần mang thai thứ 12 và 14, đo lường chuẩn độ kháng thể IgA trong sữa non nhằm nâng tỷ lệ bảo hộ sống sót của đàn lợn con lên trên 95% trong chu kỳ 2020 - 2021.

Thứ ba, thiết lập mạng lưới giám sát dịch tễ học phân tử định kỳ: Cục Thú y phối hợp với các viện nghiên cứu thực hiện giải trình tự định kỳ gen S của các chủng virus lưu hành tại các tỉnh có mật độ chăn nuôi cao 6 tháng một lần, kịp thời phát hiện các biến chủng mới để cập nhật chủng giống sản xuất trước năm 2023.

Thứ tư, hoàn thiện hồ sơ đăng ký lưu hành và bảo hộ sở hữu trí tuệ: Ban chủ nhiệm đề tài nhanh chóng xây dựng tiêu chuẩn cơ sở, hoàn tất thủ tục đăng ký kiểm nghiệm quốc gia theo quy định của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn trong thời hạn 12 tháng để đưa sản phẩm vacxin thương mại ra thị trường.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và dữ liệu thực nghiệm của luận văn mang lại giá trị ứng dụng thiết thực cho 4 nhóm đối tượng:

1. Các nhà sản xuất dược phẩm và sinh phẩm thú y: Tiếp cận quy trình chi tiết về việc tuyển chọn, đánh giá tính nhược độc và kiểm soát độ ổn định di truyền của chủng virus gốc qua hơn 20 lần tiếp đời, phục vụ trực tiếp công tác nâng cao năng suất và chất lượng các lô vacxin nhị giá thương mại.

2. Giảng viên và nghiên cứu viên chuyên ngành Vi sinh vật - Thú y: Khai thác bộ tư liệu chuẩn mực về hệ thống 5 cặp mồi khuếch đại gen S, kỹ thuật realtime RT-PCR định lượng tương đối (2^-ΔΔCT) và phương pháp đánh giá bệnh tích vi thể trên đường tiêu hóa của lợn phục vụ giảng dạy và thực hiện các đề tài chuyên sâu.

3. Bác sĩ thú y và kỹ sư quản lý trang trại chăn nuôi lợn: Nắm bắt cơ chế miễn dịch niêm mạc truyền qua sữa mẹ, sự khác biệt sinh học giữa các chủng virus thực địa và chủng vacxin, từ đó xây dựng lịch tiêm phòng khoa học cho đàn nái nhằm giảm thiểu trên 80% tỷ lệ chết ở lợn sơ sinh.

4. Học viên cao học và sinh viên ngành Chăn nuôi - Thú y và Công nghệ Sinh học: Tham khảo mô hình thiết kế nghiên cứu thực nghiệm chặt chẽ, phương pháp phân tích tin sinh học phân tử bằng phần mềm BioEdit và MEGA, cũng như cách thức trình bày luận văn học thuật chuẩn mực theo khung đào tạo thạc sĩ.

Câu hỏi thường gặp

Vì sao nghiên cứu bắt buộc phải sử dụng lợn sơ sinh chưa bú sữa đầu để đánh giá tính nhược độc của virus?

Lợn sơ sinh chưa bú sữa mẹ hoàn toàn không có kháng thể thụ động từ mẹ truyền sang, đại diện cho trạng thái cơ thể mẫn cảm cao nhất đối với các chủng Coronavirus. Thử nghiệm gây nhiễm với liều 10^5,0 TCID50/ml trên nhóm lợn này giúp khẳng định chủng virus vacxin đã nhược độc hóa an toàn tuyệt đối mà không bị che mờ bởi miễn dịch từ sữa mẹ.

Đặc điểm bệnh tích tế bào khác nhau như thế nào giữa PEDV và TGEV khi nuôi cấy in vitro?

Trên thảm tế bào Vero, chủng PEDV hình thành bệnh tích đặc trưng là các thể hợp bào khổng lồ gồm hàng trăm nhân co cụm lại với nhau sau 12 đến 24 giờ gây nhiễm. Ngược lại, TGEV khi nhân lên trên tế bào ST không tạo thể hợp bào mà làm các tế bào co tròn, thoái hóa hạt và bong tróc thành đám sau 40 đến 64 giờ.

