CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 1. Tình hình nghiên cứu ở ngoài nước Vai trò của một số nhóm chất như: proline, glycine betaine, fructant, manitol. liên quan đến tính chống chịu của thực vật với điều kiện bất lợi của môi trường đặc biệt là hạn và mặn đã được khẳng định. Hiện nay một số gen liên quan đến chất lượng thực phẩm như gen làm tăng hàm lượng methionine (CGS), tryptophan, lysine, cysteine (SAT).
cũng đã được công bố. Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen đối với tính chống chịu và cải biến chất lượng ở lúa luôn là những nội dung nghiên cứu chính ở nhiều Viện nghiên cứu lớn trên thế giới. Có khá nhiều phương pháp để tìm kiếm các gen liên quan đến tính chống chịu như: (i) Tìm trên mạng trình tự đã công bố, thiết kế primer và nhân dòng bằng DNA của đối tượng quan tâm, sau đó so sánh trình tự và thiết kế vào vector để sử dụng; (ii) Kỹ thuật sàng lọc cDNA dựa trên nguyên tắc kích thích cho gen cần tìm hoạt động; (iii) Thông qua nghiên cứu hệ proteomics để tìm các protein mới có hoạt tính dưới tác động của điều kiện môi trường hay nhu cầu của các giai đoạn sinh trưởng phát triển bằng kỹ thuật 2D kết hợp với các phân tích khối phổ và so sánh với ngân hàng dữ liệu gen mà biết được trình tự axít amin của protein và trình tự nucleotit của gen đó. Cho đến nay, nhiều gen liên quan đến tính chống chịu đã được phân lập chủ yếu bằng các phương pháp trên và đã được ứng dụng để nâng cao tính chống chịu trên đối tượng cây thuốc lá, lúa mỳ, lúa nước.
như: gen nhaA (chịu mặn), gen HAL, gen codA, betA, nhóm gen RAB, gen P5CS, gen OAT (chịu hạn). Hiện nay Viện Sinh lý Phân tử thực vật Max - Planck, CHLB Đức đang có những nghiên cứu sâu và rất thành công về vai trò của một số hợp chất như polyamin, đường tan, axít béo.dưới điều kiện bất lợi ở lúa thông qua kỹ thuật ức chế gen bằng RNA và các phương pháp phân tích bằng quang phổ khối. Cơ sở của phương pháp như sau: Trường hợp phân lập gen, bao gồm các bước: i) Tách chiết mRNA từ các giống lúa có tính chống chịu ở các vùng sinh thái khác nhau dưới điều kiện stress và không stress. 5 ii) Tạo ngân hàng cDNA bằng enzym sao chép ngược.
iii) Tạo các vi bản trên màng chuẩn (15000). iv) Lai với cDNA không xử lý. v) Thu các dòng lai dương tính và nhân bản các dòng lai bằng PCR. vi) Đọc trình tự và thiết kế gen cho mục đích chuyển gen.
Trường hợp phân tích phổ chất: i) Tách chiết các chất từ các giống lúa xử lý và không xử lý. ii) Phân tích phổ chất bằng kỹ thuật sắc ký khí hoặc quang phổ kế. iii) So sánh phổ chất giữa giống chống chịu và giống không chống chịu trong điều kiện bất lợi và điều kiện thường. Tình hình nghiên cứu ở trong nước Hiện nay các kỹ thuật dùng để xác định sự gia tăng một số chất liên quan đến tính chống chịu ở cây lúa như proline và các đường tan.
đang được sử dụng rất hiệu quả để đánh giá tính chống chịu của cây trồng đối với điều kiện bất lợi ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới cũng đã được sử dụng ở Việt Nam. Ở Việt Nam, kỹ thuật phân lập gen đi từ cDNA cũng đã được triển khai nghiên cứu tại Viện Công nghệ Sinh học. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu tìm kiếm các gen cũng mới chỉ được tiến hành nghiên cứu ở cây đu đủ đối với bệnh vi rút đốm vòng và tính chịu hạn ở đậu tương song chưa được nghiên cứu cho các giống lúa Việt Nam. Viện Công nghệ sinh học đang xây dựng một dự án hợp tác với Viện Max Planck về Sinh học phân tử thực vật, Trường Đại học Tổng hợp Greifswald, CHLB Đức theo hướng nghiên cứu Tăng cường tính chống chịu và cải tiến chất lượng giống lúa bằng công nghệ sinh học thực vật.
