Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học cố định enzyme β galactosidase vào thiolsulfinate agarose tsigel và ứng dụng thiết kế kỹ thuật lên men liên tục sản phẩm sữa nghèo lactose

Nghiên cứu cố định enzyme β galactosidase vào thiolsulfinate agarose tsigel và ứng dụng trong thiết kế kỹ thuật lên men sản phẩm sữa nghèo lactose.

• Tác giả: Đặng Văn Linh
• Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương
• Trường học: Đại học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Cố định enzyme ÿ-galactosidase vào Thiolsulfinate-Agarose và ứng dụng trong sản xuất sữa nghèo lactose
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: TP.HCM

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về B- galactosidase
• 1.1.1. Nguồn vi sinh vật thu nhận B-galactosidase
• 1.1.2. Cấu trúc của B- galactosidase
• 1.1.3. Cơ chất của B- galactosidase
• 1.2. Các phương pháp cố định
• 1.3. Tổng quan về chất mang cố định enzyme
• 1.3.1. Giới thiệu chung
• 1.3.2. Chất mang agarose
• 1.3.3. Chất mang thiolsulfinate- agarose
• 1.4. Tổng quan về thiết bị phản ứng sinh học dành cho enzyme thủy phân lactose
• 1.4.1. Thiết bị phản ứng packed bed reactor
• 1.4.2. Thiết bị phản ứng fluidized bed reactor
• 1.4.3. Thiết bị phản ứng membrane reactor
• 1.5. Tình hình nghiên cứu trong nước và nước ngoài
• 1.5.1. Các nghiên cứu trong nước
• 1.5.2. Các nghiên cứu ngoài nước
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Trang thiết bị, hóa chất, vật liệu
• 2.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.1.2. Trang thiết bị
• 2.1.3. Hóa chất và nguyên vật liệu
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.2.1. Khảo sát tiền đề tài
• 2.2.2. Cố định B-galactosidase vào chất mang TSI-gel
• 2.2.3. Nghiên cứu tính chất của chế phẩm B-galactosidase cố định
• 2.2.4. Nghiên cứu động học của B-galactosidase
• 2.2.5. Khảo sát số lần tái sử dụng và nhiệt độ bảo quản của chế phẩm enzyme cố định
• 2.2.6. Thiết kế kỹ thuật lên men liên tục sản phẩm sữa nghèo lactose
• 2.3. Phương pháp phân tích
• 2.3.1. Phương pháp Lowry xác định hàm lượng protein-enzyme
• 2.3.2. Phương pháp xác định lượng đường khử theo Miller
• 2.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme cố định
• 2.3.4. Phương pháp tạo thiolsulfinate- agarose
• 2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Khảo sát tiền đề tài
• 3.1.1. Định lượng protein-enzyme
• 3.1.2. Xác định hoạt tính, hoạt tính riêng và các yếu tố ảnh hưởng lên ß-galactosidase tự do
• 3.2. Cố định B-galactosidase vào chất mang TSI-gel
• 3.3. Nghiên cứu tính chất của chế phẩm B-galactosidase cố định
• 3.3.1. Ảnh hưởng của pH
• 3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
• 3.3.3. Khảo sát khả năng bền nhiệt
• 3.4. Nghiên cứu động học của ß-galactosidase
• 3.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
• 3.4.2. Xác định hệ số phương trình động học Michaelis – Menten
• 3.5. Khảo sát khả năng tái sử dụng và nhiệt độ bảo quản của chế phẩm enzyme cố định
• 3.5.1. Khảo sát số lần tái sử dụng
• 3.5.2. Khảo sát nhiệt độ bảo quản
• 3.6. Thiết kế kỹ thuật lên men liên tục sản phẩm sữa nghèo lactose
• 3.6.1. Qui trình sản xuất sữa tươi
• 3.6.2. Bài toán thiết kế
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC ĐỒ THỊ

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Enzyme β Galactosidase và Ứng Dụng

β-galactosidase, hay còn gọi là lactase, là một enzyme xúc tác phản ứng thủy phân đường lactose thành glucose và galactose. Ứng dụng chính của enzyme này là trong sản xuất sữa nghèo lactose, dành cho người không dung nạp lactose. Lactose là carbohydrate chính trong sữa, chiếm 2-10% tùy nguồn gốc. Thiếu hụt β-galactosidase gây ra tình trạng không dung nạp lactose. Giải pháp là dùng enzyme này, ở dạng tự do hoặc cố định, để thủy phân lactose. Tuy nhiên, enzyme tự do có nhược điểm về tính ổn định và chi phí tách chiết. Enzyme cố định khắc phục được các nhược điểm này. β-galactosidase có thể được cố định bằng nhiều phương pháp như nhốt gel, hấp phụ, liên kết cộng hóa trị hoặc kết hợp. Lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào liên kết hóa học giữa enzyme và chất mang. Enzyme cố định giúp tăng tính ổn định và khả năng tái sử dụng.

1.1. Nguồn Gốc và Phân Loại β Galactosidase

β-galactosidase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như vi sinh vật, thực vật và động vật. Tuy nhiên, enzyme từ các nguồn khác nhau có đặc tính khác nhau về trọng lượng phân tử, cấu trúc không gian, nhiệt độ và pH tối ưu. Nguồn từ động vật và thực vật thường không kinh tế. Nguồn từ vi sinh vật mang lại giá trị thương mại cao do dễ xử lý, tỷ lệ nhân giống và năng suất cao. Vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm và nấm men. β-galactosidase từ nấm sợi hoạt động tốt ở pH acid (3.0) và nhiệt độ 50-60°C, được gọi là β-galactosidase acid. Loại từ vi khuẩn và nấm men hoạt động ở pH trung tính (7.0) và nhiệt độ 30-40°C, được gọi là β-galactosidase trung tính. Vi sinh vật là nguồn thu enzyme hiệu quả.