Nguyên nhân chính khiến các dòng vacxin PEDV nhập khẩu trước đây đạt hiệu quả bảo hộ không cao tại Việt Nam là gì?

Hầu hết các vacxin ngoại nhập sử dụng các chủng cổ điển thuộc phân nhóm G1 như CV777 hay DR13. Các phân tích di truyền cho thấy các chủng thực địa lưu hành tại Việt Nam có sự sai khác trên 10% amino acid ở protein S và thuộc phân nhóm G2, dẫn đến khả năng bảo hộ chéo giữa vacxin nhập khẩu và chủng thực địa bị suy giảm nghiêm trọng.

Phương pháp giải trình tự gen S trong nghiên cứu được thiết kế như thế nào để đảm bảo tính chính xác?

Nghiên cứu đã thiết kế hệ thống mồi đặc hiệu để nhân bản 5 phân đoạn PCR gối đầu nhau khoảng 500 nucleotide dọc theo toàn bộ gen S. Quy trình này giúp loại bỏ hoàn toàn các sai số tại vùng tiếp giáp phân đoạn, bảo đảm kết quả giải mã trình tự đạt độ chính xác 100% khi phân tích trên các phần mềm BioEdit 7.1 và MEGA 7.26.

Việc chứng minh chủng virus ổn định di truyền qua 20 lần cấy truyền liên tiếp có ý nghĩa gì trong sản xuất công nghiệp?

Trong quy trình sản xuất sinh phẩm quy mô lớn, giống virus phải trải qua nhiều cấp nhân giống từ giống gốc đến giống sản xuất. Việc chứng minh gen S giữ nguyên tính ổn định qua 20 đời cấy truyền (tương đương từ P100 đến P150) đảm bảo virus không bị đột biến hồi độc hoặc thay đổi tính kháng nguyên, giữ cho chất lượng giữa các lô sản phẩm luôn đồng nhất.

Kết luận

• Đề tài đã đánh giá thành công đặc tính sinh học của hai chủng virus AVAC/VR/PED.98 (P100) và AVAC/VR/TGE.15 (P130) với hiệu giá ổn định cao đạt lần lượt 7,5 và 8,7 log10 TCID50/ml.
• Chứng minh tính nhược độc an toàn tuyệt đối trên 100% lợn sơ sinh mẫn cảm, không gây tiêu chảy và bảo vệ nguyên vẹn cấu trúc nhung mao ruột non với tỷ lệ 7:1.
• Khẳng định độ ổn định di truyền vượt trội của gen S qua 20 lần tiếp đời liên tiếp, bảo tồn toàn bộ các epitope trung hòa kháng nguyên quan trọng.
• Chuẩn hóa thành công quy trình realtime RT-PCR định lượng tương đối (2^-ΔΔCT) và phương pháp khuếch đại gen S qua 5 phân đoạn gối đầu.
• Xác lập nền tảng khoa học vững chắc để sản xuất dòng vacxin nhược độc đa giá phòng hội chứng tiêu chảy cấp và viêm dạ dày ruột truyền nhiễm tại Việt Nam.

Đóng góp lớn nhất của luận văn là cung cấp nguồn giống virus chuẩn hóa cùng luận cứ thực nghiệm xác thực để doanh nghiệp làm chủ công nghệ sản xuất vacxin nhị giá nội địa. Nhóm nghiên cứu dự kiến hoàn tất hồ sơ kiểm nghiệm cấp quốc gia trong quý I và tiến hành thử nghiệm đàn lớn trong vòng 12 tháng tới. Các đơn vị nghiên cứu, cơ sở sản xuất và chủ trang trại chăn nuôi hãy tích cực thúc đẩy liên kết chuyển giao công nghệ để sớm đưa chế phẩm vacxin vào thực tế, bảo vệ an toàn cho đàn lợn và gia tăng hiệu quả kinh tế cho ngành chăn nuôi Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Ngành chăn nuôi hiện chiếm 25% trong đóng góp của ngành nông nghiệp vào tổng thu nhập quốc nội. Đây cũng là ngành giữ vai trò then chốt trong cơ cấu ngành nông nghiệp, trong số các hoạt động chăn nuôi, chăn nuôi lợn là hoạt động chủ đạo, đóng góp 78% tổng sản lượng chăn nuôi. Theo số liệu của tổng cục thống kê năm 2018, nước ta có trên 28 triệu con lợn , trong khi đó mỗi ná i trung bình đẻ 10 con/lứa. Như vâ ̣y để tiêm phòng đủ tổng đàn với liệu trình 2 liều/ con/lứa đẻ, thì chúng ta cần tới vài triệu liều vacxin phòng bệnh PED và TGE.

