Tổng quan luận án

Cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack), thuộc họ Thanh thất (Simaroubaceae), là loài thảo dược có vùng phân bố tự nhiên tại các tỉnh miền Trung, Kon Tum, Đồng Nai, đảo Phú Quốc và Vườn quốc gia Bái Tử Long (Việt Nam), cùng một số quốc gia Đông Nam Á. Trong y học cổ truyền và dược lý học hiện đại, cây Bá bệnh được ghi nhận chứa nhiều hợp chất alkaloid và quassinoid có giá trị sinh học cao như khả năng kích thích tăng tiết testosterone nội sinh, kháng viêm, gây độc tế bào ung thư, điều trị sốt rét, chống loãng xương và hạ đường huyết. Tuy nhiên, trước nhu cầu tiêu thụ dược liệu ngày càng gia tăng, nguồn tài nguyên Bá bệnh ngoài tự nhiên đang bị khai thác triệt để, dẫn đến nguy cơ cạn kiệt. Cây có chu kỳ sinh trưởng kéo dài, đòi hỏi từ 5 đến 6 năm nuôi trồng mới có thể thu hoạch rễ đạt tiêu chuẩn hoạt chất.

Phương pháp nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật in vitro (mô sẹo, huyền phù tế bào) thường bắt buộc bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, làm gia tăng nguy cơ tồn dư hóa chất trong chế phẩm dược liệu. Nuôi cấy rễ tơ chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes khắc phục được nhược điểm trên nhờ khả năng sinh trưởng nhanh, ổn định về mặt di truyền và phát triển liên tục trên môi trường hoàn toàn không chứa chất điều hòa sinh trưởng. Mặc dù vậy, rễ tơ Bá bệnh khi nuôi cấy in vitro trong điều kiện thông thường lại tổng hợp hàm lượng alkaloid nội sinh rất thấp do thiếu các yếu tố kích kháng ngoại cảnh. Việc nghiên cứu ứng dụng các chất kích kháng (elicitor) nhằm thúc đẩy tích lũy alkaloid và mở rộng quy mô sản xuất sinh khối rễ tơ Bá bệnh trên hệ thống thiết bị phản ứng sinh học (bioreactor) dung tích lớn vẫn là khoảng trống nghiên cứu chưa được thực hiện trước đó.

Luận án tiến sĩ với đề tài "Nghiên cứu tăng cường tích luỹ một số alkaloid có hoạt tính sinh học từ sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 20 lít" xác lập 4 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Khảo sát hoạt tính sinh học của các alkaloid phân lập từ rễ tơ cây Bá bệnh để tìm ra những hoạt tính mới.
  2. Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu để rễ tơ cây Bá bệnh sinh trưởng và phát triển.
  3. Xác định nồng độ của ba elicitor (Salicylic acid, Jasmonic acid và Yeast extract) lên quá trình sản xuất và tích lũy các alkaloid phân lập được từ rễ tơ cây Bá bệnh in vitro.
  4. Xây dựng được hệ thống bioreactor 20 lít để nhân sinh khối rễ tơ.

Nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm 3 phần chính:

  • Nội dung 1: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cao chiết alkaloid trong sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh.
  • Nội dung 2: Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sinh trưởng rễ tơ và sự tích lũy ba hợp chất alkaloid gồm: chất (1) 7-methoxy-(9H-β-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic acid (7-MCPA), chất (2) 9-methoxycanthin-6-one, và chất (3) 9-hydroxycanthin-6-one trong rễ tơ cây Bá bệnh.
  • Nội dung 3: Xây dựng kỹ thuật nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh trên hệ thống bioreactor 20 lít; đánh giá hàm lượng ba hợp chất alkaloid (1), (2), (3) có trong sinh khối rễ tơ bioreactor so với rễ cây thu hái tự nhiên.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Sinh khối khô (90 g) và mẫu rễ tơ sống cây Bá bệnh nuôi cấy trên môi trường thạch (do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp); mẫu rễ tự nhiên thu thập tại Vườn quốc gia Bái Tử Long, khu Bảo tồn thiên nhiên Đồng Sơn - Kỳ Thượng, Hoành Bồ, tỉnh Quảng Ninh (mẫu tiêu bản ký hiệu BTL11 lưu giữ tại Viện Công nghệ sinh học); các dòng tế bào ung thư (KB, MCF-7, HepG2, LU-1); các dòng tế bào đánh giá kháng viêm (RAW264.7, THP-1, đại thực bào phúc mạc chuột C57BL/6 WT).
  • Phạm vi nghiên cứu: Thực nghiệm công nghệ sinh học và hóa thực vật in vitro, nuôi cấy pilot trên hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu dung tích 20 lít.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án tổng quan hệ thống các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về phân loại thực vật học, thành phần hóa học, dược lý học của cây Bá bệnh, cũng như công nghệ nuôi cấy rễ tơ và hệ thống phản ứng sinh học:

  • Các công trình về hóa học và hoạt tính sinh học của Bá bệnh:
    • Kuo và cs (2004) phân lập từ rễ Bá bệnh các hợp chất canthin-6-one alkaloid gồm 9-methoxycanthin-6-one và canthin-6-one, chứng minh độc tính tế bào đối với dòng ung thư phổi A-549 và ung thư vú MCF-7.
    • Trần Thị Vân Anh và cs phân lập eurycomalide C cùng 27 hợp chất (quassinoid, alkaloid, coumarin, phenolic), chứng minh 9-methoxycanthin-6-one, 9-hydroxycanthin-6-one, 1-methoxycarbonyl-β-carboline và 9,10-dimethoxycanthin-6-one có hoạt tính ức chế yếu tố phiên mã NF-κB với các giá trị $\text{IC}_{50}$ lần lượt là 29,3; 3,8; 7,4 và 19,5 µM. Đồng thời phân lập các alkaloid mới như n-pentyl-β-carboline-1-propionate, 5-hydroxymethyl-9-methoxycanthin-6-one, 1-hydroxy-9-methoxycanthin-6-one.
    • K. Miyake và cs (2010) phân lập 4,9-dimethoxycanthin-6-one và 10-hydroxy-11-methoxycanthin-6-one cùng 37 hợp chất từ thân cây Bá bệnh, thử nghiệm gây độc trên dòng tế bào sợi HT-1080 với giá trị $\text{IC}_{50}$ của 9,10-dimethoxycanthin-6-one và 10-hydroxy-9-methoxycanthin-6-one lần lượt là 5,0 và 7,2 µM.
    • K. Mitsunaga và cs (1994) xác định cấu trúc các canthin-6-one alkaloid từ vỏ và thân Bá bệnh bằng phổ NMR 1D và 2D.
    • L.B. Kardono và cs (1991) chiết tách rễ cây Bá bệnh tại Kalimantan (Indonesia), thu nhận 9-methoxycanthin-6-one, 9-methoxycanthin-6-one-N-oxide, 9-hydroxycanthin-6-one, β-carboline-1-propionic acid và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào.
    • Về tác dụng hạ đường huyết, Husen và cs thử nghiệm dịch chiết nước rễ Bá bệnh trên mô hình chuột đái tháo đường do Streptozotocin, ghi nhận liều 150 mg/kg làm hạ đường huyết rõ rệt.
  • Các công trình về nuôi cấy rễ tơ và bioreactor:
    • Takayama và Misawa (1981) đề xuất hệ thống bioreactor sục khí phục vụ nuôi cấy mô tế bào thực vật.
    • Son và cs thiết kế bioreactor dạng cầu cho sinh khối tế bào Taxus cuspidata và nhân sinh khối rễ sâm Hàn Quốc đạt 2,2 kg rễ tươi sau 42 ngày nuôi cấy trong bình 20 lít chứa 240 g rễ ban đầu (cao gấp 3 lần so với bioreactor cánh khuấy).
    • Sevon (2002) tổng kết các alkaloid dược liệu được sản xuất từ rễ tơ. Lodhi (1996) chuyển gen isochorismate synthase vào rễ tơ Rubia peregrina L. làm tăng tích lũy anthraquinone. Banerjee nghiên cứu rễ tơ Atropa belladonna mang gen P450 2E1.
    • Ali và cs (2008) nghiên cứu tác động của nồng độ oxy và $\text{CO}_2$ đến sinh trưởng và tổng hợp ginsenoside trong bioreactor rễ sâm Panax ginseng.
    • Nghiên cứu nuôi cấy rễ tơ Plumbago indica thu nhận plumbagin đạt 7,8 mg/g khối lượng khô; nuôi cấy rễ tơ Arachis hypogaea L. kích thích tích lũy resveratrol tăng gần 60 lần khi bổ sung elicitor.
    • Tại Việt Nam: Hà Thị Loan và cs tạo rễ tơ Sâm Ngọc Linh tổng hợp saponin MR2, Rb1, Rg1; Phan Trung Hải và cs cảm ứng tạo rễ tơ cây Hoa Móng tay bằng các chủng A. rhizogenes CO2, C18, C26; Phạm Bích Ngọc và cs (2013) nghiên cứu tạo rễ tơ thành công từ cây Bá bệnh.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn: Các nghiên cứu trước đây đối với cây Bá bệnh chủ yếu dừng lại ở việc chiết tách từ nguồn cây mọc hoang dại và khảo sát cảm ứng tạo rễ tơ ở quy mô ống nghiệm nhỏ. Luận án giải quyết toàn diện việc xác định cấu trúc hợp chất alkaloid mới, đánh giá các hoạt tính sinh học mới (kháng viêm chuyên sâu thông qua ức chế cytokine IL-6 và TNF-α, độc tế bào), thiết lập quy trình kích kháng bằng elicitor (JA, SA, YE) và xây dựng hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu dung tích 20 lít để sản xuất sinh khối rễ tơ giàu hoạt chất.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về biến dưỡng thứ cấp thực vật, cơ chế chuyển gen cảm ứng rễ tơ bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes (sự xâm nhập và biểu hiện của các đoạn gen rol và aux từ plasmid Ri kích thích tổng hợp auxin nội sinh IAA tạo hệ thống lông rễ phát triển phân nhánh mạnh), và cơ chế truyền tín hiệu phòng vệ thực vật thông qua chất kích kháng (elicitor sinh học và phi sinh học tương tác với thụ thể tế bào, kích hoạt con đường tín hiệu điều hòa biểu hiện gen sinh tổng hợp enzyme biến dưỡng thứ cấp).

