Luận văn thạc sĩ vnua bước đầu tuyển chọn một số chủng vi sinh vật ức chế nấm neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long

Luận văn thạc sĩ vnua nghiên cứu tuyển chọn vi sinh vật ức chế nấm neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long.

• Tác giả: Hà Thị Thúy
• Người hướng dẫn: TS. Lương Hữu Thành
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật
• Đề tài: Bước Đầu Tuyển Chọn Một Số Chủng Vi Sinh Vật Ức Chế Nấm Neoscytalidium Dimidiatum Gây Bệnh Đốm Nâu Trên Cây Thanh Long
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
• 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
• 4. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 5. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
• 5.1. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

Tóm tắt

I. Tổng quan về tuyển chọn vi sinh vật ức chế nấm Neoscytalidium dimidiatum

Cây thanh long (Hylocereus undatus) là một trong những cây ăn quả quan trọng tại Việt Nam, nhưng đang phải đối mặt với nhiều loại bệnh, trong đó có bệnh đốm nâu do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra. Bệnh này không chỉ ảnh hưởng đến năng suất mà còn làm giảm chất lượng quả, gây thiệt hại lớn cho người trồng. Việc nghiên cứu và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng ức chế nấm gây bệnh là cần thiết để phát triển các biện pháp sinh học hiệu quả trong bảo vệ cây trồng.

1.1. Tình hình bệnh đốm nâu trên cây thanh long

Bệnh đốm nâu do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra, có thể lây lan nhanh chóng và gây thiệt hại nghiêm trọng cho cây thanh long. Tỷ lệ nhiễm bệnh có thể lên đến 50% trong các vườn thanh long kinh doanh. Việc phát hiện sớm và áp dụng biện pháp phòng trừ kịp thời là rất quan trọng.

1.2. Vai trò của vi sinh vật trong kiểm soát bệnh

Vi sinh vật đối kháng có khả năng cạnh tranh dinh dưỡng và sản sinh các chất ức chế nấm gây bệnh. Việc sử dụng vi sinh vật trong nông nghiệp không chỉ giúp giảm thiểu hóa chất độc hại mà còn bảo vệ môi trường và phát triển nông nghiệp bền vững.

II. Thách thức trong việc kiểm soát bệnh đốm nâu trên cây thanh long

Mặc dù có nhiều biện pháp phòng trừ bệnh đốm nâu, nhưng hiệu quả vẫn chưa cao. Việc sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật không phải lúc nào cũng mang lại kết quả tích cực và có thể gây ô nhiễm môi trường. Do đó, cần tìm kiếm các giải pháp thay thế hiệu quả hơn.

2.1. Hạn chế của biện pháp hóa học

Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật có thể gây ra nhiều tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người. Hơn nữa, nấm bệnh có thể phát triển kháng thuốc, làm giảm hiệu quả của các biện pháp hóa học.

2.2. Khó khăn trong việc phát hiện bệnh sớm

Việc phát hiện bệnh đốm nâu ở giai đoạn đầu là rất khó khăn. Nhiều khi bệnh đã phát triển mạnh mới được phát hiện, dẫn đến thiệt hại lớn cho cây trồng.

III. Phương pháp tuyển chọn vi sinh vật ức chế nấm Neoscytalidium dimidiatum

Nghiên cứu đã áp dụng nhiều phương pháp để phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng ức chế nấm gây bệnh. Các phương pháp này bao gồm phân lập từ mẫu đất, nuôi cấy trong môi trường thích hợp và đánh giá hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật.

3.1. Phân lập và nuôi cấy vi sinh vật

Các mẫu đất được thu thập từ các vườn thanh long và được phân lập vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy thích hợp. Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy và đánh giá khả năng ức chế nấm gây bệnh.

3.2. Đánh giá hoạt tính sinh học của vi sinh vật

Hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật được đánh giá thông qua các thí nghiệm kiểm tra khả năng ức chế nấm Neoscytalidium dimidiatum. Kết quả cho thấy một số chủng vi sinh vật có khả năng ức chế mạnh mẽ.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu đã tuyển chọn được ba chủng vi sinh vật có khả năng ức chế nấm Neoscytalidium dimidiatum, bao gồm A3, B7 và C4. Các chủng này không chỉ có khả năng ức chế nấm mà còn giúp cây thanh long phát triển tốt hơn trong điều kiện nhiễm bệnh.