1.2. Cấu Trúc và Cơ Chế Hoạt Động của β Galactosidase

Cấu trúc của β-galactosidase khá phức tạp, bao gồm bốn tiểu đơn vị giống hệt nhau, mỗi tiểu đơn vị chứa một chuỗi 1023 amino acid. Trong ruột người, enzyme này kết hợp với phlorizin hydrolase tạo thành phức hợp lactase-phlorizin hydrolase. β-galactosidase trong phức hợp này thủy phân lactose. Lactose (β-D-galactopyranosyl-(I, 4)-D-glucose) là một loại carbohydrate chính có trong sữa. Enzyme xúc tác phản ứng thủy phân lactose thành glucose và galactose. Cấu trúc enzyme quyết định khả năng xúc tác.

II. Vấn Đề Không Dung Nạp Lactose và Giải Pháp Enzyme

Hiện tượng không dung nạp lactose xảy ra do thiếu hụt enzyme β-galactosidase trong hệ tiêu hóa. Điều này dẫn đến lactose không được tiêu hóa, gây ra các triệu chứng khó chịu. Giải pháp là bổ sung enzyme β-galactosidase để thủy phân lactose trước khi tiêu thụ. Việc sử dụng enzyme cố định mang lại nhiều ưu điểm so với enzyme tự do, bao gồm khả năng tái sử dụng, ổn định cao hơn và dễ dàng tách khỏi sản phẩm. Các phương pháp cố định enzyme khác nhau ảnh hưởng đến hiệu quả và tính chất của enzyme. Nghiên cứu tập trung vào việc tìm kiếm các phương pháp cố định enzyme hiệu quả và kinh tế để ứng dụng trong sản xuất sữa nghèo lactose. Không dung nạp lactose là một vấn đề sức khỏe phổ biến.

2.1. Nguyên Nhân và Triệu Chứng Không Dung Nạp Lactose

Không dung nạp lactose là tình trạng cơ thể không tiêu hóa được lactose do thiếu enzyme lactase. Lactose không được tiêu hóa sẽ lên men trong ruột, gây ra các triệu chứng như đầy hơi, đau bụng, tiêu chảy. Mức độ nghiêm trọng của triệu chứng khác nhau tùy thuộc vào lượng lactose tiêu thụ và mức độ thiếu hụt lactase. Tình trạng này phổ biến ở người lớn tuổi và một số nhóm dân tộc. Thiếu lactase là nguyên nhân chính.

2.2. Ứng Dụng Enzyme β Galactosidase trong Sản Xuất Sữa

β-galactosidase được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sữa để sản xuất sữa nghèo lactose và các sản phẩm từ sữa khác. Enzyme này thủy phân lactose thành glucose và galactose, làm giảm hàm lượng lactose trong sản phẩm. Sữa nghèo lactose dễ tiêu hóa hơn và phù hợp cho người không dung nạp lactose. Quá trình thủy phân có thể được thực hiện bằng enzyme tự do hoặc cố định. Sữa nghèo lactose là sản phẩm quan trọng.

III. Phương Pháp Cố Định Enzyme β Galactosidase vào TSI Gel

Cố định enzyme β-galactosidase vào Thiolsulfinate-Agarose (TSI-gel) là một phương pháp hiệu quả để tăng tính ổn định và khả năng tái sử dụng của enzyme. TSI-gel tạo ra mạng lưới liên kết cộng hóa trị ổn định giữa enzyme và chất mang, ngăn chặn enzyme bị rửa trôi và duy trì hoạt tính trong quá trình sản xuất liên tục. Phương pháp này có ưu điểm là hạn chế sự thay đổi hoạt tính enzyme trong quá trình tạo gel. Nghiên cứu tập trung vào khảo sát hiệu quả cố định của TSI-gel đối với β-galactosidase và thiết kế quy trình lên men liên tục sản phẩm sữa nghèo lactose. TSI-gel là chất mang hiệu quả.

3.1. Tổng Quan về Chất Mang TSI Gel và Ưu Điểm

TSI-gel là một loại chất mang được sử dụng để cố định enzyme. Nó tạo ra mạng lưới liên kết cộng hóa trị ổn định giữa enzyme và chất mang, giúp ngăn chặn enzyme bị rửa trôi vào môi trường. TSI-gel có khả năng tạo gel mạnh ngay cả ở nồng độ thấp và có cấu trúc xốp, tạo điều kiện thuận lợi cho việc cố định enzyme. Ưu điểm của TSI-gel là hạn chế sự thay đổi hoạt tính của enzyme trong quá trình tạo gel và tăng tính ổn định của enzyme. Liên kết cộng hóa trị là yếu tố quan trọng.