[Mẫu rễ tơ Bá bệnh khô (90 g)]
[Cao chiết MeOH tổng (13,5 g)]
                                                                                                    [Cao chiết alkaloid toàn phần (651 mg)]
                                                                      [Chất (2): 9-methoxycanthin-6-one]   [Chất (3): 9-hydroxycanthin-6-one]   [Chất (1) mới: 7-MCPA]
                                                                                   (96,0 mg)                           (15,0 mg)                          (29,6 mg)

Hệ thống phương pháp thực nghiệm bao gồm:

  • Phương pháp chiết tách và phân lập:
    • Cân 90 g sinh khối khô rễ tơ Bá bệnh, chiết siêu âm với methanol 3 lần, cô đuổi dung môi thu 13,5 g cao methanol. Hòa cặn trong dung dịch HCl 10% (pH = 4), chiết phân bố với ethyl acetate loại tạp kém phân cực.
    • Kiềm hóa pha nước bằng dung dịch NaOH 10% đến pH = 10, chiết phân bố lại bằng ethyl acetate thu 651 mg cao alkaloid base toàn phần.
    • Phân tách bằng sắc ký cột silica gel (cỡ hạt 0,063–0,1 mm cho cột tổng và 0,040–0,063 mm cho cột tinh chế) với hệ dung môi giải phóng gradient $\text{CH}_2\text{Cl}_2/\text{CH}3\text{OH}$ (25:1 đến 20:1) kết hợp sắc ký lớp mỏng phân tích trên bản nhôm silica gel $60\text{ F}{254}$ (Merck, độ dày 0,2 mm), soi đèn tử ngoại bước sóng 254 nm, 365 nm và hiện màu bằng dung dịch $\text{H}_2\text{SO}_4$ 10% hơ nóng.
  • Phương pháp xác định cấu trúc hóa học: Đo điểm nóng chảy trên máy BUCHI Melting Point B545; đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT, HSQC, HMBC, $^1\text{H}$-$^1\text{H}$-COSY) trên máy Bruker Avance 500 MHz; phổ khối lượng ESI-MS, HR-ESI-MS.
  • Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học:
    • Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư (KB, MCF-7, HepG2, LU-1): Sử dụng phương pháp nhuộm Sulforhodamine B (SRB) theo chuẩn NCI (Monks, 1991). Tế bào nuôi cấy trong môi trường DMEM (MCF-7 bổ sung 1% insulin), ủ 48 giờ với chất thử ở các nồng độ 0,8; 4; 20; 100 µg/ml. Cố định tế bào bằng TCA, nhuộm SRB, đo mật độ quang OD tại bước sóng 515 nm trên máy đọc Bio-Rad ELISA Plate Reader. Chất đối chứng dương: Ellipticine (0,08–10 µg/ml); đối chứng âm: DMSO 10%. Tính $\text{IC}_{50}$ bằng phần mềm TableCurve.
    • Thử hoạt tính kháng viêm in vitro / ex vivo: Đánh giá khả năng ức chế sản xuất cytokine gây viêm IL-6 và TNF-α trên ba hệ thống tế bào gồm dòng macrophage chuột RAW264.7, dòng monocyte người THP-1 (biệt hóa bám dính bằng PMA 100 ng/ml trong 24 giờ), và đại thực bào màng bụng thu từ chuột thuần chủng C57BL/6 WT (tiêm TGC gây viêm phúc mạc trong 3 ngày). Tế bào được kích thích bởi LPS (Escherichia coli 055:B5, nồng độ 1 µg/ml). Đo độ sống sót tế bào bằng phép thử MTT (đo OD tại 550 nm); định lượng nồng độ cytokine IL-6 và TNF-α bằng bộ kit ELISA Quantikine (R&D Systems); tính giá trị $\text{IC}_{50}$ bằng phần mềm ImageJ 1.