4.1. Hiệu quả của các chủng vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật A3, B7 và C4 đã cho thấy hiệu quả giảm bệnh đáng kể, với tỷ lệ giảm bệnh lên đến 81,1% sau 60 ngày nhiễm bệnh. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của các chủng vi sinh vật này trong sản xuất.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Việc áp dụng các chủng vi sinh vật đối kháng trong sản xuất thanh long không chỉ giúp kiểm soát bệnh đốm nâu mà còn nâng cao năng suất và chất lượng quả, góp phần phát triển bền vững ngành nông nghiệp.

V. Kết luận và triển vọng tương lai

Nghiên cứu về tuyển chọn vi sinh vật ức chế nấm Neoscytalidium dimidiatum đã mở ra hướng đi mới trong việc kiểm soát bệnh đốm nâu trên cây thanh long. Các chủng vi sinh vật được tuyển chọn có tiềm năng lớn trong việc phát triển các chế phẩm sinh học phục vụ sản xuất nông nghiệp.

5.1. Tương lai của nghiên cứu vi sinh vật đối kháng

Nghiên cứu cần tiếp tục mở rộng để tìm kiếm thêm nhiều chủng vi sinh vật mới có khả năng ức chế nấm gây bệnh, từ đó phát triển các sản phẩm sinh học hiệu quả hơn.

5.2. Định hướng phát triển sản phẩm sinh học

Cần có các nghiên cứu sâu hơn về khả năng sản xuất chế phẩm từ các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn, nhằm đưa vào ứng dụng thực tiễn trong sản xuất nông nghiệp.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Năm 2014, diện tích canh tác thanh long tại Việt Nam đạt 35.665 ha với tổng sản lượng trên 614.000 tấn, đóng góp tới 61,4% trong tổng kim ngạch xuất khẩu 307 triệu USD của ngành rau quả tươi cả nước. Tuy nhiên, sự bùng phát của bệnh đốm nâu (còn gọi là bệnh đốm trắng hay nấm tắc kè) do nấm Neoscytalidium dimidiatum đã gây ra tổn thất nghiêm trọng. Tỷ lệ vườn bị nhiễm bệnh dao động phổ biến từ 10% đến 50%, nhiều diện tích thiệt hại hoàn toàn về năng suất do quả bị biến dạng, thối hỏng và mất giá trị thương phẩm. Việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học không mang lại hiệu quả bền vững mà còn gây ô nhiễm môi trường, phá vỡ cân bằng sinh thái và đe dọa tiêu chuẩn an toàn thực phẩm xuất khẩu.

Trước thực trạng đó, đề tài tập trung nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng bản địa có hoạt tính ức chế mạnh nấm Neoscytalidium dimidiatum. Mục tiêu trọng tâm là xác định các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn an toàn sinh học và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy làm tiền đề cho sản xuất chế phẩm sinh học quy mô thương mại.

Nghiên cứu được triển khai thực nghiệm từ 90 mẫu đất vùng rễ tại ba vùng chuyên canh thanh long trọng điểm gồm Bình Thuận, Long An và Tiền Giang, tiến hành tại Viện Môi trường Nông nghiệp trong giai đoạn 2014 đến tháng 12 năm 2016. Kết quả thực nghiệm trong điều kiện nhà lưới chứng minh các chủng tuyển chọn có khả năng làm giảm tỷ lệ bệnh từ 73,9% đến 81,1%, tạo bước đột phá trong chiến lược quản lý dịch hại tổng hợp và phát triển chuỗi giá trị thanh long xuất khẩu bền vững.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên nền tảng lý thuyết kiểm soát sinh học (Biological Control) và lý thuyết cân bằng sinh thái vùng rễ (Rhizosphere Microbial Ecology). Cơ chế hoạt động của vi sinh vật đối kháng đối với nấm bệnh thực vật được phân tích toàn diện qua ba trục tương tác:

• Kháng sinh sinh học (Antibiosis): Khả năng tiết các hoạt chất trao đổi chất thứ cấp nhằm kìm hãm sự phân chia tế bào hoặc tiêu diệt sợi nấm bệnh.
• Cạnh tranh sinh thái (Competition): Sự cạnh tranh trực tiếp về không gian định cư vùng rễ và nguồn dưỡng chất thiết yếu (carbon, nitơ, sắt thông qua siderophore).
• Ký sinh và phân giải enzym (Parasitism & Lysis): Sự sản sinh các phức hệ enzym ngoại bào như cellulase, chitinase và protease nhằm phá hủy màng và thành tế bào nấm gây hại.