Dự án được Bộ Đào tạo và Nghiên cứu Đức tài trợ về kinh phí. Kinh phí này chủ yếu dành để cán bộ của Việt Nam sang học phương pháp và làm việc ở Đức trên đối tượng là các giống lúa của Việt Nam. Sự hợp tác này là một điểm thuận lợi để chúng ta có thể nhanh chóng tiếp cận với kỹ thuật hiện đại để phân lập tìm kiếm các gen cũng như các phương pháp nghiên cứu phân tích xác định phổ các chất (polyamin, proline, axít béo, ABA.) có liên quan đến tính chịu hạn và mặn nhằm đưa ra được các phương pháp cải biến tính chống chịu ở lúa. Vì thế, việc triển khai kỹ thuật này tại Việt Nam là rất cần thiết, giúp cho Việt Nam có thêm một 6 công cụ hiện đại về Sinh học phân tử để cải biến tính chống chịu của các giống lúa Việt Nam với các điều kiện bất lợi môi trường.
Trên cơ sở của những phương pháp này, những nghiên cứu tương tự sẽ được triển khai trên một số đối tượng cây trồng khác như ngô và đậu tương. Mục tiêu của đề tài Tìm kiếm, đánh giá, phân lập và sử dụng các gen nhằm nâng cao khả năng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa và chất lượng tinh bột của hạt gạo thông qua các kỹ thuật phân tử và biến nạp gen. Các mục tiêu cụ thể i) Nghiên cứu vai trò của polyamin đối với khả năng chống chịu điều kiện ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa thông qua các kỹ thuật ức chế gen bằng RNA. ii) Nghiên cứu phát hiện các gen điều khiển tính chịu hạn và chịu muối bằng phổ phiên mã RNA từ những giống lúa chống chịu.
iii) Phân tích phổ trao đổi chất ở rễ của các giống lúa (chống chịu và không chống chịu với hạn và muối) trong điều kiện stress bằng kỹ thuật sắc ký khí/quang phổ khối. iv) Chuyển gen tăng cường tính chịu hạn và mặn, tăng cường hàm lượng axít amin vào cây lúa. Trong nội dung hợp tác của dự án với Đức có phần nghiên cứu thực hiện tại Việt Nam từ 2002 đến 2005. Các nội dung của đề tài được thực hiện tốt nhờ sự hỗ trợ kinh phí của Bộ dành cho việc đón tiếp chuyên gia bạn sang làm việc và gửi cán bộ sang Đức làm việc để thực hiện các nội dung nghiên cứu tại Việt Nam.
7 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2. Đối tượng và thiết bị nghiên cứu 2. Vật liệu nghiên cứu Các giống lúa: Tổng số có 33 giống lúa được sử dụng trong các thí nghiệm (Bảng 2.1), các giống thí nghiệm được gieo trồng tại nhà lưới Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội, Việt Nam và tại nhà kính tại Viện MPI, Golm, CHLB Đức. Các giống lúa C71, DR2 và Taipei được dùng để chuyển gen.