3.2. Quy Trình Cố Định Enzyme β Galactosidase vào TSI Gel

Quy trình cố định enzyme β-galactosidase vào TSI-gel bao gồm các bước: chuẩn bị dung dịch enzyme, chuẩn bị dung dịch TSI-gel, trộn hai dung dịch lại với nhau để tạo gel, rửa gel để loại bỏ enzyme tự do và các chất không liên kết. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả cố định bao gồm tỷ lệ enzyme/chất mang, nồng độ TSI-gel, pH và nhiệt độ. Tối ưu hóa các yếu tố này giúp tăng hiệu suất cố định và duy trì hoạt tính của enzyme. Tối ưu hóa quy trình là cần thiết.

IV. Nghiên Cứu Tính Chất Chế Phẩm β Galactosidase Cố Định

Nghiên cứu tính chất của chế phẩm β-galactosidase cố định là cần thiết để đánh giá hiệu quả của phương pháp cố định và khả năng ứng dụng trong sản xuất. Các tính chất cần nghiên cứu bao gồm ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, khả năng bền nhiệt, động học enzyme và khả năng tái sử dụng. Kết quả nghiên cứu giúp xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme cố định và đánh giá tính ổn định của chế phẩm trong quá trình bảo quản và sử dụng. Tính chất enzyme ảnh hưởng đến ứng dụng.

4.1. Ảnh Hưởng của pH và Nhiệt Độ Lên Hoạt Tính Enzyme

pH và nhiệt độ là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính của β-galactosidase cố định giúp xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme. Thông thường, enzyme cố định có khoảng pH và nhiệt độ hoạt động ổn định rộng hơn so với enzyme tự do. pH và nhiệt độ tối ưu cần được xác định.

4.2. Khảo Sát Khả Năng Tái Sử Dụng và Độ Bền Chế Phẩm

Khả năng tái sử dụng và độ bền của chế phẩm enzyme cố định là yếu tố quan trọng đánh giá tính kinh tế của phương pháp cố định. Nghiên cứu khảo sát số lần tái sử dụng và độ bền của chế phẩm trong quá trình bảo quản giúp xác định tuổi thọ của enzyme cố định và khả năng ứng dụng trong sản xuất liên tục. Tái sử dụng giúp giảm chi phí.

V. Ứng Dụng Thiết Kế Quy Trình Sản Xuất Sữa Nghèo Lactose

Ứng dụng chính của enzyme β-galactosidase cố định là trong thiết kế quy trình sản xuất sữa nghèo lactose. Quy trình này bao gồm các bước: xử lý sữa tươi, thủy phân lactose bằng enzyme cố định, thanh trùng, đóng gói. Thiết bị phản ứng packed bed reactor (PBR) được sử dụng để chứa enzyme cố định và thực hiện quá trình thủy phân liên tục. Quy trình cần được tối ưu hóa để đảm bảo hiệu quả thủy phân lactose và chất lượng sản phẩm. Sản xuất sữa là ứng dụng quan trọng.

5.1. Thiết Kế Thiết Bị Phản Ứng Packed Bed Reactor PBR

Thiết bị PBR là một loại thiết bị phản ứng được sử dụng rộng rãi trong các quá trình enzyme cố định. Thiết bị này bao gồm một cột chứa chất mang enzyme cố định. Dòng chất phản ứng được đưa qua cột và enzyme cố định xúc tác phản ứng. Thiết kế PBR cần đảm bảo dòng chảy đều, diện tích tiếp xúc lớn và dễ dàng kiểm soát các thông số quá trình. PBR là thiết bị phản ứng hiệu quả.

5.2. Tối Ưu Hóa Quy Trình Thủy Phân Lactose Liên Tục

Tối ưu hóa quy trình thủy phân lactose liên tục bao gồm việc xác định các thông số tối ưu như nhiệt độ, pH, tốc độ dòng chảy và thời gian lưu. Các thông số này ảnh hưởng đến hiệu quả thủy phân lactose và chất lượng sản phẩm. Sử dụng các phương pháp thống kê và mô hình hóa để tối ưu hóa quy trình. Tối ưu hóa giúp tăng hiệu quả sản xuất.

VI. Kết Luận và Triển Vọng Nghiên Cứu β Galactosidase

Nghiên cứu về cố định enzyme β-galactosidase vào TSI-gel và ứng dụng trong sản xuất sữa nghèo lactose mang lại nhiều kết quả khả quan. Phương pháp này có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp sữa. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào tối ưu hóa quy trình cố định, đánh giá tính ổn định lâu dài của chế phẩm và mở rộng ứng dụng sang các lĩnh vực khác. Nghiên cứu enzyme có nhiều triển vọng.

6.1. Đánh Giá Hiệu Quả và Tính Khả Thi của Phương Pháp

Đánh giá hiệu quả và tính khả thi của phương pháp cố định enzyme β-galactosidase vào TSI-gel dựa trên các tiêu chí như hiệu suất cố định, hoạt tính enzyme, độ bền, khả năng tái sử dụng và chi phí sản xuất. So sánh phương pháp này với các phương pháp cố định khác để xác định ưu nhược điểm. Đánh giá toàn diện là cần thiết.