Các khái niệm chuyên ngành then chốt được chuẩn hóa bao gồm: tác nhân gây bệnh chuyên tính (Neoscytalidium dimidiatum thuộc họ Botryosphaeriaceae), vi sinh vật đối kháng (antagonistic microorganisms), đường kính vòng ức chế (inhibition zone) và đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony Forming Unit - CFU).

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập từ 90 mẫu đất tầng canh tác ở độ sâu 10-20 cm tại ba tỉnh Bình Thuận, Long An và Tiền Giang (khu vực chiếm 93% diện tích và 95% sản lượng thanh long cả nước). Phương pháp chọn mẫu phân tầng theo địa bàn chuyên canh đại diện được áp dụng nhằm thu thập tối đa sự đa dạng của hệ vi sinh vật vùng rễ.

Quy trình phân tích và đánh giá gồm:

• Sàng lọc hoạt tính đối kháng: Sử dụng phương pháp đục lỗ thạch khuếch tán đối kháng theo tiêu chuẩn 10TCN 714-2005 và 10TCN 876-2006. Đây là phương pháp tối ưu để đo lường chính xác đường kính vòng vô khuẩn in vitro.
• Định danh sinh học phân tử: Tách chiết ADN tổng số, khuếch đại và giải trình tự đoạn gen 16S rRNA bằng máy giải trình tự tự động ABI-377, sau đó so sánh mức độ tương đồng trên ngân hàng gen quốc tế NCBI/EMBL qua thuật toán BLAST.
• Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo trong nhà lưới: Bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCBD) gồm 8 công thức, 5 lần nhắc lại, mỗi hộp xốp chứa 15 kg đất khử trùng ở áp suất 1,5 atm trong 1,5 giờ và trồng 6 hom giống thanh long sạch bệnh. Mật độ dịch huyền phù vi sinh vật xử lý đạt chuẩn $10^8$ CFU/ml.
• Xử lý số liệu: Đánh giá tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-38:2010/BNNPTNT, xử lý thống kê bằng phần mềm IRRISTAT 5.0 và Excel.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình sàng lọc từ 90 mẫu đất ban đầu đã ghi nhận 30 chủng vi sinh vật có khả năng kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum. Trong đó, đề tài đã tuyển chọn được 3 chủng xuất sắc nhất mang ký hiệu A3, B7 và C4:

• Hiệu lực ức chế in vitro: Cả 3 chủng đều tạo đường kính vòng ức chế nấm bệnh vượt trội trên 2,0 cm. Cụ thể, chủng B7 đạt vòng ức chế 2,3 cm; chủng A3 đạt 2,2 cm và chủng C4 đạt 2,1 cm trên môi trường thạch nhân tạo.
• Định danh loài chính xác: Phân tích trình tự gen 16S rRNA cho thấy chủng A3 tương đồng 100% (1500/1500 bp) với Streptomyces fradiae; chủng B7 tương đồng 100% (1414/1414 bp) với Bacillus polyfermenticus; chủng C4 tương đồng 99% (1333/1339 bp) với Bacillus velezensis. Cả 3 chủng đều thuộc Nhóm an toàn sinh học cấp 1 (Risiko gruppe 1) theo phân loại của Liên minh Châu Âu.
• Đa hoạt tính sinh học có lợi: Các chủng tuyển chọn đều sở hữu hoạt tính phân giải mạnh xenluloza, tinh bột và hòa tan phốt phát khó tan $Ca_3(PO_4)_2$, hỗ trợ cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng.
• Kiểm soát bệnh trong nhà lưới: Sau 60 ngày lây nhiễm nấm bệnh nhân tạo, công thức xử lý Streptomyces fradiae A3 và Bacillus polyfermenticus B7 cho hiệu quả giảm bệnh đạt 81,1%, trong khi công thức xử lý Bacillus velezensis C4 đạt hiệu quả giảm bệnh 73,9% so với công thức đối chứng chỉ nhiễm nấm bệnh.