Hiện nay, để phòng chống bệnh tiêu chảy trên lơ ̣n do virus TGE và PED gây ra, 3 dòng vacxin phổ biến thường được sử dụng đó là vacxin vô hoa ̣t, vacxin nhươ ̣c đô ̣c và auto vacxin. Vacxin vô hoa ̣t có hiê ̣u quả thấ p, trong khi auto vacxin thường đươ ̣c sử du ̣ng ở các công ty lớn , đem la ̣i hiê ̣u quả cao , tuy nhiên thường chỉ đươ ̣c sử du ̣ng nô ̣i bô ̣. Các vacxin PED đơn giá hoặc đa giá PED và TGE hiện trên thị trường đều từ các hãng nổi tiếng như Intervet, Borhinger hay Merial, các chủng virus sử dụng để sản xuất vacxin là các chủng virus thuộc nhóm cổ điển, không phải là các chủng virus có nguồn gốc từ Việt Nam. Sự khác biê ̣t về di truyề n giữa các chủng vac xin và các chủng thực điạ dẫn đến khả năng bảo hộ của các vacxin PED chỉ ở mức đô ̣ thấ p hoă ̣c trung bình.

Do sự đa dạng và biến đổi nhanh chóng của các chủ ng virus dẫn đến khả năng bảo hô ̣ chéo bị giới hạn khi có các chủng virus khác nhau xâm nhiễm ,vacxin từ các chủng virus PED, TGE đươ ̣c phân lâ ̣p ở Việt Nam sẽ có khả năng bảo hộ tốt do tin ́ h tương đồ ng về di truyề n. Vì vậy,việc phân lập các chủng virus ngoài thực địa đồng thời đánh giá các đặc tính sinh học của virus để sản xuất vacxin là cần thiết. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó chúng tôi tiến hành đề tài “Một số đặc tính sinh học của chủngTGEV (transmissible gastroenteritis virus) và PEDV (porcine epidemic diarrhea virus) dùng sản xuất vacxin nhược độc đa giá”. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Mục tiêu chung: đánh giá được một số chỉ tiêu chất lượng của 2 chủng virus TGEV và PEDV dùng sản xuất vacxin nhược độc.

1 c - Mục tiêu cụ thể: +) Đánh giá đă ̣c tiń h ổn định hiệu giá của giố ng virus vacxin. +) Đánh giá được tính nhược độc của hai chủng giố ng virus. +) Đánh giá đặc tính ổn định di truyền của hai chủng giố ng virus. Ý NGHĨA KHOA HỌC - Kết quả của đề tài là cơ sở để sử dụng 2 chủng giống TGEV và PEDV làm giống gốc cho nghiên cứu sản xuất vacxin nhược độc nhị giá.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH TIÊU CHẢY DO VIRUS Trên thế giới các nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy ở lợn đã chỉ ra các tác nhân virus gây tiêu chảy chủ yếu gồm: Coronavirus và Rotavirus, Parvovirus. Trong đó Transmissible Gastroenteritis Virus (TGEV) và Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) là 2 virus thuộc nhóm coronavirus, là hai virus gây bệnh đường tiêu hóa thường gặp ở lợn. Ở Việt Nam có ít nghiên cứu về virus gây tiêu chảy đặc biệt là TGEV gây bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm và PEDV gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn.