6.2. Hướng Nghiên Cứu và Phát Triển Trong Tương Lai

Hướng nghiên cứu và phát triển trong tương lai bao gồm: tối ưu hóa quy trình cố định, nghiên cứu các chất mang mới, mở rộng ứng dụng sang các lĩnh vực khác như sản xuất thực phẩm chức năng, dược phẩm và xử lý chất thải. Ứng dụng công nghệ sinh học và kỹ thuật di truyền để cải thiện tính chất của enzyme. Phát triển bền vững là mục tiêu.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Hiện tượng không dung nạp lactose do thiếu hụt enzyme ß-galactosidase trong hệ tiêu hóa là vấn đề sức khỏe ngày càng được quan tâm. Lactose là thành phần carbohydrate chính trong sữa, với nồng độ dao động từ 2% đến 10% (w/v) tùy nguồn gốc. Việc sử dụng enzyme ß-galactosidase để thủy phân lactose thành các đường đơn dễ tiêu hóa là giải pháp hiệu quả, đặc biệt với enzyme cố định nhằm khắc phục nhược điểm của enzyme tự do như độ bền thấp và khó tái sử dụng. Nghiên cứu này tập trung cố định enzyme ß-galactosidase vào chất mang Thiolsulfinate-Agarose (TSI-gel) nhằm nâng cao hiệu suất cố định và ổn định hoạt tính enzyme trong quá trình thủy phân lactose.

Mục tiêu chính của luận văn là khảo sát hiệu quả cố định enzyme ß-galactosidase trên TSI-gel, đánh giá các đặc tính hoạt tính, độ bền nhiệt, khả năng tái sử dụng và bảo quản của chế phẩm enzyme cố định. Đồng thời, thiết kế kỹ thuật lên men liên tục sản phẩm sữa nghèo lactose sử dụng chế phẩm enzyme cố định này. Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP.HCM, trong khoảng thời gian từ tháng 6/2013 đến tháng 5/2014.

Ý nghĩa của nghiên cứu thể hiện qua việc phát triển công nghệ enzyme cố định ứng dụng trong sản xuất sữa nghèo lactose, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng của người không dung nạp lactose, đồng thời góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất và giảm chi phí nhờ khả năng tái sử dụng enzyme. Các chỉ số đánh giá bao gồm hiệu suất cố định enzyme đạt khoảng 78%, hoạt tính enzyme cố định đạt trên 85% so với enzyme tự do, và khả năng tái sử dụng enzyme sau 9 lần vẫn giữ được gần 50% hoạt tính ban đầu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Lý thuyết enzyme cố định: Enzyme cố định là enzyme được giới hạn trên một chất mang vật lý hoặc hóa học, giữ nguyên hoạt tính xúc tác và có thể tái sử dụng nhiều lần. Ưu điểm bao gồm tăng độ bền, khả năng tái sử dụng và kiểm soát quá trình xúc tác liên tục.

• Mô hình liên kết cộng hóa trị giữa enzyme và chất mang: Phương pháp cố định enzyme bằng liên kết cộng hóa trị giữa nhóm thiol của enzyme và nhóm thiosulfinate trên agarose tạo ra mạng lưới liên kết bền vững, hạn chế enzyme bị rửa trôi và duy trì hoạt tính enzyme trong quá trình sử dụng.

• Khái niệm về ß-galactosidase và cơ chế xúc tác: Enzyme ß-galactosidase xúc tác thủy phân lactose thành glucose và galactose, với vị trí hoạt động chính là các dư lượng acid glutamic trong cấu trúc enzyme.

• Khái niệm về Thiolsulfinate-Agarose (TSI-gel): TSI-gel là chất mang agarose được biến đổi hóa học để chứa nhóm thiosulfinate, tạo điều kiện cho liên kết cộng hóa trị bền vững với enzyme chứa nhóm thiol.

• Mô hình thiết bị phản ứng sinh học Packed Bed Reactor (PBR): Thiết bị phản ứng sinh học phổ biến dùng enzyme cố định, trong đó enzyme được cố định trên các hạt gel và sữa chảy qua cột phản ứng để thủy phân lactose liên tục.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Enzyme ß-galactosidase được tinh sạch từ vi khuẩn Bacillus subtilis tái tổ hợp. Chất mang TSI-gel được tổng hợp từ agarose qua các bước hóa học tạo nhóm thiosulfinate.

• Phương pháp cố định enzyme: Enzyme được cố định vào TSI-gel với tỷ lệ enzyme:chất mang 1:9 (v/v) trong điều kiện pH 7.5 và nhiệt độ 50 °C. Hiệu suất cố định được xác định bằng định lượng protein còn lại trong dung dịch sau cố định.

• Phân tích hoạt tính enzyme: Hoạt tính enzyme được đo bằng phương pháp quang phổ sử dụng cơ chất ONPG, xác định lượng o-nitrophenol sinh ra ở bước sóng 420 nm. Hoạt tính riêng được tính theo đơn vị enzyme trên mg protein.

• Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng: Nghiên cứu ảnh hưởng của pH (6.0-7.5) và nhiệt độ (30-60 °C) lên hoạt tính enzyme cố định và enzyme tự do. Đánh giá độ bền nhiệt bằng cách ủ enzyme ở 50 °C trong 8 giờ và đo hoạt tính theo thời gian.

• Nghiên cứu động học enzyme: Xác định các thông số Km và Vmax bằng phương pháp Lineweaver-Burk với các nồng độ cơ chất ONPG khác nhau.

• Khảo sát khả năng tái sử dụng và bảo quản: Enzyme cố định được sử dụng liên tục 9 lần, đo hoạt tính sau mỗi lần sử dụng. Bảo quản enzyme ở 4 °C và 25 °C, đánh giá hoạt tính sau 5, 10, 15 và 20 ngày.

• Thiết kế kỹ thuật lên men liên tục: Thiết kế quy trình sản xuất sữa nghèo lactose sử dụng hệ thống Packed Bed Reactor chứa enzyme ß-galactosidase cố định, với các thông số vận hành dự kiến dựa trên kết quả nghiên cứu enzyme.

• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trong 11 tháng, từ tháng 6/2013 đến tháng 5/2014, bao gồm tổng hợp chất mang, cố định enzyme, khảo sát tính chất enzyme và thiết kế quy trình kỹ thuật.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Hiệu suất cố định enzyme: Với tỷ lệ enzyme:chất mang 1:9 (v/v) và nồng độ TSI-gel 2% (w/v), hiệu suất cố định ß-galactosidase đạt 78.24%. So với agarose thông thường, TSI-gel cho hiệu suất cố định cao hơn đáng kể.

2. Hoạt tính enzyme cố định: Ở điều kiện tối ưu pH 7.5 và nhiệt độ 50 °C, hoạt tính của enzyme cố định đạt 85.53% so với enzyme tự do. Enzyme cố định duy trì hoạt tính ổn định trong khoảng pH rộng hơn (6.0) và nhiệt độ hoạt động ổn định từ 40 đến 55 °C.

3. Độ bền nhiệt và tái sử dụng: Enzyme cố định giữ được 95.57% hoạt tính sau 15 ngày bảo quản ở 4 °C và còn 88% sau 20 ngày. Sau 9 lần tái sử dụng, hoạt tính enzyme còn lại là 49.06% so với ban đầu, cho thấy khả năng tái sử dụng tốt trong quy trình sản xuất liên tục.

4. Thông số động học: Enzyme cố định có giá trị Km thấp hơn enzyme tự do, cho thấy ái lực cao hơn với cơ chất ONPG, đồng thời Vmax cũng được duy trì ở mức cao, chứng tỏ hiệu quả xúc tác không bị giảm đáng kể khi cố định.

5. Thiết kế kỹ thuật lên men liên tục: Quy trình sản xuất sữa nghèo lactose được thiết kế sử dụng ba thiết bị Packed Bed Reactor đặt ở các công đoạn khác nhau trong quá trình chế biến sữa tươi, đảm bảo thủy phân lactose hiệu quả và liên tục.

Thảo luận kết quả

Hiệu suất cố định enzyme cao đạt được nhờ vào liên kết cộng hóa trị bền vững giữa nhóm thiol của enzyme và nhóm thiosulfinate trên TSI-gel, giúp enzyme không bị rửa trôi trong quá trình phản ứng. Hoạt tính enzyme cố định duy trì trên 85% so với enzyme tự do chứng tỏ phương pháp cố định không làm mất hoạt tính xúc tác quan trọng.

Phạm vi pH và nhiệt độ hoạt động rộng hơn của enzyme cố định so với enzyme tự do cho thấy sự ổn định được cải thiện, phù hợp với điều kiện sản xuất công nghiệp có thể biến động. Khả năng tái sử dụng enzyme sau 9 lần vẫn giữ gần 50% hoạt tính là lợi thế kinh tế lớn, giảm chi phí enzyme trong sản xuất.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, hiệu suất cố định và độ bền enzyme trên TSI-gel vượt trội hơn so với agarose thông thường và các chất mang khác như chitosan hay alginate. Kết quả này phù hợp với báo cáo của các nghiên cứu quốc tế về ưu điểm của TSI-gel trong cố định enzyme chứa nhóm thiol.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ thể hiện hoạt tính enzyme theo pH và nhiệt độ, biểu đồ giảm hoạt tính theo số lần tái sử dụng và thời gian bảo quản, cũng như bảng so sánh thông số động học Km và Vmax giữa enzyme tự do và cố định.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Ứng dụng quy trình cố định enzyme TSI-gel trong sản xuất công nghiệp: Khuyến nghị các nhà máy chế biến sữa áp dụng phương pháp cố định ß-galactosidase trên TSI-gel để nâng cao hiệu quả thủy phân lactose, giảm chi phí enzyme và tăng tính ổn định sản phẩm. Thời gian triển khai dự kiến 6-12 tháng.

2. Triển khai hệ thống lên men liên tục sử dụng Packed Bed Reactor: Thiết kế và lắp đặt hệ thống PBR chứa enzyme cố định tại các công đoạn chế biến sữa tươi để đảm bảo thủy phân lactose liên tục, ổn định. Chủ thể thực hiện là các doanh nghiệp sản xuất sữa với sự hỗ trợ kỹ thuật từ các viện nghiên cứu.

3. Nghiên cứu mở rộng quy mô pilot và tối ưu hóa điều kiện vận hành: Tiến hành thử nghiệm quy mô pilot để đánh giá hiệu quả thực tế, tối ưu các thông số như tốc độ dòng chảy, nhiệt độ, pH nhằm nâng cao hiệu suất thủy phân lactose. Thời gian thực hiện 12-18 tháng.

4. Phát triển sản phẩm sữa nghèo lactose đa dạng: Dựa trên công nghệ enzyme cố định, phát triển các dòng sản phẩm sữa dành cho người không dung nạp lactose, mở rộng thị trường tiêu thụ. Chủ thể thực hiện là các công ty thực phẩm và nghiên cứu thị trường.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm: Luận văn cung cấp kiến thức chuyên sâu về enzyme cố định, phương pháp tổng hợp chất mang TSI-gel và ứng dụng trong sản xuất thực phẩm.