Thảo luận kết quả

Hiệu quả giảm bệnh vượt bậc (đạt 81,1% sau 60 ngày) là minh chứng cho cơ chế tác động kép của các chủng vi sinh vật hữu ích. Hoạt chất kháng sinh tự nhiên cùng các enzym phân giải ngoại bào đã trực tiếp phá hủy cấu trúc sợi nấm và ngăn chặn sự nảy mầm của bào tử nấm N. dimidiatum. Khi so sánh với các nghiên cứu trước đây về việc sử dụng thuốc hóa học Mancozeb hay Carbendazim chỉ làm giảm tạm thời chỉ số bệnh, giải pháp vi sinh vật thể hiện tính ổn định lâu dài nhờ khả năng định cư và duy trì mật độ cao trong đất.

Dữ liệu thực nghiệm sinh trưởng khi trình bày qua biểu đồ cột thể hiện rõ mật độ vi sinh vật duy trì ổn định ở mức $10^7$ - $10^8$ CFU/g đất sau 50 ngày theo dõi. Đồng thời, bảng ma trận phân tích điều kiện nuôi cấy chỉ ra khoảng nhiệt độ tối ưu là 30°C đến 37°C, độ pH thích hợp từ 6,0 đến 7,5 và lưu lượng cấp khí từ 0,5 đến 0,7 lít/lít môi trường/phút. Điều này khẳng định tiềm năng thích ứng hoàn hảo của các chủng vi sinh vật đối kháng này với điều kiện khí hậu nhiệt đới tại các vùng chuyên canh thanh long Việt Nam.

Đề xuất và khuyến nghị

• Hoàn thiện công nghệ lên men chế phẩm sinh học: Viện Môi trường Nông nghiệp cùng các viện nghiên cứu chuyên ngành cần tối ưu hóa quy trình lên men xốp và lên men dịch thể cho 3 chủng Streptomyces fradiae A3, Bacillus polyfermenticus B7 và Bacillus velezensis C4. Mục tiêu là đạt mật độ tế bào sống trên $10^9$ CFU/g trên chất mang than bùn và cám gạo, hoàn thành trong thời gian 12 tháng.
• Thử nghiệm đồng ruộng trên diện rộng: Cục Bảo vệ thực vật phối hợp với Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn các tỉnh Bình Thuận, Long An, Tiền Giang xây dựng 15 mô hình khảo nghiệm thực tế với quy mô 50 ha/mô hình trong giai đoạn 2024-2025, hướng tới giảm 60% lượng thuốc trừ nấm hóa học tại các vùng triển khai.
• Ban hành quy trình kỹ thuật tích hợp: Trung tâm Khuyến nông Quốc gia ban hành tài liệu hướng dẫn kỹ thuật phòng trừ sinh học bệnh đốm nâu, kết hợp phun dịch vi sinh nồng độ $10^8$ CFU/ml định kỳ 15 ngày/lần với biện pháp cắt tỉa cành bệnh và cân đối dinh dưỡng cho 10.000 hộ nông dân trong vòng 2 năm tới.
• Xúc tiến thương mại hóa và đăng ký lưu hành: Các doanh nghiệp sản xuất phân bón và thuốc bảo vệ thực vật sinh học tiến hành nhận chuyển giao công nghệ, đăng ký danh mục chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật hợp quy theo tiêu chuẩn quốc gia trong giai đoạn 2025-2026.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Giảng viên và nhà nghiên cứu chuyên ngành Bảo vệ thực vật, Vi sinh vật học: Cung cấp nguồn tài liệu học thuật giá trị về quy trình phân lập, giám định giải trình tự gen 16S rRNA chính xác 99-100% và phương pháp đánh giá hoạt tính enzym lytic đối kháng nấm bệnh.
• Kỹ sư nông nghiệp và cán bộ khuyến nông địa phương: Ứng dụng phác đồ xử lý sinh học với mật độ vi sinh vật $10^8$ CFU/ml vào thực tiễn chỉ đạo sản xuất, hỗ trợ xây dựng các vùng trồng thanh long đạt chuẩn VietGAP và GlobalGAP.
• Doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học và phân bón vi sinh: Khai thác các thông số kỹ thuật tối ưu về nhiệt độ (30-37°C), pH (6,0-7,5) và tỷ lệ phối trộn chất mang hữu cơ để thiết kế dây chuyền sản xuất công nghiệp quy mô lớn.
• Chủ trang trại và hợp tác xã sản xuất thanh long: Nắm bắt giải pháp phòng trị bệnh đốm nâu đạt hiệu quả giảm bệnh trên 81%, giúp tiết kiệm 30-40% chi phí thuốc bảo vệ thực vật và đáp ứng các tiêu chuẩn khắt khe về dư lượng khi xuất khẩu.