Vector: Vector dùng để chuyển gen quan tâm là pCAMBIA1390/Ubill và pCAMBIA1300. Chủng vi khuẩn LBA4404 mang vector chuyển gen quan tâm.1: Các giống lúa được sử dụng trong các nghiên cứu của đề tài Khả năng chịu Khả năng chịu Giống số Giống Nguồn gốc hạn* mặn* 1 CR203 x x Việt Nam 2 DR2 x x Việt Nam 3 Lốc x Việt Nam 4 C70 x x Việt Nam 5 C71 x x Việt Nam 6 Pokkali x IRRI 7 Đốc đỏ x Việt Nam 8 Đốc phụng x Việt Nam 9 Sabita x IRRI 10 NSG19 x IRRI 13 K. Lúa Nương x Việt Nam 14 Cườm x x Việt Nam 15 Khẩu chăm x Việt Nam 16 Khẩu hom x Việt Nam 17 Khẩu nón x Việt Nam 18 Trà lĩnh x Việt Nam 19 Nếp mèn x Việt Nam 20 Lốc dâu x Việt Nam 8 21 Nước mặn x Việt Nam 22 Lúa mặn x x Việt Nam 23 Nếp mặn x Việt Nam 24 Nước mặn 2 x Việt Nam 25 Nước mặn 1 x Việt Nam 26 Chăm x Việt Nam 27 Chăm biển x Việt Nam 28 Cha va x Việt Nam 29 LC-93-1 x Việt Nam 30 LC-93-2 x Việt Nam 31 LC-93-4 x Việt Nam 50 Nipponbare x x Nhật 51 Taipei x x Đài Loan 52 IR57311 x x IRRI 53 Songhua x x Trung Quốc Ghi chú: * Tính chống chịu hạn và mặn theo mô tả trong lý lịch giống 2. Các thiết bị chính Các thiết bị chính phục vụ nghiên cứu bao gồm: i) Thiết bị nuôi trồng và xử lý mô, cây: Phytotron, bàn cấy vô trùng, buồng nuôi cấy mô, nhà kính trồng cây.
ii) Thiết bị phân tích: Khối phổ, máy PCR, máy lai và đọc DNA array, máy đọc trình tự gen. Nội dung nghiên cứu 2. Tìm kiếm và phân lập các gen làm gia tăng hàm lượng polyamin thông qua kỹ thuật ức chế gen bằng RNA Phía Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam i) Đánh giá khả năng chịu hạn và chịu muối NaCl của ít nhất 20 giống lúa Indica của Việt Nam có khả năng chống chịu khác nhau thông qua phép thử chịu hạn và chịu muối. ii) Xác định hàm lượng PA (Putrescine, Spermidine, Spermine .) và mối tương quan của chúng đến tính chống chịu ở 20 giống lúa trên theo phương pháp của viện MPI.
9 Phía Viện MPI MPP, CHLB Đức i) Thiết kế các gen ức chế từ RNA tách chiết được từ các giống có tính chống chịu cao. Phát hiện các gen điều khiển tính chịu hạn và muối bằng phổ phiên mã RNA Phía Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam i) Chọn 4 giống lúa có tính chịu hạn (CR203; DR2, DR3, Lốc) và 5 giống lúa có tính chịu muối (Cườm; CR203, NN8; SR26; SR59) từ các giống lúa Indica của Việt Nam. ii) Thiết lập thư viện cDNA từ rễ, lá, phôi hạt. của các giống lúa có tính chống chịu hạn và muối cao (xử lý stress và không xử lý).
iii) Thu nhận, nhân dòng, đọc trình tự và so sánh các dòng lai cDNA. Phía Viện MPI MPP, CHLB Đức i) Tạo các vi bản của 10 000-15 000 dòng cDNA từ mỗi thư viện cDNA trên. ii) Nhân bản 10 000-15 000 dòng cDNA bằng phản ứng PCR. iii) Tạo các bản màng chuẩn mang 15 000 cDNA.
iv) Chuyển RNA lên màng chuẩn. v) Tiến hành lai 15 000 cDNA (không xử lý) với cDNA (đã xử lý) trên bản màng chuẩn để phát hiện các dòng lai cDNA. Kỹ thuật sao chép gen Phía Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam i) Thiết kế mồi để nhân các đoạn gen từ DNA hoặc cDNA (rễ, lá, cây con). ii) Nhân dòng bằng kit TA.
iii) Tạo các vi bản trên màng chuẩn và lai với cDNA tách từ các giống chống chịu hạn và mặn trong điều kiện stress. iv) Thu nhận các dòng lai dương tính để đọc trình tự gen.