  • Phương pháp định lượng HPLC-DAD: Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200, đầu dò DAD đặt bước sóng phát hiện 272 nm. Cột phân tích Zorbax Eclipse XDB-C18 (kích thước 4,6 x 250 mm, kích thước hạt 5 µm). Nhiệt độ cột duy trì ở 25°C; tốc độ dòng 0,5 ml/phút; thể tích tiêm mẫu 10 µl; nồng độ mẫu thử 10 mg/ml. Pha động acetonitrile (ACN) – nước với chương trình gradient: 0 phút (10% ACN), 10 phút (20% ACN), 35 phút (50% ACN), 45 phút (90% ACN), 60 phút (90% ACN).
  • Phương pháp bố trí thí nghiệm nuôi cấy: Thí nghiệm tiến hành trong phòng nuôi cấy nhiệt độ 25 ± 1°C, độ ẩm 75–80%, môi trường chỉnh pH 5,8 ± 0,1, khử trùng nhiệt độ 117°C trong 15 phút. Khảo sát các biến thể: trạng thái môi trường (thạch 2,5 g/l gelrite so với lỏng lắc 80 vòng/phút), chế độ chiếu sáng (sáng 2500–3000 lux so với tối hoàn toàn), chiều dài đoạn cắt rễ (0,2–0,4 cm; 0,6–0,8 cm; 1,0–1,2 cm), khối lượng cấy ban đầu (0,1; 0,2; 0,3; 0,4 g tươi/100 ml), môi trường khoáng cơ bản (MS, WPM, SH bổ sung 1 g/l myo-inositol và 30 g/l sucrose).
  • Phương pháp kích kháng (elicitation): Bổ sung Jasmonic acid (JA: 1, 4, 8, 16 mg/l), Salicylic acid (SA: 5, 10, 20, 40 mg/l), Yeast extract (YE: 0, 10, 20, 40, 80 mg/l) vào môi trường nuôi cấy lỏng.
  • Hệ thống Bioreactor 20 lít tự chế tạo: Thiết kế dạng sủi bọt hình cầu từ bình chứa 20 lít (chứa 9,8 lít môi trường hoạt động), trang bị hệ thống cấp và thoát khí qua màng lọc vô trùng Millipore 0,2 µm, quả sục khí, dây dẫn silicon chịu áp phi 8, nuôi cấy chu kỳ 30 ngày.
  • Xử lý số liệu: Bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên lặp lại 3 lần. Số liệu biểu diễn dưới dạng Trung bình ± Độ lệch chuẩn (Mean ± SD). Phân tích kiểm định thống kê Student's t-test với ngưỡng ý nghĩa $p \le 0,05$ trên phần mềm Microsoft Excel.

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Tổng quan tài liệu

Chương I tổng hợp đầy đủ cơ sở lý luận thực vật học, nguồn gốc và phân bố của Eurycoma longifolia Jack; hệ thống hóa các nhóm hoạt chất hóa học phân lập được từ rễ, thân, lá của loài này bao gồm các dẫn xuất quassinoid (eurycomanone, 13α,21-dihydroeurycomanone, eurycomanol, eurycomalactone, laurycolactone), các canthin-6-one alkaloid (9-methoxycanthin-6-one, 9-hydroxycanthin-6-one, canthin-6-one-N-oxide), các β-carboline alkaloid, và các squalene/tirucallane triterpene. Chương I cũng điểm lại tác dụng dược lý dân gian và hiện đại như khả năng tăng cường sinh lực nam giới, kháng sốt rét ký sinh trùng Plasmodium falciparum, kháng viêm qua ức chế con đường tín hiệu NF-κB, ức chế tăng sinh tế bào ung thư người và hạ đường huyết.

Bên cạnh đó, chương I phân tích sâu về cơ chế chuyển gen thông qua A. rhizogenes, động học sinh trưởng rễ tơ, ưu thế không cần chất điều hòa sinh trưởng, và cơ chế tác động của các elicitor (JA, SA, YE) lên quá trình truyền tín hiệu kích thích sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp. Chương I phân tích đặc điểm kỹ thuật của các loại bioreactor (cánh khuấy, sục khí, ngập chìm tạm thời, sủi bọt dạng cầu), chỉ rõ bioreactor sủi bọt dạng cầu ít tạo lực xé cơ học, phù hợp nhất cho nuôi cấy rễ tơ quy mô lớn.