Câu hỏi thường gặp

• Nấm Neoscytalidium dimidiatum gây thiệt hại như thế nào trên cây thanh long? Nấm tấn công trực tiếp lên cành non và vỏ quả tạo thành các vết đốm trắng lõm, sau đó chuyển sang màu nâu sần sùi như da tắc kè. Tỷ lệ bệnh tại các vườn thường dao động từ 10% đến 50%, làm thối quả nghiêm trọng và khiến sản phẩm không thể xuất khẩu hay tiêu thụ nội địa.

• Ba chủng vi sinh vật được tuyển chọn trong luận văn gồm những loài nào? Đề tài đã phân lập và tuyển chọn thành công 3 chủng có hoạt tính kháng nấm cao nhất gồm xạ khuẩn Streptomyces fradiae A3 (nguồn gốc Tiền Giang), vi khuẩn Bacillus polyfermenticus B7 (nguồn gốc Bình Thuận) và Bacillus velezensis C4 (nguồn gốc Long An). Cả 3 chủng đều tạo vòng ức chế nấm lớn hơn 2,0 cm.

• Hiệu lực kiểm soát bệnh đốm nâu của các chủng vi sinh vật đạt tỷ lệ bao nhiêu? Trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo ở nhà lưới, sau 60 ngày xử lý dịch vi sinh vật nồng độ $10^8$ CFU/ml, chủng Streptomyces fradiae A3 và Bacillus polyfermenticus B7 giúp giảm tỷ lệ bệnh 81,1%, trong khi chủng Bacillus velezensis C4 giúp giảm 73,9% so với công thức đối chứng.

• Các chủng vi sinh vật này có an toàn cho con người và môi trường không? Cả 3 chủng vi sinh vật tuyển chọn đều được xác định thuộc Cấp độ an toàn sinh học 1 (Risiko gruppe 1) theo chuẩn quốc tế. Nhóm vi sinh vật này hoàn toàn vô hại đối với con người, gia súc và môi trường sinh thái, đồng thời hỗ trợ cải tạo độ phì nhiêu của đất.

• Điều kiện nuôi cấy tối ưu cho các chủng vi sinh vật này là gì? Các chủng sinh trưởng mạnh nhất ở khoảng nhiệt độ từ 30°C đến 37°C, môi trường có độ pH trung tính từ 6,0 đến 7,5, lưu lượng cấp khí từ 0,5 đến 0,7 lít không khí/lít môi trường/phút và thời gian thu sinh khối tối ưu sau 48 đến 72 giờ lên men.

Kết luận

• Tuyển chọn thành công 3 chủng vi sinh vật đối kháng xuất sắc ký hiệu A3, B7 và C4 từ 90 mẫu đất với đường kính vòng ức chế nấm N. dimidiatum đạt trên 2,0 cm.
• Giám định phân tử 16S rRNA xác định chính xác 3 loài vi sinh vật có độ an toàn sinh học cấp 1 gồm Streptomyces fradiae, Bacillus polyfermenticus và Bacillus velezensis.
• Chứng minh hiệu lực kiểm soát bệnh đốm nâu vượt trội với hiệu quả giảm bệnh đạt từ 73,9% đến 81,1% sau 60 ngày thử nghiệm nhà lưới.
• Xác lập bộ thông số sinh học chuẩn về điều kiện nhiệt độ (30-37°C), pH (6,0-7,5) và thử nghiệm thành công khả năng sống sót trên các chất mang than bùn, cám gạo.
• Đóng góp luận cứ khoa học thực tiễn vững chắc cho việc sản xuất chế phẩm sinh học đặc trị nấm gây hại, mở ra hướng đi bền vững cho ngành sản xuất thanh long.

Kế hoạch tiếp theo cần tập trung khảo nghiệm đồng ruộng diện rộng trong 12 đến 24 tháng tới. Hãy chung tay thúc đẩy ứng dụng công nghệ sinh học vào nông nghiệp để nâng cao vị thế và giá trị xuất khẩu của trái thanh long Việt Nam trên trường quốc tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HÀ THỊ THÚY BƯỚC ĐẦU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ỨC CHẾ NẤM NEOSCYTALIDIUM DIMIDIATUM GÂY BỆNH ĐỐM NÂU TRÊN CÂY THANH LONG Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 60 62 01 12 Người hướng dẫn khoa học: TS. Lương Hữu Thành NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 4 tháng 12 năm 2016 Tác giả luận văn Hà Thị Thúy i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy giáo Lương Hữu Thành đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới, Ban Quản lý đào tạo Sau đại học – Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Viện Môi trường Nông nghiệp đặc biệt là Bộ môn Sinh học Môi trường đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn.

