Luận án: Đặc điểm sinh học phân tử của E. coli mang gen mcr-1 tại Thanh Hà, Hà Nam năm 2015

Luận án nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin từ người, vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà, Hà Nam.

• Tác giả: Nguyễn Thị Tuyết Mai
• Người hướng dẫn: TS. Trần Huy Hoàng
• Trường học: Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương
• Chuyên ngành: Vi sinh Y học
• Đề tài: Đặc điểm sinh học phân tử của Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập từ người và vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà, Hà Nam, năm 2015
• Loại tài liệu: Luận án tiến sỹ y học
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC BIỂU ĐỒ
• DANH MỤC HÌNH
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh
• 1.1.1. Sự đề kháng kháng sinh
• 1.1.2. Các nguyên nhân gây gia tăng và lan truyền các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh
• 1.2. Vi khuẩn gram âm đường ruột và thực trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gram âm đường ruột
• 1.2.1. Vi khuẩn gram âm đường ruột
• 1.2.2. Thực trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn gram âm đường ruột hiện nay
• 1.3. Đặc điểm vi sinh vật học và tình hình kháng colistin của E. coli
• 1.3.1. Đặc điểm vi sinh vật học
• 1.3.2. Các nghiên cứu về gen mcr-1 kháng colistin của E. coli và các vi khuẩn gram âm đường ruột trên thế giới và Việt Nam
• 1.3.3. Một số đặc điểm về gen mcr-1 và plasmid của các chủng E. coli kháng colistin
• 1.4. Các kĩ thuật phát hiện kháng kháng sinh và các kĩ thuật sinh học phân tử sử dụng trong phát hiện các gen kháng kháng sinh
• 1.4.1. Kĩ thuật phát hiện kháng kháng sinh
• 1.4.2. Các kĩ thuật sinh học phân tử nghiên cứu vi khuẩn kháng kháng sinh
• 1.4.2.1. Kỹ thuật PCR phát hiện gen kháng kháng sinh
• 1.4.2.2. Kỹ thuật RADP PCR
• 1.4.2.3. Kỹ thuật điện di xung trường
• 1.4.2.4. Kỹ thuật Southern blot phân tích hệ gen vi khuẩn
• 1.4.2.5. Kỹ thuật Multi Locus Sequence Typing
• 1.4.2.6. Kỹ thuật giải trình tự gen
• 1.5. Các vấn đề cần giải quyết trong nghiên cứu
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Thiết kế nghiên cứu
• 2.3. Thời gian nghiên cứu
• 2.4. Đối tượng nghiên cứu
• 2.5. Cỡ mẫu nghiên cứu
• 2.6. Phương pháp lấy mẫu và kỹ thuật xét nghiệm
• 2.6.1. Kĩ thuật nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
• 2.6.2. PCR phát hiện gen mcr-1
• 2.6.3. Kỹ thuật định danh vi khuẩn bằng máy MALDI TOF
• 2.6.4. Kỹ thuật đánh giá nồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu
• 2.6.5. Phân tích mối liên hệ kiểu gen bằng kỹ thuật PFGE
• 2.6.6. Kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn
• 2.6.7. Kỹ thuật tiếp hợp đánh giá sự lan truyền gen mcr -1 qua plasmid
• 2.7. Biến số và chỉ số trong nghiên cứu
• 2.8. Phương pháp thu thập thông tin
• 2.9. Xử lý và phân tích số liệu
• 2.10. Khống chế sai số
• 2.11. Đạo đức trong nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ người và động vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà, Thanh Liêm, Hà Nam, năm 2015
• 3.1.1. Đặc điểm chung về các loại mẫu được thu thập trong nghiên cứu
• 3.1.2. Tỷ lệ mẫu có chứa chủng E. coli mang gen mcr-1 phân lập được từ người người, động vật nuôi, thực phẩm và nước
• 3.1.3. Tỷ lệ chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 phân lập được từ người, động vật nuôi, thực phẩm và nước
• 3.1.4. Mức độ nhạy cảm colistin của các chủng E. coli mang gen mcr-1
• 3.1.5. Tỷ lệ phân bố của gen mcr-1 trên NST và plasmid của các chủng E. coli
• 3.1.6. Mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng E. coli mang gen mcr-1 trong phân người và động vật nuôi, thức ăn và nước
• 3.2. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 phân lập được trong nghiên cứu
• 3.2.1. Các gen kháng kháng sinh của các chủng E. coli mang gen mcr-1
• 3.2.2. Mối liên hệ về kiểu gen giữa các chủng vi khuẩn mang gen mcr-1
• 3.2.3. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng E. coli mang gen mcr-1 bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen
• 3.3. Kết quả xác định đặc điểm plasmid, cơ chế lan truyền qua trung gian plasmid và cấu trúc di truyền động của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1
• 3.3.1. Xác định đặc điểm của các plasmid mang gen mcr-1
• 3.3.2. Xác định khả năng lan truyền gen kháng qua trung gian plasmid giữa các chủng vi khuẩn
• 3.3.3. Xác định cấu trúc của các yếu tố di truyền di động mang gen mcr-1
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ người, vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà huyện Thanh Liêm, Hà Nam giai đoạn 2014-2015
• 4.1.1. Một số đặc điểm về quần thể thu thập mẫu nghiên cứu
• 4.1.2. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ người, động vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà huyện Thanh Liêm, Hà Nam giai đoạn 2014-2015
• 4.1.3. Mức độ nhạy cảm colistin của các chủng E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin
• 4.1.4. Sự phổ biến của các chủng E. coli mang gen mcr-1 trên NST và plasmid
• 4.1.5. Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng E. coli mang gen mcr-1 tại cộng đồng trong nghiên cứu
• 4.2. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 phân lập được trong nghiên cứu
• 4.2.1. Các gen kháng kháng sinh
• 4.2.2. Mối liên hệ về kiểu gen của các chủng E. coli mang gen mcr-1 bằng kỹ thuật PFGE
• 4.2.3. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng E. coli mang gen mcr-1 bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ bộ gen
• 4.3. Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo
• ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Đặc điểm sinh học phân tử của E

