CHƯƠNG 1. Tổng quan về acid shikimic 1.1 Công thức hóa học, tính chất Công thức hóa học : C7H10O5 Công thức cấu tạo : Hình 1.1 Công thức cấu tạo acid shikimic Tên khoa học : acid (3R,4S,5R) – 3,4,5 – trihydroxy -1-cyclohexen -1- carboxylic. Phân tử lượng : 174,15. Tính chất : Acid Shikimic là một chất kết tinh màu trắng, rất dễ tan trong nước (18g/100mL), tan trong methanol, ethanol tuyệt đối (2,25g/100mL), không tan trong ethylacetat, aceton, cloroform, benzen, ether dầu hỏa.
Nhiệt độ nóng chảy : 183 – 184,50C. Năng suất quay cực []18 = -183,8 (C = 4,03/ H2O). Dung dịch acid Shikimic trong ethanol có cực đại hấp thụ ở 213 nm [32] 1.2 Nguồn gốc acid shikimic Acid shikimic được chiết xuất lần đầu tiên bởi Eykman từ 1 loại hồi Nhật Bản shikimi-no-ki (tên khoa học là Illicium religiosum Sieb. Do đó tên acid shikimic xuất phát từ tên loài hồi này [6],[29],[32].
2 Luan van thac si Acid shikimic có trong nhiều loài cây, vi sinh vật và có vai trò then chốt trong quá trình sinh tổng hợp. Nhưng chỉ có một số ít loài thực vật có chứa một lượng đáng kể acid shikimic trong đó quan trọng nhất là Đại hồi (Illicium verum). Cho đến nay đã có nhiều tài liệu nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ Đại hồi với tỉ lệ hàm lượng acid shikimic chiết được từ 5 – 7%. Năm 2005, Richard Payne đã chiết tách và phân lập được 7% acid shikimic từ Đại hồi [25].
Ở Việt Nam cũng đã có một số nghiên cứu chiết tách acid shikimic tương tự. Nguyễn Quyết Chiến và cộng sự (2006) đã phân lập được 7,02 % acid shikimic từ hồi Việt Nam ( I. Nguyễn Đình Luyện và cộng sự (2006) thực hiện nghiên cứu chiết tách acid shikimic tại trường đại học Dược – Hà Nội cho tỉ lệ acid shikimic từ 5 - 7% [6]. Ngoài ra acid shikimic có thể được chiết xuất từ hạt của quả sau sau (chi Liquidambar) rất phổ biến ở Bắc Mỹ, với hiệu suất khoảng 2 – 4% [18].
Một số loài thực vật khác có chứa acid shikimic bao gồm nho, táo, bạch quả (Ginkgo biloba), liễu (Salix nigra), một số cây thuộc chi Eucalyptus (E.citriodora), đinh hương (Syzygium aromaticum, Myrtaceae), quả cây lý gai ( chi Gooseberry), cây việt quất châu Mỹ và châu Âu (Vaccinium macrocarpon, V. Ngoài ra, acid shikimic còn có thể được tổng hợp hoặc bán tổng hợp. Raphael (1960) và Smissman (1959) đã tổng hợp acid Shikimic từ 1,3-butadien-1,4-diyl diacetate qua phản ứng Diels Alder (hình 1. Grewe (1964) và cộng sự tổng hợp acid Shikimic từ 1,3-butadien.
Ngoài ra, acid shikimic có thể được tổng hợp từ benzen, bán tổng hợp từ acid quinic và D-manose (hình 1. 3 Luan van thac si Hình 1.2: Sơ đồ tổng hợp acid shikimic theo Raphael (1960) và Smissman (1959) Hình 1.3: Sơ đồ tổng hợp Acid Shikimic theo Dangschat, G.3 Vai trò acid shikimic Trong tự nhiên, acid shikimic là một nguyên liệu cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp các acid amin thơm như L-phenylalanin, L-tyrosin và L-tryptophan hay các chất có nhân thơm trong cây ( flavonoid, coumarin), indol và các dẫn chất, một số alcaloid, tanin, lignin, acid p-aminobenzoic thông qua con đường Shikimat (hình 1. 4 Luan van thac si Hình 1.4: Sơ đồ con đường Shikimat 5 Luan van thac si Acid shikimic là nguyên liệu tổng hợp hóa học của acid triacetyl shikimic có tác dụng chống kết tập tiểu cầu và huyết khối bằng cách tác động lên sự chuyển hóa acid arachidonic [21]. Acid 6-fluoroshikimic là một dẫn chất của acid shikimic được sử dụng như một chất kháng khuẩn và diệt ký sinh trùng hiệu quả.