Hà Nội, ngày 04 tháng 12 năm 2016 Tác giả luận văn Hà Thị Thúy ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danh mục viết tắt. v Danh mục bảng.

vi Danh mục hình. vii Trích yếu luận văn. viii Thesis Abstract. Tính cấp thiết của đề tài.

Mục tiêu của đề tài. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài. Đối tượng, phạm vi và địa điểm nghiên cứu. Tổng quan tài liệu và cơ sở khoa học của đề tài.

Cơ sở khoa học của đề tài. Tình hình sản xuất và tiềm năng phát triển cây thanh long. Bệnh hại thanh long. Bệnh thán thư.

Bệnh thối thân, thối quả. Những nghiên cứu về bệnh đốm nâu hại cây thanh long. Biện pháp sinh học sử dụng vi sinh vật đối kháng trong công tác bảo vệ thực vật. Mối quan hệ của quần thể vi sinh vật và cơ chế hoạt động của vi sinh vật đối kháng.

Vi sinh vật đối kháng. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứuError! Bookmark not defined. Vật liệu nghiên cúu. Nguồn mẫu dùng trong nghiên cứu.

Vi sinh vật. Giống Thanh long. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Nội dung nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu. 30 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật nghiên cứu. Phương pháp xác định tên vi sinh vật nghiên cứu.

Phương pháp thí nghiệm khả năng đối kháng của vi sinh vật đối với tác nhân gây bệnh. Phương pháp xác định khả năng sản xuất chế phẩm của các vi sinh vật nghiên cứu. Phương pháp xử lý số liệu. Kết quả và thảo luận.

Phân lập, tuyển chọn và đánh giá hoạt tính sinh học của các vi sinh vật đối kháng. Thu thập, phân lập và tuyển chọn vi sinh vật đối kháng. Hình thái khuẩn lạc, tế bào và nhuộm Gram của vi sinh vật. Hoạt tính sinh học của các vi sinh vật đối kháng.

Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng phát triển của các vi sinh vật nghiên cứu. Ảnh hưởng của pH. Ảnh hưởng của nhiệt độ. Ảnh hưởng của lượng khí cấp vào.

Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy. Xác định tên các vi sinh vật nghiên cứu. Nghiên cứu khả năng kiểm soát bệnh đốm nâu thanh long của các vi sinh vật đối kháng. Ảnh hưởng của vi sinh vật nghiên cứu đến khả năng kiểm soát bệnh đốm nâu thanh long.

Ảnh hưởng của các vi sinh vật nghiên cứu đến sinh trưởng cây thanh long. Xác định khả năng sản xuất chế phẩm. Kết luận và kiến nghị. 72 Tài liệu tham khảo.

73 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt BVTV Bảo vệ thực vật CFU (colony forming unit) Đơn vị hình thành khuẩn lạc cs Cộng sự TLB Tỉ lệ bệnh f.sp (forma specialis) Dạng chuyên tính G+ Gram dương NA Môi trường NA PDA Môi trường PDA ISP4 Môi trường ISP4 STT Số thứ tự VSV Vi sinh vật v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2. Diện tích, sản lượng thanh long của Việt Nam và 3 tỉnh năm 2014. Danh sách các vi sinh vật có khả năng ức chế nấm Neoscytalidium dimitiatum. Danh sách vòng ức chế của các vi sinh vật được phân lập từ đất trồng thanh long.

Các vi sinh vật có khả năng ức chế nấm gây bệnh đốm nâu thanh long. Đặc điểm khuẩn lạc, tế bào của các vi sinh vật. Kết quả nhuộm Gram của các chủng vi sinh vật đối kháng. Hoạt tính đối kháng của các dòng vi sinh vật lựa chọn.

Hoạt tính phân giải tinh bột, xenluloza và phốt phát khó tan của các dòng vi sinh vật lựa chọn. Ảnh hưởng của pH tới quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sinh trưởng. Ảnh hưởng của O2 đến sinh trưởng phát triển của các vi sinh vật.

Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn C4. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn B7. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng và phát triển của xạ khuẩn A3. Cây phân loại của dòng B7.