Nghiên cứu tập trung vào đặc điểm sinh học phân tử của E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin, được phân lập từ các nguồn khác nhau tại Thanh Hà, Hà Nam. Gen mcr-1 là yếu tố di truyền động, nằm trên plasmid, cho phép vi khuẩn kháng lại colistin, một kháng sinh quan trọng trong điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn gram âm. Nghiên cứu sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, PFGE, và giải trình tự toàn bộ hệ gen để xác định cấu trúc di truyền và cơ chế lan truyền của gen mcr-1. Kết quả cho thấy sự đa dạng về kiểu gen và sự hiện diện của gen mcr-1 trên nhiều loại plasmid khác nhau, làm tăng nguy cơ lan truyền kháng thuốc trong cộng đồng.

1.1. Cơ chế kháng colistin của E. coli

Gen mcr-1 mã hóa enzyme làm thay đổi cấu trúc màng tế bào vi khuẩn, ngăn cản sự liên kết của colistin với màng tế bào. Điều này giúp E. coli kháng lại tác dụng của colistin. Nghiên cứu chỉ ra rằng gen mcr-1 thường nằm trên các yếu tố di truyền động như transposon và plasmid, tạo điều kiện thuận lợi cho sự lan truyền giữa các chủng vi khuẩn khác nhau.

1.2. Phân tích kiểu gen và đa dạng di truyền

Sử dụng kỹ thuật PFGE và MLST, nghiên cứu xác định được sự đa dạng về kiểu gen của các chủng E. coli mang gen mcr-1. Các chủng này được phân lập từ người, vật nuôi, thực phẩm, và nước cho thấy sự tương đồng về kiểu gen, gợi ý sự lan truyền qua chuỗi thức ăn và môi trường.

II. Tỷ lệ và phân bố của E

Nghiên cứu xác định tỷ lệ E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin từ các nguồn khác nhau tại Thanh Hà, Hà Nam. Kết quả cho thấy tỷ lệ cao nhất được tìm thấy trong phân động vật nuôi, tiếp theo là thực phẩm, nước, và phân người. Điều này phản ánh sự lây lan của gen mcr-1 từ động vật sang người thông qua chuỗi thức ăn và môi trường. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng việc sử dụng colistin trong chăn nuôi là yếu tố chính thúc đẩy sự phát triển và lan truyền của gen mcr-1.

2.1. Tỷ lệ E. coli mang gen mcr 1 trong phân động vật

Tỷ lệ E. coli mang gen mcr-1 trong phân động vật đạt mức cao nhất, chiếm khoảng 30%. Điều này cho thấy việc sử dụng colistin trong chăn nuôi đã tạo áp lực chọn lọc, thúc đẩy sự phát triển của các chủng kháng thuốc.

2.2. Sự lan truyền qua chuỗi thức ăn

Nghiên cứu ghi nhận sự hiện diện của E. coli mang gen mcr-1 trong thực phẩm như thịt lợn và thịt gà. Điều này cho thấy nguy cơ lây lan gen mcr-1 từ động vật sang người thông qua tiêu thụ thực phẩm bị ô nhiễm.