Nhóm hoạt chất Hợp chất tiêu biểu Bộ phận phân lập Tác dụng dược lý ghi nhận trong văn bản
Quassinoids Eurycomanone, Eurycomanol, Eurycomalactone, Laurycolactones A-B Rễ, Lá Tăng sản xuất testosterone, kháng ký sinh trùng P. falciparum, ức chế NF-κB, gây độc tế bào ung thư phổi A-549, ung thư vú MCF-7, tế bào HT-1080
Canthin-6-one alkaloids 9-Methoxycanthin-6-one, 9-Hydroxycanthin-6-one, 9,10-Dimethoxycanthin-6-one Rễ, Thân, Vỏ Gây độc tế bào ung thư (A-549, MCF-7, KB, HT-1080), kháng viêm, ức chế NF-κB, kháng sốt rét, chống loét dạ dày
$\beta$-Carboline alkaloids 7-Hydroxy-$\beta$-carboline-1-propionic acid, 1-Methoxymethyl-$\beta$-carboline Rễ Kháng sốt rét P. falciparum, kháng viêm thông qua ức chế con đường NF-κB
Triterpenes Eurylene, Teurilene, Pasakbumin A-D, Niloticin Rễ, Thân Gây độc tế bào ung thư KB, A-549, MCF-7, chống ung thư bạch cầu, chống loét

Chương II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương II mô tả chi tiết toàn bộ các đối tượng nguyên liệu sinh học, quy trình phân lập hóa học, hệ thống thiết bị và phương pháp sinh học thực nghiệm. Từ 90 g sinh khối khô rễ tơ Bá bệnh ban đầu, qua quy trình chiết siêu âm phân bố acid - base đã thu được 651 mg cao chiết alkaloid toàn phần. Quy trình sắc ký cột silica gel tiếp tục phân tách tinh chế thu được ba hợp chất sạch: chất (1) 7-MCPA thu nhận 29,6 mg; chất (2) 9-methoxycanthin-6-one thu nhận 96,0 mg; chất (3) 9-hydroxycanthin-6-one thu nhận 15,0 mg.

Chương này cũng thiết lập chi tiết điều kiện vận hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC-DAD (quy trình ĐK-Bb) phục vụ định tính và định lượng ba hợp chất alkaloid dựa trên đường chuẩn tương quan diện tích pic với nồng độ chất chuẩn. Các hệ thống thử nghiệm độc tính tế bào SRB trên 4 dòng ung thư và thử nghiệm ELISA định lượng cytokine IL-6/TNF-α trên 3 hệ tế bào đại thực bào chuột và người được chuẩn hóa cụ thể. Chương II đồng thời mô tả cấu tạo, thông số kỹ thuật lắp ráp và quy trình vận hành hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu dung tích 20 lít.

Chương III: Kết quả và thảo luận

Chương III trình bày toàn bộ các phát hiện thực nghiệm và thảo luận kết quả của đề tài:

  • Xác định cấu trúc hóa học:
    • Hợp chất (1) là một alkaloid mới được phân lập lần đầu tiên từ rễ tơ cây Bá bệnh, có danh pháp hóa học: 7-methoxy-(9H-β-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic acid (7-MCPA), dạng bột vô định hình màu vàng chanh, hấp thụ UV ở 254 nm, hiện màu vàng với thuốc thử $\text{H}_2\text{SO}_4$ 10%. Dữ liệu phổ $^1\text{H}$-NMR (500 MHz, $\text{DMSO-}d_6$) ghi nhận các tín hiệu đặc trưng tại $\delta$ 3,92 ppm (s, $-\text{OCH}_3$).
    • Hợp chất (2) được xác định là 9-methoxycanthin-6-one (dạng kết tinh hình nón màu vàng cam, bắt UV 254 và 365 nm).
    • Hợp chất (3) là 9-hydroxycanthin-6-one (dạng bột vô định hình màu vàng, bắt UV 254 nm).
  • Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập:
    • Độc tính trên dòng tế bào ung thư: Hợp chất (1) 7-MCPA và (2) 9-methoxycanthin-6-one thể hiện hoạt tính gây độc tế bào rõ rệt trên các dòng ung thư người gồm KB (biểu mô vi), MCF-7 (ung thư vú), HepG2 (ung thư gan) và LU-1 (ung thư phổi). Hợp chất (3) 9-hydroxycanthin-6-one thể hiện hoạt tính chọn lọc trên dòng ung thư phổi LU-1.
    • Hoạt tính kháng viêm: Cả ba hợp chất (1), (2), (3) ức chế mạnh sự sản xuất hai cytokine tiền viêm quan trọng là IL-6 và TNF-α trên các tế bào đại thực bào RAW264.7, THP-1 và đại thực bào phúc mạc chuột C57BL/6 được kích hoạt bởi LPS, với dải giá trị $\text{IC}_{50}$ ghi nhận từ 0,95 đến 16,0 µM.
Hoạt chất phân lập Dòng tế bào ung thư nhạy cảm Hoạt tính kháng viêm (ức chế IL-6 và TNF-$\alpha$)
Chất (1): 7-MCPA (Hợp chất mới) KB, MCF-7, HepG2, LU-1 Ức chế mạnh trên RAW264.7, THP-1 và macrophage chuột ($\text{IC}_{50}$: 0,95–16,0 µM)
Chất (2): 9-methoxycanthin-6-one KB, MCF-7, HepG2, LU-1 Ức chế mạnh trên RAW264.7, THP-1 và macrophage chuột ($\text{IC}_{50}$: 0,95–16,0 µM)
Chất (3): 9-hydroxycanthin-6-one LU-1 Ức chế mạnh trên RAW264.7, THP-1 và macrophage chuột ($\text{IC}_{50}$: 0,95–16,0 µM)
  • Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy rễ tơ in vitro:
    • Trạng thái môi trường: Nuôi cấy lỏng lắc (tốc độ lắc 80 vòng/phút) cho tốc độ tăng trưởng sinh khối và phân nhánh rễ tơ vượt trội so với môi trường thạch bổ sung 2,5 g/l gelrite.
    • Chế độ chiếu sáng: Nuôi cấy trong điều kiện tối hoàn toàn giúp rễ tơ phát triển sinh khối tốt hơn điều kiện chiếu sáng (2500–3000 lux).
    • Kích thước mẫu cấy ban đầu: Mẫu rễ tơ cắt đoạn chiều dài 0,6–0,8 cm cho tỷ lệ sống, khả năng phát sinh đầu sinh trưởng và tăng sinh khối cao hơn so với đoạn ngắn (0,2–0,4 cm) và đoạn dài (1,0–1,2 cm).
    • Mật độ mẫu cấy ban đầu: Lượng rễ tươi ban đầu từ 0,2 đến 0,3 g/100 ml môi trường lỏng là mật độ tối ưu nhất để đạt tỷ lệ tăng trưởng sinh khối cao sau 30 ngày nuôi cấy.
    • Môi trường khoáng cơ bản: So sánh ba hệ môi trường MS, WPM và SH (bổ sung 1 g/l myo-inositol, 30 g/l sucrose), môi trường khoáng WPM (McCown’s Woody Plant) thể hiện ưu thế vượt trội nhất cả về tích lũy sinh khối rễ tươi/khô lẫn khả năng tích lũy ba hợp chất alkaloid (1), (2) và (3).
  • Tác động của các elicitor lên sự tích lũy alkaloid:
    • Jasmonic acid (JA): Nồng độ JA tối ưu ở mức 8 mg/l, kích thích tăng sinh tổng hợp và tích lũy các hợp chất alkaloid cao nhất so với các nồng độ 1, 4 và 16 mg/l.
    • Salicylic acid (SA): Bổ sung SA ở nồng độ 5 mg/l kích thích tích lũy hàm lượng alkaloid tối ưu; các nồng độ cao hơn (10, 20, 40 mg/l) có xu hướng kìm hãm sinh trưởng sinh khối rễ.
    • Yeast extract (YE): Dịch chiết nấm men ở nồng độ 40 mg/l cho hiệu quả kích kháng tích lũy alkaloid cao nhất trong các nghiệm thức khảo sát (10, 20, 40, 80 mg/l).
  • Nuôi cấy sinh khối trên hệ thống Bioreactor 20 lít:
    • Hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu 20 lít (chứa 9,8 lít môi trường WPM tối ưu) hoạt động ổn định, kiểm soát tốt sục khí vô trùng, không gây đứt gãy mô rễ do lực xé thấp.
    • Sau 30 ngày nuôi cấy, rễ tơ sinh trưởng mạnh, phát triển thành khối rễ dày đặc.
    • Phân tích sắc ký HPLC và sắc ký lớp mỏng TLC so sánh sinh khối rễ tơ thu từ bioreactor 20 lít với mẫu rễ Bá bệnh tự nhiên (thu hái tại Bái Tử Long, Quảng Ninh) khẳng định: rễ tơ nuôi cấy trong bioreactor có khả năng tổng hợp đầy đủ cả ba alkaloid chính với hàm lượng tích lũy đạt mức cao, chứng minh tính khả thi trong sản xuất sinh khối thay thế rễ tự nhiên.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về khoa học và lý luận