2. Doanh nghiệp sản xuất sữa và chế biến thực phẩm: Tham khảo để áp dụng công nghệ enzyme cố định nâng cao chất lượng sản phẩm sữa nghèo lactose, giảm chi phí sản xuất và tăng tính cạnh tranh.

3. Các viện nghiên cứu và trung tâm phát triển công nghệ enzyme: Cung cấp cơ sở khoa học và dữ liệu thực nghiệm để phát triển các công nghệ enzyme cố định mới, mở rộng ứng dụng trong công nghiệp.

4. Chuyên gia và kỹ sư thiết kế quy trình công nghệ sinh học: Hướng dẫn thiết kế hệ thống lên men liên tục sử dụng enzyme cố định, tối ưu hóa quy trình sản xuất sữa nghèo lactose.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần cố định enzyme ß-galactosidase trong sản xuất sữa nghèo lactose?
   Cố định enzyme giúp tăng độ bền, khả năng tái sử dụng và ổn định hoạt tính enzyme trong quá trình thủy phân lactose, giảm chi phí và phù hợp với sản xuất liên tục.

2. Ưu điểm của Thiolsulfinate-Agarose (TSI-gel) so với agarose thông thường là gì?
   TSI-gel tạo liên kết cộng hóa trị bền vững với enzyme chứa nhóm thiol, ngăn enzyme bị rửa trôi và duy trì hoạt tính cao hơn so với agarose thông thường.

3. Hoạt tính enzyme cố định có bị giảm nhiều so với enzyme tự do không?
   Hoạt tính enzyme cố định trên TSI-gel đạt khoảng 85.53% so với enzyme tự do, cho thấy sự giảm không đáng kể và vẫn đảm bảo hiệu quả xúc tác.

4. Enzyme cố định có thể tái sử dụng bao nhiêu lần?
   Nghiên cứu cho thấy enzyme cố định giữ được gần 50% hoạt tính sau 9 lần tái sử dụng, phù hợp với quy trình sản xuất liên tục.

5. Thiết bị phản ứng nào phù hợp để ứng dụng enzyme cố định trong sản xuất sữa nghèo lactose?
   Packed Bed Reactor (PBR) là thiết bị phổ biến và hiệu quả nhất để sử dụng enzyme cố định trong quá trình thủy phân lactose liên tục.

Kết luận

• Đã thành công trong việc cố định enzyme ß-galactosidase vào Thiolsulfinate-Agarose (TSI-gel) với hiệu suất cố định đạt 78.24%.
• Enzyme cố định duy trì hoạt tính cao (85.53%) và ổn định trong khoảng pH và nhiệt độ rộng hơn so với enzyme tự do.
• Chế phẩm enzyme cố định có khả năng tái sử dụng hiệu quả, giữ được gần 50% hoạt tính sau 9 lần sử dụng và ổn định khi bảo quản ở 4 °C trong 20 ngày.
• Thiết kế kỹ thuật lên men liên tục sử dụng hệ thống Packed Bed Reactor được đề xuất để sản xuất sữa nghèo lactose hiệu quả.
• Khuyến nghị triển khai nghiên cứu mở rộng quy mô pilot và ứng dụng công nghệ trong sản xuất công nghiệp nhằm đáp ứng nhu cầu thị trường và nâng cao giá trị sản phẩm.

Hành động tiếp theo là tiến hành thử nghiệm quy mô pilot và hợp tác với doanh nghiệp để ứng dụng công nghệ enzyme cố định trong sản xuất thực tế, góp phần phát triển ngành công nghiệp sữa Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẠI HỌC QUOC GIA THÀNH PHO HO CHÍ MINH TRUONG DAI HOC BACH KHOA a DANG VAN LINH CO ĐỊNH ENZYME ÿ-GALACTOSIDASE VÀO THIOLSULFINATE- AGAROSE (TSI-GEL) VA UNG DUNG THIET KE KY THUAT LEN MEN LIEN TUC SAN PHAM SUA NGHEO LACTOSE CHUYEN NGANH: CONG NGHE SINH HOC MA NGANH: 604280 LUAN VAN THAC SI TP.HO CHI MINH, thang 08 nim 2014 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA- ĐHQG TP.HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học :. --- 2+ 52c 25252 2E se se 2£ se x2 (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét Ì : .---- 6c SE 2E Sẻ SE 8 kEE SE SE ket ve sa (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét 2 :. --- -- 6c SE 2E Ee E958 9E SEx SE key vưgsexi (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Truong Dai học Bách Khoa, DHQG Tp. HCM Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).

CHỦ TỊCH HỘI DONG TRUONG KHOA. ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Đặng Văn Linh MSHV: 12313199 Ngày, tháng, năm sinh: 28/05/1989 Nơi sinh: Đồng Nai Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số : 604280 I. TÊN DE TÀI: “Cố định enzyme ÿ-galactosidase vào Thiolsulfinate-Agarose (TSI- gel) và ứng dụng thiết kế kỹ thuật lên men liên tục sản phẩm sữa nghèo lactose” NHIỆM VU VA NOI DUNG: Khảo sát hiệu quả cố định của TSI-gel đối với B- galactosidase. Qua đó, thiết kế kỹ thuật lên men liên tục sản phẩm sữa nghèo lactose bằng chế phẩm -galactosidase cố định II.

NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 24/06/2013 II. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 23/05/2014 IV. CÁN BỘ HƯỚNG DÂN: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương. CÁN BỘ HƯỚNG DÂN Tp.