III. Ý nghĩa và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu cung cấp bằng chứng khoa học về sự lan truyền của gen mcr-1 trong cộng đồng, đặc biệt là từ vật nuôi sang người thông qua thực phẩm và nước. Kết quả nghiên cứu nhấn mạnh sự cần thiết của việc kiểm soát việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và giám sát chặt chẽ các nguồn lây nhiễm trong cộng đồng. Đây là cơ sở để đề xuất các biện pháp phòng ngừa và giảm thiểu sự gia tăng các chủng vi khuẩn kháng colistin.

3.1. Kiểm soát sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi

Nghiên cứu khuyến nghị hạn chế sử dụng colistin trong chăn nuôi để giảm áp lực chọn lọc, ngăn chặn sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc.

3.2. Giám sát và phòng ngừa lây lan

Cần tăng cường giám sát các nguồn lây nhiễm như thực phẩm và nước để phát hiện sớm và kiểm soát sự lan truyền của gen mcr-1 trong cộng đồng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Việc lạm dụng kháng sinh trong điều trị lâm sàng và chăn nuôi nông nghiệp đã dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh (KKS) gia tăng nghiêm trọng trên phạm vi toàn cầu. Sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn Gram âm đường ruột mang gen blaNDM-1 đề kháng carbapenem—nhóm kháng sinh lựa chọn ưu tiên trong điều trị nhiễm trùng nặng—đã buộc ngành y tế phải tái sử dụng colistin (kháng sinh nhóm polypeptide) như một biện pháp điều trị cuối cùng. Tuy nhiên, năm 2015, sự phát hiện của gen mcr-1 (Mobilized colistin resistance-1) có khả năng truyền ngang qua plasmid trên vi khuẩn Escherichia coli đã đặt ra thách thức lớn đối với công tác kiểm soát nhiễm khuẩn và sức khỏe cộng đồng.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu trước đây chủ yếu phát hiện vi khuẩn mang gen mcr-1 đơn lẻ trong bệnh viện hoặc tại một số trang trại chăn nuôi gia súc, gia cầm. Vẫn còn khoảng trống nghiên cứu thực nghiệm đồng bộ trên toàn bộ hệ sinh thái cộng đồng gồm người, động vật nuôi, thực phẩm và môi trường nước sinh hoạt tại cùng một địa bàn nông thôn nhằm xác định cách thức lưu hành và đặc tính sinh học phân tử của các chủng vi khuẩn này.

Luận án tiến sĩ y học của tác giả Nguyễn Thị Tuyết Mai thực hiện đề tài nhằm giải quyết hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Xác định tỷ lệ chủng Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ phân người và vật nuôi, thực phẩm, nước tại xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam, năm 2015.
2. Xác định một số đặc điểm sinh học phân tử của các chủng Escherichia coli mang gen mcr-1 đã phân lập được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của luận án bao gồm:

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn Escherichia coli phân lập được từ 4 nhóm mẫu: phân người (PN), phân động vật nuôi (PĐVN), thực phẩm/thức ăn (TĂ), và mẫu nước (N).
• Phạm vi không gian: 69 hộ gia đình thuộc các thôn tại xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam.
• Phạm vi thời gian: Thu thập mẫu thực địa trong năm 2015 (giai đoạn nghiên cứu 2014–2015), hoàn thành và bảo vệ luận án năm 2022.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng hợp hệ thống y văn chuyên ngành về cơ chế tác dụng của kháng sinh, sinh học phân tử của tính kháng thuốc và lịch sử phát hiện gen mcr-1 trên thế giới và tại Việt Nam:

• Công trình của Liu và cộng sự (2015): Công bố đầu tiên phát hiện gen mcr-1 nằm trên plasmid ở các chủng E. coli và Klebsiella pneumoniae tại Trung Quốc, phân lập từ 78/523 (15%) mẫu thịt sống, 166/824 (21%) mẫu động vật và 16/1322 (1%) bệnh nhân nội trú. Nhóm tác giả xác định cấu trúc các plasmid mang gen kháng như pHNSHP45, pE15004, pE15015, pE15017.
• Các nghiên cứu quốc tế liên quan:
  • Anjum MF và cộng sự: Phát hiện E. coli và Salmonella mang gen mcr-1, sinh enzyme ESBLs trên plasmid chứa trình tự chèn ISApI1 tại trang trại lợn ở Anh.
  • Fernandes MR và cộng sự: Phân lập E. coli sequence type ST101 mang mcr-1 trên plasmid IncX4 từ bệnh nhân tiểu đường tại Brazil.
  • Wong Sally CY và cộng sự (2015–2016): Giám sát tại Hồng Kông, phân lập 5 chủng vi khuẩn đường ruột mang mcr-1 (0,4%), trong đó có 4 chủng E. coli.
  • Nghiên cứu tại Đan Mạch: Phân lập E. coli mang mcr-1 từ bệnh nhân nhiễm trùng máu và thịt gà, đồng thời mang các gen blaCTX-M-55, blaCMY-2, blaSHV-12.
  • Patrick McGann và cộng sự: Phát hiện E. coli sinh ESBL mang mcr-1 từ bệnh nhân nhiễm trùng tiết niệu tại Mỹ.
  • Yao, Xu và cộng sự: Phát hiện chủng E. coli THSJ02 (ST167) từ thịt gà tại Quảng Châu mang đồng thời các gen mcr-1, blaNDM-9, fosA3, rmtB, blaCTX-M-65 và floR.
• Các nghiên cứu tại Việt Nam:
  • Dương Thị Toan và cộng sự (2014): Khảo sát tại Bắc Giang cho thấy 100% trang trại sử dụng kháng sinh, trong đó 45% sử dụng colistin trong chăn nuôi lợn.
  • Phạm Kim Đăng và cộng sự: Khảo sát tại Hải Phòng ghi nhận người chăn nuôi sử dụng colistin liều thấp trong thức ăn công nghiệp để kích thích sinh trưởng gà trái với quy chuẩn QCVN01-10:2009.
  • Nguyễn T. Nhung và cộng sự: Khảo sát tại Tiền Giang ghi nhận tỷ lệ lưu hành gen mcr-1 ở E. coli từ 19% đến 22%.
  • Surbhi Malhotra-Kumar và cộng sự (2014–2015): Sàng lọc 24 chủng E. coli sinh ESBL tại Hưng Yên và Hà Nội, phát hiện 9/24 chủng mang gen mcr-1 (37,5%) với nồng độ ức chế tối thiểu MIC từ 4 đến 8 mg/L.

Khoảng trống nghiên cứu mà luận án lựa chọn giải quyết là đánh giá sự phân bố đồng bộ của vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 trên toàn bộ chuỗi mắt xích sinh thái nông thôn (người, động vật, thức ăn, nguồn nước) tại miền Bắc Việt Nam, đồng thời phân tích chi tiết các đặc điểm di truyền phân tử, plasmid và cấu trúc di truyền động liên quan đến sự truyền ngang của gen này.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và khái niệm

• Cơ chế tác dụng của colistin: Colistin (polymyxin E) là phân tử cationic liên kết với lipopolysaccharide (LPS) và lipid A ở màng ngoài của vi khuẩn Gram âm, cạnh tranh thế chỗ các ion ổn định $Ca^{2+}$ và $Mg^{2+}$, làm gián đoạn màng tế bào dẫn đến rò rỉ các thành phần nội bào.
• Cơ chế đề kháng colistin: Đề kháng qua nhiễm sắc thể liên quan đến hệ thống điều hòa hai thành phần (pmrAB, phoPQ) hoặc gen mgrB; đề kháng qua plasmid do gen mcr-1 mã hóa enzyme phosphoethanolamine transferase gắn thêm phosphoethanolamine vào lipid A, làm giảm ái lực của màng ngoài với colistin.
• Truyền gen ngang (Horizontal Gene Transfer - HGT): Sự phát tán gen kháng qua tiếp hợp (conjugation), biến nạp (transformation), tải nạp (transduction) thông qua các yếu tố di truyền di động (MGEs) gồm plasmid, transposon (như Tn6330 chứa đoạn chèn ISApI1) và integron.

Nhóm kháng sinh	Các gen kháng quan trọng được tổng hợp trong luận án
$\beta$-lactam	AmpC, blaTEM-, blaSHV-, blaCTX-M-, KPC, SME, IMI, NMC, GES, NDM, IMP, VIM, SPM, GIM, OXA-
Aminoglycosid	armA, npmA, rmtA, rmtB, rmtC, rmtD, nhóm gen mã hóa enzyme AAC, ANT, APH
Chloramphenicol	catA, catB, cmlA, floR
Glycopeptid	vanA, vanB, vanC1, vanC2/3, vanD, vanE, vanG
Quinolon	gyrA, gyrB, parC, parE (NST); qnr (qnrA, B, C, D, S), aac(6')-Ib, qepA (plasmid)
Sulfonamid & Trimethoprim	folP, sul1, sul2, sul3; folA, dfrA, dfrB, dfrK
Polypeptid	lpxA, lpxC, lpxD, họ gen mcr- (mcr-1 đến mcr-10)

Phương pháp nghiên cứu

Luận án áp dụng thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang kết hợp các kỹ thuật thực nghiệm vi sinh vật học và sinh học phân tử:

• Địa bàn và cỡ mẫu: Thu thập các mẫu phân người, phân động vật nuôi, thực phẩm và nước sinh hoạt tại 69 hộ gia đình thuộc xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam.
• Nuôi cấy và định danh vi khuẩn: Phân lập vi khuẩn trên các môi trường chọn lọc, định danh loài Escherichia coli bằng hệ thống khối phổ MALDI-TOF.
• Xác định tính nhạy cảm kháng sinh:
  • Kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán và kỹ thuật E-test.
  • Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với colistin và các kháng sinh khác theo tiêu chuẩn của Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và Phòng xét nghiệm (CLSI).
• Kỹ thuật sinh học phân tử:
  • Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) nhằm phát hiện sự hiện diện của gen mcr-1.
  • Điện di xung trường (Pulsed-field Gel Electrophoresis - PFGE) sử dụng enzyme giới hạn để phân tích mối liên hệ phả hệ kiểu gen giữa các chủng vi khuẩn.
  • Giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing - WGS) xác định sequence type (MLST), core genome, danh mục gen kháng thuốc (resistome) và nhận diện nhóm replicon plasmid mang gen mcr-1.
  • Thử nghiệm tiếp hợp (Conjugation assay) giữa chủng cho mang gen mcr-1 và chủng nhận (E. coli J53 hoặc E. coli DH5$\alpha$) để đánh giá khả năng lan truyền qua plasmid.
  • Phân tích cấu trúc transposon và các yếu tố di truyền di động (ISApl1-PAP2-mcr-1-ISApl1).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 1 cung cấp cơ sở lý luận về kháng sinh và tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn. Tác giả phân tích các cơ chế tác dụng sinh học: ức chế sinh tổng hợp vách tế bào, gây rối loạn chức năng màng nguyên tương, ức chế sinh tổng hợp protein, ức chế acid nucleic và tổng hợp chất chuyển hóa. Phân biệt đề kháng giả và đề kháng thật (đề kháng tự nhiên, đề kháng thu được).

Chương này trình bày chi tiết về vi khuẩn Gram âm đường ruột (Enterobacteriaceae), đặc điểm sinh vật hóa học và kháng nguyên (O, K, H) của E. coli, cũng như lịch sử và dược lý học của colistin. Tác giả tổng quan các nghiên cứu trong nước và quốc tế về tình trạng lạm dụng colistin trong nông nghiệp, con đường lây truyền vi khuẩn kháng thuốc qua chuỗi thức ăn từ động vật sang người, cấu trúc các biến thể gen mcr- (từ mcr-1 đến mcr-10), cùng các kỹ thuật phòng xét nghiệm đánh giá tính kháng thuốc và kiểu gen (MIC, E-test, PCR, RAPD-PCR, PFGE, Southern blot, MLST, WGS).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết địa điểm nghiên cứu tại xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam và thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang. Tác giả trình bày quy trình thu thập và bảo quản 4 nhóm mẫu (phân người, phân động vật nuôi, thức ăn/thực phẩm, nước).

Chương này chuẩn hóa các quy trình kỹ thuật:

1. Quy trình nuôi cấy, phân lập vi khuẩn trên thạch dinh dưỡng và môi trường chọn lọc.
2. Quy trình định danh vi khuẩn bằng máy MALDI-TOF.
3. Quy trình phản ứng PCR phát hiện gen mcr-1.
4. Phương pháp thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu MIC và tiêu chuẩn biện giải kết quả theo CLSI.
5. Quy trình kỹ thuật PFGE cắt hệ gen bằng enzyme giới hạn.
6. Quy trình kỹ thuật WGS và các bước phân tích tin sinh học để phân loại core genome, xác định ST và replicon plasmid.
7. Quy trình thử nghiệm tiếp hợp chuyển gen kháng qua plasmid sang chủng nhận E. coli chuẩn.
8. Các biện pháp khống chế sai số, quản lý chất lượng dữ liệu và tuân thủ đạo đức trong nghiên cứu y sinh học.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ địa bàn nghiên cứu:

• Tỷ lệ phân lập vi khuẩn mang gen mcr-1: Tác giả xác định tỷ lệ mẫu và tỷ lệ chủng E. coli mang gen mcr-1 dương tính phân lập từ phân người, phân động vật nuôi, thực phẩm và nguồn nước tại 69 hộ gia đình thuộc xã Thanh Hà (thể hiện qua Biểu đồ 3.1 và Biểu đồ Heatmap 3.2).
• Mức độ nhạy cảm kháng sinh và kiểu hình kháng: Trình bày giá trị MIC của colistin trên các chủng mang gen mcr-1, xác định tỷ lệ các chủng đa kháng kháng sinh (MDRO) đối với các nhóm $\beta$-lactam, aminoglycosid, quinolon, phenicol, sulfonamid/trimethoprim.
• Vị trí định vị của gen mcr-1: Xác định sự phân bố của gen mcr-1 nằm trên nhiễm sắc thể hoặc nằm trên plasmid của các chủng E. coli phân lập được.
• Đặc điểm hệ gen và phân tích sinh học phân tử (WGS, PFGE):
  • Phân tích mối liên hệ kiểu gen và phả hệ bằng kỹ thuật PFGE (Hình 3.1 đến Hình 3.6).
  • Phân tích core genome và xác định các sequence type (ST) lưu hành trong quần thể vi khuẩn mang gen mcr-1 (Hình 3.7).
  • Xác định các gen kháng kháng sinh đi kèm trên cùng hệ gen (Biểu đồ Heatmap 3.3).
  • Phân loại các nhóm plasmid replicon mang gen mcr-1 (IncI2, IncHI2/IncHI2A/IncN, IncX4...) thông qua Biểu đồ Venn 3.4 và phân tích cấu trúc plasmid (Hình 3.8, Hình 3.9).
• Khả năng lan truyền và cấu trúc di truyền động:
  • Kết quả thử nghiệm tiếp hợp thành công giữa các chủng E. coli mang gen mcr-1 phân lập từ thực địa với chủng vi khuẩn nhận trong phòng thí nghiệm.
  • Cấu trúc các yếu tố di truyền di động mang gen mcr-1 (transposon ISApl1-PAP2-mcr-1-ISApl1 / Tn6330) trên nhiễm sắc thể và plasmid của các mẫu đại diện (Hình 3.10).

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 tập trung phân tích, so sánh các kết quả nghiên cứu với y văn trong nước và quốc tế:

• Bàn luận về tỷ lệ hiện nhiễm của E. coli mang gen mcr-1 tại cộng đồng nông thôn Hà Nam năm 2015 trong bối cảnh sử dụng colistin rộng rãi trong chăn nuôi gà và lợn.
• Phân tích mức độ nhạy cảm colistin và nguy cơ của các chủng vi khuẩn đồng thời mang gen mcr-1 cùng các gen kháng khác (như gen sinh ESBLs), làm suy giảm hiệu lực điều trị của các kháng sinh phổ biến.
• Thảo luận về vai trò của plasmid (đặc biệt là IncI2 và IncHI2) và transposon Tn6330 trong việc thúc đẩy truyền gen ngang giữa các chủng vi khuẩn cùng loài và khác loài trong đường tiêu hóa.
• Phân tích mối liên hệ dịch tễ học và kiểu gen (PFGE, MLST) giữa các chủng phân lập từ người, động vật nuôi, thức ăn và nước trong cùng hộ gia đình, chứng minh sự tồn tại của con đường lan truyền qua chuỗi thức ăn và môi trường sinh hoạt nông thôn.
• Trình bày các hạn chế của nghiên cứu và định hướng các nghiên cứu tiếp theo.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt khoa học lý luận

• Cung cấp dẫn liệu khoa học đồng bộ đầu tiên tại miền Bắc Việt Nam về tỷ lệ phân lập, đặc điểm vi sinh học và đặc tính sinh học phân tử của các chủng E. coli mang gen mcr-1 trên cả 4 mắt xích sinh thái: người, động vật nuôi, thực phẩm và nguồn nước tại cấp độ hộ gia đình nông thôn.
• Xác định rõ vị trí của gen mcr-1 trên hệ gen (nhiễm sắc thể và plasmid), đặc trưng các nhóm replicon plasmid chủ yếu (IncI2, IncHI2/IncHI2A/IncN...) và cấu trúc di truyền động transposon Tn6330 (ISApl1-PAP2-mcr-1-ISApl1) tham gia vào quá trình truyền gen ngang.
• Bổ sung dữ liệu về các sequence type (ST) và đặc điểm phả hệ kiểu gen của các chủng E. coli kháng colistin lưu hành tại cộng đồng Việt Nam vào cơ sở dữ liệu dịch tễ học phân tử.