  • Phân lập và xác định đầy đủ cấu trúc hóa học của một hợp chất alkaloid mới từ cao chiết sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh là 7-methoxy-(9H-β-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic acid (7-MCPA).
  • Bổ sung dẫn liệu khoa học mới về hoạt tính sinh học của ba alkaloid (7-MCPA, 9-methoxycanthin-6-one, 9-hydroxycanthin-6-one):
    • Khám phá hoạt tính kháng viêm mạnh thông qua cơ chế ức chế sản xuất hai cytokine tiền viêm IL-6 và TNF-α trên dòng tế bào chuột RAW264.7, tế bào người THP-1 và đại thực bào phúc mạc chuột với giá trị $\text{IC}_{50}$ trong khoảng 0,95–16,0 µM.
    • Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của chất (1) 7-MCPA và chất (2) 9-methoxycanthin-6-one trên các dòng tế bào KB, MCF-7, HepG2, LU-1, cùng hoạt tính của chất (3) 9-hydroxycanthin-6-one trên dòng ung thư phổi LU-1.

Đóng góp mới về thực tiễn và công nghệ

  • Lần đầu tiên xác lập hoàn chỉnh bộ thông số nuôi cấy in vitro tối ưu cho sinh trưởng sinh khối và tích lũy alkaloid ở rễ tơ Bá bệnh: trạng thái môi trường lỏng lắc (80 vòng/phút), nuôi cấy trong tối, mẫu cấy ban đầu dài 0,6–0,8 cm với khối lượng 0,2–0,3 g tươi/100 ml, nền môi trường khoáng WPM.
  • Xác định được nồng độ tối ưu của ba chất kích kháng elicitor (JA ở mức 8 mg/l, SA ở mức 5 mg/l, YE ở mức 40 mg/l) giúp nâng cao hàm lượng các hoạt chất 7-MCPA, 9-methoxycanthin-6-one và 9-hydroxycanthin-6-one trong rễ tơ.
  • Thiết kế, lắp ráp và làm chủ quy trình vận hành hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu dung tích 20 lít (chứa 9,8 lít môi trường) để nhân sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh đạt năng suất cao sau chu kỳ 30 ngày nuôi cấy.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

  • Ứng dụng quy trình nuôi cấy sinh khối rễ tơ trên hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu quy mô pilot và công nghiệp nhằm tạo nguồn nguyên liệu sạch, đồng nhất, không tồn dư chất điều hòa sinh trưởng, thay thế việc khai thác tàn phá cây Bá bệnh ngoài tự nhiên phục vụ công nghiệp dược phẩm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế:
    • Các thử nghiệm dược lý đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư và kháng viêm mới thực hiện ở quy mô in vitro trên các dòng tế bào và ex vivo trên đại thực bào màng bụng chuột, chưa tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng mở rộng trên cơ thể động vật sống (in vivo).
    • Quy mô thiết bị bioreactor tự chế tạo mới dừng ở dung tích 20 lít quy mô phòng thí nghiệm/pilot, chưa khảo sát các hệ thống thiết bị quy mô công nghiệp lớn hơn (từ 100 lít đến 1000 lít).
    • Nghiên cứu chưa đi sâu giải mã chi tiết các con đường truyền tín hiệu phân tử và sự biểu hiện ở mức độ phiên mã (gen) liên quan đến quá trình kích kháng tổng hợp alkaloid khi xử lý elicitor.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Nâng cấp quy mô bioreactor lên các thể tích lớn hơn phục vụ sản xuất thương mại hóa.
    • Nghiên cứu quy trình nuôi cấy hai giai đoạn (giai đoạn nhân nhanh sinh khối và giai đoạn kích kháng tích lũy hoạt chất tối đa) kết hợp kiểm soát tự động chế độ cấp khí $\text{O}_2/\text{CO}_2$.
    • Triển khai các thử nghiệm dược lý in vivo trên mô hình động vật đối với hợp chất mới 7-MCPA và các chế phẩm cao chiết rễ tơ thu từ bioreactor.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo cho các đối tượng và lĩnh vực cụ thể:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học, giảng viên chuyên ngành: Công nghệ sinh học thực vật, Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Dược học và Sinh lý thực vật.
  • Các nhà nghiên cứu và kỹ sư công nghệ sinh học: Tham khảo phương pháp thiết kế, lắp ráp và vận hành hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu dung tích 20 lít nhằm nuôi cấy rễ tơ và rễ bất định của các loài cây dược liệu quý khác.
  • Các viện nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất dược phẩm: Tham khảo quy trình chiết tách chọn lọc cao alkaloid, quy trình định lượng đồng thời ba alkaloid chuẩn trên HPLC-DAD (quy trình ĐK-Bb), và chiến lược ứng dụng chất kích kháng (elicitor) JA, SA, YE để tối ưu hóa năng suất hoạt chất dược liệu sạch in vitro.