(Họ tên và chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên và chữ ký) TRƯỞNG KHOA. (Họ tên và chữ ký) LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn thay cô trong bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đại hoc Bách Khoa đã ươm mam và nuôi dưỡng em với những kiến thức cũng như những kinh nghiệm vô cùng quý báu từ khi em mới bước chân vào giảng đường Đại học cho đến ngày hôm nay. Em xin bày tỏ lòng tri ân sâu sắc đến cô PGS. Nguyễn Thúy Hương.

Cô là người đã truyền đạt và dìu dắt em đến với con đường khoa học. Cô luôn động viên và giúp đỡ em trong những lúc khó khăn nhất của cuộc sống và học tập. Nhờ sự đồng hành và những lời động viên của Cô mà ngày hôm nay em có thé hoàn thành dé tài này. Em xin gửi lời cảm ơn đến anh Trần Văn Thi, Trưởng ban QA nhà máy Sữa Dielac đã tạo điều kiện cho em vừa có thé đi học vừa có thé cống hiến sức lực, trí lực cho nhà máy.

Em cũng xin chân thành cảm ơn anh Hoàng Đình Phong, Trưởng ban QA nhà máy Sữa Bột Việt Nam đã tin tưởng và tạo điều kiện cho em hoàn thành những thí nghiệm quan trọng trong đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến bạn Lê Thị Mỹ Hương, Trưởng phòng thí nghiệm Vi sinh nhà máy Orion Việt Nam, người đã giúp đỡ em những kiến thức nên và luôn bên cạnh em giải quyết những van dé khó khăn trong dé tài. Ngoài ra, em xin cảm ơn bạn Nguyễn Huy Thoại, kỹ sư vận hành phòng rót sữa bột, nhà máy Sữa Bột Việt Nam đã hồ trợ em bản vẽ qui trình công nghệ. Và lời cuôi cùng, em xin gửi lời cảm ơn đên gia đình luôn là động lực đê em phân đấu học tập và trao dồi dao đức dé trở thành người tốt trong xã hội.

TÓM TẮT Ngày nay, hiện tượng không dung nạp lactose do sự thiếu hụt B-galactosidase trong hệ tiêu hóa của con người là vấn đề đang được quan tâm. Với sự phát triển của công nghệ enzyme, xu hướng sử dụng B-galactosidase cố định để thủy phân lactose thành các đường đơn dễ tiêu hóa trở nên phổ biến vì khả năng khắc phục được những nhược điểm của enzyme tự do. B-galactosidase được cố định bằng nhiều phương pháp khác nhau, các đặc tính của dẫn xuất thu được phụ thuộc mạnh mẽ vào các liên kết hóa học được tạo ra. Trong khi đó, thiolsulfinate-agarose (TSI- gel) được biết đến như một loại chất mang khi cố định sẽ tạo ra mạng lưới gồm những liên kết cộng hóa tri ồn định giữa enzyme và chất mang, ngăn chặn hiệu quả khả năng enzyme cố định bị rửa trôi vào môi trường.

Đặc biệt là khả năng hạn chế được sự thay đổi hoạt tính enzyme trong quá trình tao gel. Do đó, chúng tôi thực hiện nghiên cứu cố định B-galactosidase vào TSI-gel nhằm khảo sát hiệu quả cố định của TSI-gel đối với B-galactosidase. Qua đó, thiết kế kỹ thuật lên men liên tục sản phẩm sữa nghèo lactose băng chế phẩm enzyme cố định. Kết quả thu được: - - Với ty lệ enzyme: chất mang là 1: 9 (v/v), quá trình cố định B-galactosidase dat hiệu suất cao nhất 78.24 % khi nồng độ TSI- gel là 2 % (w/v).

- Trong điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu (50 °C, pH 7.5) chế phẩm B-galactosidase có định có hoạt tính đạt 85.53 % so với enzyme tự do trong điều kiện tối ưu. - Chế phẩm ÿ-galactosidase cố định ổn định trong khoảng pH và nhiệt độ rộng hơn so với j-galactosidase tự do. Khoảng pH hoạt động ốn định là 6.0 và khoảng nhiệt độ hoạt động ồn định là 40- 55 °C. - Khi khảo sát hiệu quả tái sử dụng chế phẩm -galactosidase cố định, sau 9 lần tái sử dụng hoạt tính còn 49.06 % so với hoạt tính ban đầu.

- Ché phẩm được bảo quản tốt ở 4 °C. Sau 15 ngày bảo quản ở 4 °C hoạt tính của chế phẩm cô định là 95.57 %, sau 20 ngày hoạt tính còn lại là 88. - Ngoài ra, chúng tôi đã bước dau thiết kế qui trình sản xuất sản phẩm sữa nghèo lactose với ba thiết bị phản ứng là Packed bed reactor (PBR) được đặt trong các công đoạn khác nhau của quá trình chế biến sữa tươi. ABSTRACT The phenomenon of lactose intolerance due to the lack of B-galactosidase in the mucosa of human small intestine has become an area concern recent times.

With the development of Enzyme Technology, using immobilized B- galactosidase to hydrolyze lactose to utilisable sugars that easily digested has become popular because of its ability to overcome the drawbacks of free enzyme. B-galactosidase was immobilized by different methods, the characteristics of the derivatives obtained strongly depends on the chemical bond is created. Meanwhile, thiolsulfinate- agarose (TSI- gel) is known as a support should create a matrix of covalent bonds between enzyme stability and support when immobilized, the ability to block enzyme to release into the environment effectively. Especially, it also has ability to limit the change of enzyme activity in gel process.