Đóng góp về mặt thực tiễn và ứng dụng

• Cung cấp bằng chứng thực nghiệm khẳng định sự lây truyền của vi khuẩn kháng colistin giữa động vật nuôi, thực phẩm, môi trường nước và con người trong cùng một không gian sống gia đình.
• Là cơ sở khoa học thực chứng phục vụ các nhà quản lý y tế và nông nghiệp trong việc xây dựng chính sách kiểm soát, quản lý việc kinh doanh và ban hành quy định cấm sử dụng colistin làm chất kích thích sinh trưởng hoặc phòng bệnh trong chăn nuôi.
• Đề xuất áp dụng cách tiếp cận Một sức khỏe (One Health) trong việc thiết lập mạng lưới giám sát vi khuẩn kháng thuốc tại cộng đồng.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế:
  • Dữ liệu thu thập mẫu được thực hiện cắt ngang tại một địa bàn xã nông thôn (xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam) trong giai đoạn 2014–2015, chưa bao phủ đa dạng các vùng sinh thái nông nghiệp khác trên toàn quốc.
  • Thiết kế nghiên cứu cắt ngang chưa cho phép theo dõi động thái biến đổi kiểu gen và sự chuyển giao plasmid theo thời gian dài.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Mở rộng giám sát dịch tễ học phân tử đa trung tâm đối với gen mcr-1 và các biến thể mới (mcr-2 đến mcr-10) tại các khu vực địa lý khác nhau.
  • Nghiên cứu sâu cơ chế tương tác và áp lực chọn lọc dẫn đến việc tích hợp gen mcr-1 cùng các gen kháng carbapenem (blaNDM, blaKPC, blaOXA) trên cùng một chủng vi khuẩn Gram âm.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên môn cho các đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và nhà nghiên cứu: Thuộc các chuyên ngành Vi sinh y học, Dịch tễ học, Bệnh truyền nhiễm, Y học dự phòng và Thú y học; có thể tham khảo quy trình tích hợp các kỹ thuật sinh học phân tử (MALDI-TOF, MIC, PFGE, WGS, thử nghiệm tiếp hợp plasmid) để phân tích dịch tễ học phân tử vi khuẩn.
• Giảng viên và cơ sở đào tạo y dược: Sử dụng các số liệu thực nghiệm, bảng tổng hợp gen kháng kháng sinh và hình ảnh cấu trúc plasmid, transposon làm học liệu giảng dạy chuyên đề kháng kháng sinh.
• Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách: Các đơn vị thuộc Bộ Y tế và Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn có thêm bằng chứng thực địa phục vụ công tác giám sát sử dụng kháng sinh trong nông nghiệp và chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Gen mcr-1 là gì và vì sao sự xuất hiện của gen này lại gây quan ngại y tế?

Gen mcr-1 (Mobilized colistin resistance-1) là gen mã hóa enzyme phosphoethanolamine transferase, làm thay đổi cấu trúc lipid A của màng ngoài vi khuẩn Gram âm, từ đó làm giảm ái lực và vô hiệu hóa tác dụng diệt khuẩn của colistin. Khác với cơ chế kháng colistin qua đột biến nhiễm sắc thể truyền thống, gen mcr-1 nằm trên các plasmid và transposon nên có khả năng truyền ngang nhanh chóng giữa các chủng và loài vi khuẩn khác nhau qua tiếp hợp.

2. Luận án đã thu thập các loại mẫu nào và tại địa bàn nào?

Luận án thu thập 4 nhóm mẫu bao gồm: phân người (PN), phân động vật nuôi (PĐVN), thực phẩm/thức ăn (TĂ), và mẫu nước (N) tại 69 hộ gia đình thuộc các thôn của xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam vào năm 2015.

3. Những kỹ thuật sinh học phân tử chính nào đã được sử dụng trong luận án?

Luận án sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử gồm: phản ứng PCR phát hiện gen mcr-1, định danh vi khuẩn bằng khối phổ MALDI-TOF, xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC, điện di xung trường (PFGE) phân tích phả hệ kiểu gen, giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) xác định ST, resistome, plasmid replicon typing, và thử nghiệm tiếp hợp (conjugation assay) đánh giá khả năng truyền plasmid sang chủng vi khuẩn nhận E. coli.

4. Các nhóm plasmid và cấu trúc di truyền động nào được xác định mang gen mcr-1 trong nghiên cứu?

Nghiên cứu xác định các nhóm replicon plasmid chủ yếu mang gen mcr-1 gồm IncI2, IncHI2/IncHI2A/IncN, IncX4, cùng với cấu trúc di truyền động transposon Tn6330 chứa các trình tự chèn ISApl1 (ISApl1-PAP2-mcr-1-ISApl1) định vị trên cả plasmid và nhiễm sắc thể của vi khuẩn.

5. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa như thế nào đối với việc kiểm soát kháng kháng sinh?