Vì vậy acid shikimic có thể đóng vai trò quan trọng tạo ra thuốc bao gồm thuốc kháng khuẩn, kháng virus, diệt ký sinh trùng [17]. Đặc biệt, trong những năm gần đây, acid shikimic trở thành nguồn nguyên liệu quan trọng để tổng hợp oseltamivir có vai trò ức chế enzym neuraminidase – một enzym cần cho quá trình giải phóng và lây lan virus từ các tế bào bị nhiễm. Hoạt chất Oseltamivir có tác dụng trên virus cúm type A và type B đặc biệt với chủng H5N1 [13]. Kim và cộng sự (1997) đã tìm ra con đường tổng hợp oseltamivir từ acid shikimic.
Trong quá trình này nhóm 3-isopenyl ete được tạo ra bằng phản ứng mở vòng tritylaziridin và xúc tác acid, cho phép tạo ra các hợp chất có cấu trúc tương tự bằng cách thay đổi các tác nhân nucleophin. Tiếp sau đó, Rohloff và cộng sự (hãng Gilead) đã xây dựng được phương pháp tổng hợp có hiệu quả và có thể triển khai ở qui mô pilot. Hiệu suất tổng thể của phản ứng là 21% với 10 công đoạn phản ứng [2],[27] Sau khi hãng Gilead nhượng lại bản quyền phát minh cho hãng Roche, Federspiel cùng các cộng sự ở hãng Roche đã giữ nguyên phương hướng tổng hợp này và nghiên cứu các phương pháp để nâng cấp qui mô sản xuất và nâng cao hiệu suất tổng hợp. Kết quả đã hoàn thiện được qui trình tổng hợp epoxit ( một hợp chất quan trọng trong tổng hợp oseltamivir) theo 6 công đoạn đạt hiệu suất tổng thể 63 - 65%.
Phương pháp này được hãng Roche áp dụng để sản xuất quy mô công nghiệp [2]. Tuy nhiên, sự thiếu hụt nguồn nguyên liệu đã làm cho việc sản xuất thuốc Tamiflu (Oseltamivir) bị ngưng trệ dẫn đến sự khan thuốc trong năm 2005. Các 6 Luan van thac si phương pháp sinh tổng hợp và tổng hợp hóa học nhằm sản xuất thuốc Tamiflu đang được đẩy mạnh nghiên cứu và đã có nhiều thành công. Phương pháp sinh tổng hợp acid shikimic bằng con đường lên men chủng vi khuẩn Escherichia coli đột biến đã được mô tả bởi John W.Frost và cộng sự (đại học Michigan).
Hiệu suất của quá trình lên men này có thể đạt được từ 20 - 50g acid shikimic trong 1L môi trường. Một công trình tương tự được thực hiện ở Nga nhờ sử dụng chủng đột biến của vi khuẩn Bacillus. Hiệu suất từ 3 - 17g/L. Một nghiên cứu nữa ở Nhật Bản lên men chủng đột biến vi khuẩn Citrobacter cho hiệu suất từ 4 - 10g/L [14].
Những nỗ lực nghiên cứu về acid shikimic vẫn tiếp tục nhằm góp phần tạo nguồn nguyên liệu ổn định cho việc sản xuất thuốc phòng chống cúm trong trường hợp xảy ra đại dịch. Tuy nhiên cho đến nay các phương pháp chiết xuất acid shikimic từ Đại hồi đều trải qua quá trình tinh chế bằng trao đổi ion phức tạp, tốn kém khi áp dụng cho quy mô sản xuất công nghiệp. Vì vậy cần phải có nghiên cứu các phương pháp chiết xuất, tinh chế đơn giản, hiệu quả, và kinh tế hơn.2 Tổng quan về Đại hồi và một số phương pháp chiết xuất acid shikimic từ Đại hồi 1.1 Vài nét về cây Đại hồi Cây Đại hồi còn có tên khác là Đại hồi hương hay bát giác hồi hương. Tên khoa học là Illicium verum Hook.
Đặc điểm thực vật: cây Đại hồi là cây gỗ nhỡ, cao 6 - 10m. Thân thẳng to, cành thẳng, nhẵn, lúc non màu lục nhạt sau chuyển sang màu nâu xám. Lá mọc so le, phiến lá nguyên, dày, cứng giòn, nhẵn bóng, dài 8 - 12cm, rộng 3 - 4cm, hình mác hoặc trứng thuôn, hơi nhọn đầu, mặt trên xanh bóng hơn mặt dưới. Hoa mọc đơn độc ở nách lá, có khi xếp 2 - 3 cái, cuống to và ngắn, 5 lá đài màu trắng có mép màu hồng, 5 - 6 cánh hoa đều nhau màu hồng thẫm.