Therefore, we researched the immobilized B- galactosidase on thiosulfinate- agarose to investigate the effectiveness of TSI- gel on B- galactosidase. Thereby, we design the technical of continuous fermentation of lactose to apply in low lactose milk production. The results were: - With a ratio of enzyme: support is 1: 9 (v/v), the immobilized B- galactosidase is highest efficiency 78.24 % at TSI - gel concentration of 2 % (w/v). - In terms of temperature and pH optimum (50 °C, pH 7.5), the activity of immobilized B- galactosidase reached 85.53 % compared with the activity of free enzyme in optimum condition.

- Immobilized B- galactosidase is more stable over a wide temperature and range of pH than free B- galactosidase. Range of stable pH is 6.0 and range of stable temperature is 40 - 55 °C. - When surveying the effective reuse of immobilized B- galactosidase, after 9 reuse the activity was 49.06 % compared with the initial activity. - After 15 days storage at 4 °C, activity of immobilized enzyme is about 95.57 %, after 20 days still over 88.

- Design the process low lactose milk production with three Packed bed reactor (PBR) is placed in various stages of processing fresh milk. TONG QUAN TALI LITỆU.- 2 2 E9 + *E£SE£E£EE£EEESEEEeEEEevkeEexeei 3 1.1Tống quan về B- øalactOSidasSe.--- +22 22 ©E©E2EE9EE2EEEEE39E1123212723113E 21123.2 Cấu trúc ctha B- galactOSidase.3 Cơ chất của B- galactOSidase. ¿+52 ©s+ Sex EEE1EE1211211 11221.1 Giới thiệu VỀ [aCOS€. - 2 S%©Ss SE EEk ke SE SE EE cv vvtgEerkerkersrkd 5 11.2 Hiện tượng không dung nap lactose .4 Cơ chế xúc tác của B- galactosidase lên lactose .2 Tổng quan về enzyme cố Ginh.1 Khái niệm về enzyme CỐ ịnHh.

- 5° - St St E2 SE 3v vn vn gered 9 1.2 Các phương pháp cố định .----- + ¿+2 ©5£+E££E++EE££EE£EEtEEerkerrerrkerrerred 10 1.3 Tổng quan về chất mang cô định enZyme.[ Giới thiệu chung .- -- «5 se SH HH 14 1.2 Chất mang agarOSe. Chất mang thiolsulfinate- agarose .4 Tống quan về thiết bi phan ứng sinh hoc dành cho enzyme thủy phân lactose .1 Thiết bi phản ứng packed bed reactor .2 Thiết bi phan ứng fluidized bed reactor .cceccsecsssssssessesssssssessessessssseessesseeseeees 23 143 Thiết bi phan ứng membrane r©aCfOT .5 Tinh hình nghiên cứu trong nước và NYO Al NƯỚC «0.1 Các nghién cứu trong nue .2 Các nghiên cứu ngOi TƯỚC .-- 5 << + 9 9 91 1 3 ng ghe 26 CHUONG 2. VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP.1 Trang thiết bị, hóa chat, vật liệu.-------- ¿2£ Sẻ +sẻ+E£+Ee+EE+EE£EE£EE£EEEEEEEEEEEErrkrrkrrkd 28 2.1 Địa điểm và thời gian nghiên €ỨU.2 Trang thiẾt bị.3 Hóa chất và nguyên vật liỆU.2 Nội dung Nghi€n CỨU .3 Phương pháp nghiÊn CỨ U.1 Khảo sát tiền đỀ tài.2 Có định B-galactosidase vào chất mang TSI-gel. Nghiên cứu tính chất của chế phẩm B-galactosidase cố định .34 Nghiên cứu động học của B-galactOsidase .5 Khảo sát sô lân tái sử dụng và nhiệt độ bảo quan của chê phâm enzyme cô 2.6 Thiết kế kỹ thuật lên men liên tục sản phẩm sữa nghèo lactose.4 Phương pháp phân tich.1 Phương phương pháp Lowry xác định hàm lượng protein- enzyme .2 Phương pháp xác định lượng đường khử theo Miller.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme cố định.----- +2 40 244 Phương pháp tạo thiolsulfinate- aØ4fOS© .5 Phương pháp xử lý số liệu.-- ¿225252 £EE£EE+EEEEEEEEEEEErEErrkrrkrrrrrre 43 CHUONG 3.

KET QUA VA BAN LUẬN.1 Khao sát tiền dé ti.1 Định lượng protein-enZyMe .12 Xác định hoạt tính, hoạt tính riêng và các yếu tố ảnh hưởng lên §- Pal actOsidase TỰ O.2 Có định B-galactosidase vào chất mang TSI-gel .3 Nghiên cứu tính chất của chế phẩm B-galactosidase cố định.1 Ảnh hưởng của pÚH.---- 55+ ©+<+SE£SEE+EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEESEEEEEEELerrkrrkrre 51 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt đỘ.- + -- 5£ 5£ ©5<+SEEEESEE£EE+EEEEEEEEEEEEEEErkrrkrrrrrre 53 3.3 Khảo sát khả năng bền nhiệt .4 Nghiên cứu động học của -gaÌ aCfOSICÌAS.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ Chat .2 Xác định hệ số phương trình động hoc Michaelis — Menten.