Nghiên cứu chứng minh bằng chứng thực nghiệm về sự tồn tại và lan truyền của vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin giữa động vật, thực phẩm, môi trường nước và con người trong cộng đồng nông thôn. Kết quả này cung cấp cơ sở khoa học để các cơ quan quản lý ban hành quy định nghiêm ngặt nhằm kiểm soát, tiến tới cấm sử dụng colistin trong chăn nuôi để bảo vệ hiệu quả điều trị của kháng sinh này trong y tế.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ y học của tác giả Nguyễn Thị Tuyết Mai đã hoàn thành việc đánh giá thực trạng lưu hành và xác định các đặc tính sinh học phân tử của các chủng vi khuẩn Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập từ người, động vật nuôi, thực phẩm và nguồn nước tại xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam. Bằng việc kết hợp các kỹ thuật vi sinh truyền thống và sinh học phân tử hiện đại như MALDI-TOF, PFGE, WGS và thử nghiệm tiếp hợp, công trình đã làm sáng tỏ mối liên hệ kiểu gen, cấu trúc plasmid (IncI2, IncHI2...), transposon Tn6330 và khả năng truyền gen ngang của mcr-1 trong cộng đồng. Đây là nguồn tư liệu khoa học có giá trị thực chứng cao, đóng góp cơ sở dữ liệu quan trọng cho công tác kiểm soát tính kháng kháng sinh theo hướng tiếp cận Một sức khỏe tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh 1. Định nghĩa: Kháng sinh là những chất do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất hóa học bán tổng hợp, tổng hợp, với nồng độ rất thấp, có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt tác nhân gây bệnh một cách đặc hiệu [6] 1. Cơ chế tác dụng Sau khi vào tế bào, kháng sinh được đưa tới đích tác động sẽ phát huy tác dụng bằng cách: - Ức chế sinh tổng hợp vách tế bào vi khuẩn, ví dụ nhóm penicillin, nhóm cephalosporin, vancomycin - Gây rối loạn chức năng màng nguyên tương, đặc biệt là chức năng thẩm thấu chọn lọc, làm cho các thành phần (ion) bên trong tế bào bị thoát ra ngoài, ví dụ nhóm polymyxin, Daptomycin - Ức chế sinh tổng hợp protein, ví dụn nhóm aminoglycoside, nhóm macrolid - Ức chế sinh tổng hợp acid nucleic, ví dụ nhóm quinolon - Ức chế sinh tổng hợp các chất chuyển hoá cần thiết cho tế bào như kháng sinh nhóm sulfamid [6] Hình 1.1: Cơ chế tác dụng của kháng sinh 5 1.

Sự đề kháng kháng sinh Kháng sinh có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn, nhưng khi trong môi trường có kháng sinh mà vi khuẩn vẫn phát triển thì được coi là sự đề kháng kháng sinh. Vi sinh vật đa kháng kháng sinh (MDRO) là các vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn có khả năng kháng một hoặc hơn một loại kháng sinh. Một số vi khuẩn chỉ kháng một loại kháng sinh vẫn được coi là đa kháng kháng sinh như tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA) hay vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem (CRE)[31] 1. Phân loại đề kháng kháng sinh Có 2 loại đề kháng: là đề kháng giả và đề kháng thật - Đề kháng giả: Đề kháng giả là có biểu hiện là đề kháng nhưng không phải là bản chất, tức là không do nguồn gốc di truyền.

Khi vào trong cơ thể, tác dụng của kháng sinh phụ thuộc vào ba yếu tố là kháng sinh - người bệnh - vi khuẩn. Đề kháng giả có thể do một trong ba yếu tố hoặc có thể kết hợp hai hay thậm chí cả ba yếu tố[6]. - Đề kháng thật: có 2 loại là đề kháng tự nhiên và đề kháng thu được. + Đề kháng tự nhiên do một số loài vi khuẩn không chịu tác dụng của một số kháng sinh nhất định.

aeruginosa không chịu tác dụng của penicilin G, S. aureus không chịu tác dụng của colistin. Hoặc vi khuẩn không có vách như Mycoplasma không chịu tác dụng của các kháng sinh beta-lactam ức chế sinh tổng hợp vách. Đề kháng tự nhiên thường mang tính chất đặc trưng theo từng loại vi khuẩn.

- Đề kháng thu được do một biến cố di truyền là đột biến hoặc nhận được gen đề kháng để một vi khuẩn đang từ không có gen đề kháng trở thành có gen đề kháng, nghĩa là đang nhạy cảm trở thành có khả năng đề kháng kháng sinh. Các gen đề kháng có thể nằm trên một, một số hoặc tất cả các thành phần di truyền của vi khuẩn gồm nhiễm sắc thể, plasmid và transposon. Đề kháng thu được thường mang tính chất của từng cá thể trong loài[6]. 6 Đề kháng thu được là yếu tố đóng vai trò chính trong việc gia tăng tình hình kháng kháng sinh hiện nay.

Các nghiên cứu về kháng kháng sinh của vi khuẩn luôn tập trung phân tích những biến đổi về mặt di truyền của vi khuẩn do đề kháng thu được làm thay đổi tính đề kháng của vi khuẩn như thế nào 1. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Sự chọn lọc tự nhiên tạo ra những đáp ứng đặc hiệu dẫn đến các đột biến gen để thích nghi.