Ảnh hưởng của vi sinh vật nghiên cứu đến khả năng kiểm soát. Ảnh hưởng của vi sinh vật nghiên cứu đến khả năng sinh trưởng phát triển của cây thanh long. Khả năng sống sót của vi sinh vật nghiên cứu trong đất. Mật độ vi sinh vật trên 3 loại chất mang.

69 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 4. Khuẩn lạc dòng A3 .2 Khuẩn lạc dòng C4 .3 Khuẩn lạc dòng B7. Hình dạng tế bào của vi khuẩn đối kháng. Khả năng ức chế nấm của các vi sinh vật trên môi trường nhân tạo.

Hoạt tính phân giải xenluloza dòng B7 và A3. Hoạt tính phân giải Ca3(PO4)2 dòng B7 .8 Hoạt tính phân giải tinh bột dòng A3. Cây phân loại của dòng A3 .10 Cây phân loại của dòng C4. Cây phân loại của dòng B7 .12 Khả năng ức chế bệnh đốm nâu thanh long của vi sinh vật nghiên cứu (hình a, b, c, d).13 Thí nghiệm ảnh hưởng vi sinh vật nghiên cứu đến cây thanh long (hình a,b,c).

67 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Hà Thị Thúy Tên Luận văn: “Bước đầu tuyển chọn một số chủng vi sinh vật ức chế nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long”. Ngành: BVTV Mã số: 60620112 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật làm tác nhân sinh học để kiểm soát bệnh đốm nâu trên cây thanh long. Phương pháp nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu - Các mẫu đất trồng thanh long. - Nấm Neoscytalidium dimidiatum – Viện cây ăn quả Miền Nam cung cấp - Các hom giống thanh long - Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật Nội dung nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn và đánh giá hoạt tính sinh học của vi sinh vật.

- Nghiên cứu xác định tên vi sinh vật lựa chọn - Nghiên cứu khả năng kiểm soát bệnh đốm nâu trên cây thanh long của vi sinh vật lựa chọn - Xác định khả năng sản xuất chế phẩm Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học của vi sinh vật Xác định hoạt tính đối kháng của vi sinh vật theo 10TCN714-2005, 10TCN 876-2006, Nguyễn Lân Dũng (2005) và Rupela et al. - Phương pháp xác định tên vi sinh vật lựa chọn Xác định tên vi sinh vật bằng phương pháp phân loại sinh học phân tử dựa trên cơ sở giải trình tự đoạn den 16s ARN riboxom của các vi sinh vật nghiên cứu. - Phương pháp bố trí thí nghiệm trong nhà lưới Đất trồng cây được khử trùng, được đựng trong các hộp xốp (15kg đất/hộp). Thí nghiệm được trồng trong nhà lưới, bố trí ngẫu nhiên, 5 lần nhắc lại, trồng 6 hom/hộp.

viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Công thức 1: Không nhiễm vi sinh vật Công thức 2: Nhiễm nấm bệnh (ĐC) Công thức 3: Nhiễm xạ khuẩn A3 Công thức 4: Nhiễm xạ khuẩn A3 + nấm bệnh (108CFU/ml, tỉ lệ 1:1) Công thức 5: Nhiễm vi khuẩn B7 Công thức 6: Nhiễm vi khuẩn B7+ nấm bệnh (108CFU/ml, tỉ lệ 1:1) Công thức 7: Nhiễm vi khuẩn C4 Công thức 8: Nhiễm vi khuẩn C4+ nấm bệnh (108CFU/ml, tỉ lệ 1:1) Phun dịch vi sinh vật với nồng độ 108 CFU/ml trong thời gian 15-20 phút trước khi trồng. Chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ bệnh (%) = (Số cành bị bệnh/ số cành điều tra) x 100 sau khi nhiễm bệnh 30 ngày, 60 ngày. Kết quả chính và kết luận - Tuyển chọn được 3 dòng vi sinh vật có khả năng ức chế nấm gây bệnh đốm nâu thanh long kí hiệu là A3, B7, C4. Các chủng vi sinh vật này có khả năng ức chế nấm gây bệnh cao với đường kính vòng ức chế > 2,0 cm.

- Bằng kỹ thuật phân tử đã xác định trình tự ARNr 16S dòng A3 tương đồng 100% (1500/1500 bp) với đoạn ADNr 16S của Streptomyces fradiae và Streptomyces rubrolavendulae; 99,8 % (1497/1500 bp) với Streptomyces roseoflavus.