Câu hỏi thường gặp

1. Hợp chất mới nào lần đầu tiên được phân lập và xác định cấu trúc từ rễ tơ cây Bá bệnh trong luận án?
Đó là hợp chất (1) có danh pháp hóa học là 7-methoxy-(9H-β-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic acid (viết tắt là 7-MCPA), thuộc nhóm β-carboline alkaloid, dạng bột vô định hình màu vàng chanh, được phân lập từ phân đoạn sắc ký cột F12 với khối lượng thu nhận là 29,6 mg.

2. Nồng độ tối ưu của ba chất kích kháng (elicitor) được xác định trong luận án là bao nhiêu?
Nồng độ tối ưu của ba elicitor giúp tăng cường tích lũy alkaloid trong rễ tơ Bá bệnh bao gồm: Jasmonic acid (JA) ở nồng độ 8 mg/l; Salicylic acid (SA) ở nồng độ 5 mg/l; và Dịch chiết nấm men (Yeast extract - YE) ở nồng độ 40 mg/l.

3. Hệ thống bioreactor sử dụng để nhân sinh khối rễ tơ Bá bệnh có cấu tạo và thông số vận hành như thế nào?
Luận án sử dụng hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu dung tích 20 lít (chứa 9,8 lít môi trường lỏng WPM), trang bị hệ thống sục khí vô trùng qua màng lọc Millipore 0,2 µm và quả sục. Cấu trúc dạng cầu giúp giảm thiểu tối đa lực xé cơ học, tạo điều kiện cho rễ tơ sinh trưởng mạnh mẽ sau chu kỳ nuôi cấy 30 ngày.

4. Hoạt tính kháng viêm của ba alkaloid phân lập được đánh giá trên các hệ thống tế bào nào và đạt kết quả ra sao?
Hoạt tính kháng viêm được đánh giá thông qua khả năng ức chế sản xuất hai cytokine tiền viêm IL-6 và TNF-α kích thích bởi LPS trên ba hệ tế bào: dòng macrophage chuột RAW264.7, dòng tế bào người THP-1 và đại thực bào phúc mạc chuột C57BL/6 WT. Cả ba chất (1), (2), (3) đều thể hiện hoạt tính kháng viêm mạnh với giá trị $\text{IC}_{50}$ trong khoảng từ 0,95 đến 16,0 µM.

5. Điều kiện môi trường khoáng và chế độ nuôi cấy in vitro nào thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của rễ tơ cây Bá bệnh?
Điều kiện tối ưu được xác định gồm: môi trường khoáng cơ bản WPM (McCown’s Woody Plant) bổ sung 1 g/l myo-inositol và 30 g/l sucrose, nuôi cấy ở trạng thái lỏng lắc (80 vòng/phút), duy trì trong điều kiện tối hoàn toàn ở nhiệt độ 25 ± 1°C, pH 5,8, với đoạn rễ cấy ban đầu dài 0,6–0,8 cm và khối lượng cấy 0,2–0,3 g tươi/100 ml môi trường.

Kết luận

Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc một hợp chất mới 7-MCPA cùng hai canthin-6-one alkaloid từ rễ tơ cây Bá bệnh, chứng minh các hoạt tính gây độc tế bào ung thư và ức chế cytokine tiền viêm IL-6, TNF-α với $\text{IC}_{50}$ từ 0,95 đến 16,0 µM. Công trình đã chuẩn hóa toàn diện quy trình nuôi cấy rễ tơ in vitro trên môi trường WPM lỏng lắc trong tối kết hợp bổ sung các elicitor JA (8 mg/l), SA (5 mg/l) và YE (40 mg/l) để nâng cao tích lũy hoạt chất. Luận án đã thiết kế và vận hành thành công hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu 20 lít, tạo ra nguồn sinh khối rễ tơ sạch giàu alkaloid tương đương rễ tự nhiên, cung cấp giải pháp công nghệ khả thi nhằm thay thế nguồn dược liệu tự nhiên đang bị cạn kiệt.