Quả kép 7 Luan van thac si gồm 6 - 8 đại, xếp thành hình sao đường kính 2,5 - 3cm, lúc non màu lục, khi già màu nâu sẫm, mỗi đại dài 10 - 15mm, có mũi nhọn ngắn ở đầu. Hạt hình trứng, nhẵn bóng. Toàn cây, nhất là quả có mùi thơm và vị nóng. Mùa hoa: Tháng 5 - 6; mùa quả: Tháng 7 - 9 hoặc tháng 11 – 12 [5].
Bộ phận dùng: Quả chín phơi khô của cây Hồi (Illicium verum). Phân bố: Cây Hồi có ở một số tỉnh miền núi phía bắc nước ta, chủ yếu ở Lạng Sơn [5]. Một số nới khác cũng có nhưng không đáng kể như Hà Giang, Tuyên Quang, hoặc ở Quảng Tây, Quảng Đông (Trung Quốc). Thu hái: Thu hái vào mùa thu.
Để nguyên dùng hoặc cất lấy tinh dầu. Lá thu hái quanh năm, dùng tươi. Thành phần hoá học: quả hồi chứa nhiều tinh dầu, nếu cất bằng phương pháp kéo hơi nước từ quả hồi tươi thì đạt hàm lượng 3 - 3,5% tinh dầu lỏng, không màu hoặc màu vàng nhạt, có mùi thơm đặc biệt. Thành phần chủ yếu của tinh dầu hồi là anethol (80 - 85%), ngoài ra con có a-pinen, d-pinen, l-phel- landren, safrol, terpineol, limonen.
Trong quả hồi còn có các chất như chất nhầy, đường. Hạt hồi chỉ chứa dầu béo. Lá hồi cũng chứa tinh dầu nhưng độ đông đặc hơi thấp hơn. Hạt hồi không mùi, chứa nhiều dầu béo [5].
Công dụng: Đại hồi được sử dụng nhiều trong cả Đông y và Tây y. Trong Đông y, Đại hồi có vị cay, tính ôn, mùi thơm, có tác dụng khử hàn, ấm kinh, kiện tỳ, khai vị, trừ đờm, tiêu thực, chỉ thống , giải độc, kháng khuẩn. Quy vào 4 kinh Can, Thận, Tỳ, Vị. Thường dùng chữa nôn mửa, đầy bụng, đau bụng, tiêu chảy, tay chân nhức mỏi, giải độc thức ăn, dị ứng.
Ngoài ra còn dùng quả hồi ngâm rượu cùng với một số dược liệu khác để xoa bóp chữa tê thấp, nhức mỏi [9]. Tây y cũng đã sử dụng quả hồi làm thuốc trung tiện, kích thích tiêu hóa, lợi sữa. Có tác dụng trên hệ thống thần kinh và cơ (giảm đau, giảm co thắt ruột), được dùng trong các bệnh lý đau dạ dày, ruột. Tuy nhiên, không nên dùng quá 8 Luan van thac si nhiều sẽ bị ngộ độc với các triệu chứng say, run tay chân, xung huyết não và phổi, có khi co giật như động kinh.
Tinh dầu hồi có tác dụng kích thích, làm dễ tiêu, chống co giật, ức chế sự lên men ruột, long đờm và lợi tiểu nhẹ, là thành phần các thuốc trị ho, thuốc xoa bóp ngoài da, thuốc trị bệnh nấm da và ghẻ [5]. Nguyên nhân ngộ độc do nguồn gốc nguyên liệu hồi không đảm bảo, có thể bị nhiễm loài hồi Nhật Bản Illicium anisatum và cây hồi núi Illicium griffithii [5],[23]. Hai loài hồi này đều có chứa chất độc và dễ bị nhầm lẫn với Đại hồi do đặc điểm bên ngoài của quả giống nhau. Hồi Nhật Bản chứa anisatin, shikimin và sikimitoxin, là các chất gây ra các thương tổn nghiêm trọng cho thận, đường tiết niệu và các cơ quan tiêu hóa [22],[23].
Các hợp chất khác tồn tại trong các loài có độc tính của chi Illicium là safrol và eugenol các chất này không được tìm thấy trong Đại hồi ( I.verum) và chúng được sử dụng để xác định việc làm giả Đại hồi [5]. Tinh dầu hồi có tác dụng kích thích, làm dễ tiêu, chống co giật, ức chế sự lên men ruột, long đờm và lợi tiểu nhẹ.