Tình hình nghiên cứu về PEDV, TGEV tại Việt Nam Nghiên cứu về một số yếu tố liên quan và đặc điểm bệnh học của bệnh PED tại một số tỉnh phía Nam(Nguyễn Tất Toàn và Đỗ Tiến Duy, 2012) đã tiến hành khảo sát 110 trại đang xảy ra bệnh tiêu chảy cấp đặc trưng trên lợn ở mọi lứa tuổi. Kết quả cho thấy tỷ lệ bệnh và tỷ lệ chết xuất hiện trên lợn con theo mẹ là rất cao (tương ứng 93,94% và 81,67%). Hai tỷ lệ này giảm dần theo lứa tuổi. Các yếu tố liên quan đến việc lan truyền dịch bệnh gồm có khoảng cách đến với trại lợn bị bệnh, quy mô chăn nuôi, vệ sinh sát trùng và nguồn nước sử dụng.

Triệu chứng lâm sàng của bệnh PED: 100% tiêu chảy phân lỏng, 90,33% ói mửa. Bệnh tích thường gặp: 94,42% có biểu hiện dạ dày căng phồng, chứa nhiều thức ăn không tiêu và 86,33% thành ruột mỏng, phồng to, chứa nhiều nước và dịch chất bên trong. Cũng trong năm 2012, 2 tác giả này cũng tiến hành nghiên cứu các chủng PEDV tại miền Nam Việt Nam, kết quả cho thấy sự khác biệt lớn về trình tự nucleotide của gen S với các chủng tham chiếu khác phân lập ở châu Âu (Br1 / 87, CV777) và ở Hàn Quốc (Spk1, Chinju99, DR13 và KNU-0801). Nghiên cứu còn chỉ ra rằng các chủng PEDV Việt Nam hiện tại giống với các chủng phân lập Trung Quốc (JS-2004-2 và DX), Thái Lan (07NP01, 08NP02 và 08CB01) và gần đây là các chủng phân lập được tại Hàn Quốc (KNU-0802 và CPF299).

Các chủng PEDV phân lập được tại Việt Nam hiện tại có thểcó nguồn gốc từ cùng một tổ tiên của Trung Quốc trải qua biến thể di truyền và có thể hình thành một chủng PEDV mới tại Việt Nam. 3 c Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ và bệnh lý của bệnh tiêu chảy thành dịch trên lợn ở một số tỉnh phía Bắc (Hưng Yên, Hải Dương, Bắc Giang, Bắc Ninh và Hà Nội) cho biết lợn có biểu hiện tiêu chảy ở mọi lứa tuổi, điều trị bằng kháng sinh không hiệu quả, tỷ lệ chết tập trung ở lợn con theo mẹ (Nguyễn Văn Điệp và cs. Sử dụng phương pháp RT-PCR để chẩn đoán virus PED, TGE và Rota. Kết quả nghiên cứu cho thấy có tới 83,9% dương tính với virus PED.

Tỷ lệ bệnh PED cao nhất ở lợn con theo mẹ (96%), lợn con sau cai sữa (86,2%) và thấp nhất ở đực giống. Tỷ lệ chết cao nhất ở lợn con theo mẹ (68,6%). Quan sát lâm sàng cho thấy phân có màu vàng, vàng xanh, hoặc phân màu xám, xám đen. Bệnh tích đại thể chủ yếu quan sát thấy ở dạ dày (19,4%), ruột non (61,3%), ruột già (32,2%), hạch bạch huyết (38,7%) và ở một số cơ quan nội tạng khác.

Năm 2015, Lê Văn Phan và cộng sự (Lê Văn Phan và cs.,2015) đã nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của virus gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn tại một số tỉnh như: Thái Nguyên, Thái Bình, Quảng Trị từ năm 2013- 2014. Kết quả cho thấy, trong tổng số 148 mẫu bệnh phẩm (phân, ruột) của lợn nghi mắc PEDV được chẩn đoán bằng kỹ thuật RT – PCR có 57/148 (38,51%) dương tính với virus PED. Đồng thời khi tiến hành giải mã phân tích đoạn gen S của các chủng virus thấy tương đồng về (nt) và aa rất cao khi so sánh với các chủng virus PED tham chiếu khác trước đây của Việt Nam, tỷ lệ tương đồng nt từ 94,8 - 98,6% và aa từ 93,5 - 98,8%. Trong đó các chủng virus PED thu thập được ở 2 tỉnh Thái Bình và Thái Nguyên trong năm 2013 và 2014 có mối quan hệ gần gũi với các chủng virus PED phân lập được ở Việt Nam trước đây và nằm trong cùng 1 nhánh, các chủng virus PED thu thập được ở Quảng Trị trong năm 2014 nằm cùng nhánh với các chủng virus PED mới được phân lập tại Trung Quốc trong năm 2011 - 2012 và đặc biệt là các chủng virus được phân lập tại Mỹ và Hàn Quốc trong các đợt dịch PED nổ ra vào năm 2013 và 2014.

Do đó, dịch PED lưu hành tại miền Bắc và bắc Trung bộ có thể tồn tại ít nhất 2 biến chủng thuộc nhóm phụ G1-1(Lê Văn Phan và cs. Năm 2016, (Choe et al., 2016) đã tiến hành thu thập các mẫu phân lợn con với tiêu chảy ở tỉnh Hưng Yên, kết quả cho thấy một chủng virus gây bệnh tiêu chảy ở lợn (PEDV) có độc lực cao đã xuất hiện ở Việt Nam. Trình tự bộ gen của chủng HUA-14PED96 cho thấy, chủng HUA-14PED96 bị xóa 72 nt trong ORF 1a, tương đồng với các chủng PEDV tại Mỹ. 4 c Năm 2017,Huỳnh Minh Trí đã tiến hành khảo sát tỷ lệ nhiễm virus gây bệnh tiêu chảy cấp Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) trên lợn nái và xác định các yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh PED tại tỉnh Tiền Giang.

Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm PEDV trên đàn nái tại tỉnh Tiền Giang là khá cao 33,72%, trong đó cao nhất là huyện Chợ Gạo (59,22%), Cai Lậy (27,66%), Cái Bè (14,52%) và thấp nhất là huyện Châu Thành (10,20%). Tỷ lệ nhiễm cao nhất ở qui mô đàn nái từ trên 50 nái (34,95%), qui mô 20 – 50 (33,66%) nái và thấp nhất là ở qui mô dưới 20 nái tương ứng với tỷ lệ 31,58%. Tỷ lệ nhiễm ở những nái có số lứa đẻ trong khoảng 4 – 5 lứa (56,67%), nái trên 5 lứa (38,59%), tiếp theo là những nái hậu bị hoặc chỉ mới sinh sản 1 lứa (33,33%) và thấp nhất là nái đã sinh sản 2 – 3 lứa (27,50%). Phân tích các yếu tố nguy cơ xảy ra PED cho thấy nguy cơ cao nhất là không sát trùng chuồng trại hoặc sát trùng chuồng trại ít hơn 2 tuần/lần, không có hố sát trùng trước trại, khoảng cách gần với các hộ chăn nuôi có dịch bệnh (Huỳnh Minh Trí và cs.

Theo nghiên cứu của Đàm Thị Vui, năm 2018 kết quả giải trình tự gen của cả ba chủng phân lập PEDV của Việt Nam cho thấy cả 3 chủng đều có chiều dài là 28.035 nucleotide (nt)và giống nhau ở mức độ nucleotide và axit amin tương ứng trên 99,8% và 99,6% (Vui và cs. Bộ gen giống với các bộ gen PEDV khác được báo cáo trước đây, với thứ tự gen 5’ -ORF1a / 1b-S-ORF3-EMN-3'. Vùng 5’ UTR có chiều dài là 292 nt. Gen ORF1a / bcó chiều dài 20.

Kích thước gen S, ORF3, E, M và N lần lượt là 4.158 nt, 675 nt,231 nt, 681 nt và 1. Vùng 3’ UTR có chiều dài là 334 nt. Các chủng Việt Nam có đột biến chèn thêm axit amin (56GENQ59 ) và (140N) tại các vị trí axit amin 55 đến 60 và 140, và xóa 2 axit amin 2 (160DG161) ở axit amin 160 và 161. Năm 2018, Nguyễn Văn Điệp đã tiến hành nghiên cứu về chủng PEDV tại các tỉnh phía bắc Việt Nam giai đoạn 2012- 2015.

Phân tích trình tự cho thấy gen S của các chủng PEDV tại Việt Nam không đồng nhất. Mười ba chủng PEDV biến thể của Việt Nam có protein S ngắn hơn 261 amino acid so với protein S bình thường.