Tổng quan nghiên cứu

Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới, bệnh tắc nghẽn mạch máu gây ra hơn 28% số ca tử vong trên toàn cầu, với khoảng 173 triệu người chết vì bệnh này trong năm 2008. Tại Mỹ, mỗi năm có khoảng 6 triệu người bị suy tim, trong đó 1,5 triệu người mắc bệnh tim mạch và một phần ba trong số đó tử vong. Nguyên nhân chủ yếu là do huyết khối – sự hình thành cục máu đông gây tắc nghẽn mạch máu. Enzyme plasmin trong cơ thể có khả năng phân hủy huyết khối, tuy nhiên, nattokinase – một enzyme tiêu sợi huyết được chiết xuất từ thực phẩm lên men Natto – có tính chất tương tự plasmin và được đánh giá cao về hiệu quả phân hủy fibrin và huyết khối.

Mục tiêu nghiên cứu là tối ưu hóa điều kiện lên men Bacillus subtilis natto trên nguyên liệu đậu nành nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme nattokinase, từ đó định hướng phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng bột đậu nành giàu hoạt tính nattokinase. Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 8/2015 đến tháng 6/2016 tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.

Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng phòng ngừa và hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến tắc nghẽn mạch máu, góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng và mở rộng ứng dụng enzyme nattokinase tại Việt Nam. Các chỉ số hiệu quả được đo lường bao gồm hoạt tính enzyme nattokinase (FU/g) và độ ẩm sản phẩm sau sấy thăng hoa.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nattokinase là enzyme serine protease thuộc họ subtilisin, có trọng lượng phân tử khoảng 27.728 Da, được mã hóa bởi gen aprN của Bacillus subtilis natto. Enzyme này có khả năng phân hủy trực tiếp sợi fibrin, thúc đẩy hoạt động của urokinase và tăng cường sản xuất mô plasminogen hoạt động, từ đó phá vỡ huyết khối hiệu quả. Cơ chế tiêu fibrin của nattokinase được minh họa qua ba con đường chính: phân hủy trực tiếp fibrin, chuyển hóa plasminogen thành plasmin qua urokinase, và kích hoạt mô plasminogen hoạt động.

Phương pháp quy hoạch thực nghiệm Plackett-Burman (PB) được sử dụng để sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp nattokinase, giúp xác định các nhân tố quan trọng trong môi trường lên men. Tiếp đó, phương pháp đáp ứng bề mặt – thiết kế cấu trúc có tâm (RSM-CCD) được áp dụng để tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy dựa trên các yếu tố đã được sàng lọc, nhằm tìm ra điều kiện tối ưu cho hoạt tính enzyme cao nhất.

Các khái niệm chính bao gồm: enzyme nattokinase, Bacillus subtilis natto, phương pháp Plackett-Burman, phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM-CCD), và hoạt tính enzyme (FU/g).

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là các mẫu vi khuẩn Bacillus subtilis natto được nuôi cấy trên môi trường đậu nành nấu chín tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách Khoa TP. Hồ Chí Minh. Cỡ mẫu nghiên cứu bao gồm các nghiệm thức thí nghiệm được thiết kế theo ma trận Plackett-Burman và RSM-CCD với 3 yếu tố chính: mật độ cấy giống (log CFU/g), thời gian lên men (giờ), và pH môi trường.

Phân tích dữ liệu được thực hiện bằng phần mềm Design Expert phiên bản 10.0, sử dụng mô hình hồi quy bậc hai để xây dựng phương trình mô tả ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt tính nattokinase. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.

Quá trình nghiên cứu gồm các bước: khảo sát đặc tính sinh học của vi khuẩn, khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện lên men (mật độ cấy, thời gian, pH, nhiệt độ) đến hoạt tính enzyme, sàng lọc yếu tố bằng Plackett-Burman, tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy bằng RSM-CCD, và thử nghiệm tạo chế phẩm bột đậu nành giàu hoạt tính nattokinase bằng phương pháp sấy thăng hoa với điều kiện -80°C, 24 giờ, áp suất 6-7 Pa.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Ảnh hưởng của mật độ cấy giống: Hoạt tính nattokinase tăng theo mật độ cấy, đạt tối ưu ở mức 10^7 CFU/g với hoạt tính 136 FU/g, cao hơn khoảng 25% so với mật độ thấp nhất (10^5 CFU/g). Đồ thị biểu diễn mối quan hệ này cho thấy sự tăng trưởng enzyme theo mật độ cấy.

  2. Ảnh hưởng của thời gian lên men: Hoạt tính enzyme đạt đỉnh tại 36 giờ lên men với giá trị 136 FU/g, tăng khoảng 30% so với 12 giờ và giảm nhẹ khi lên men quá 48 giờ do sự bắt đầu hình thành bào tử và giảm sinh tổng hợp enzyme.

  3. Ảnh hưởng của pH môi trường: pH tối ưu cho sinh tổng hợp nattokinase là 7.5, với hoạt tính enzyme đạt 136 FU/g, cao hơn 20% so với pH 5.5 và 8.0. Biểu đồ bề mặt đáp ứng thể hiện rõ sự tương tác giữa pH và thời gian lên men.

  4. Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ 37°C là điều kiện tối ưu cho hoạt tính nattokinase, đạt 136 FU/g, trong khi nhiệt độ cao hơn 42°C làm giảm hoạt tính enzyme khoảng 15% do enzyme bị bất hoạt.

  5. Kết quả tối ưu hóa bằng RSM-CCD: Phương trình hồi quy mô tả hoạt tính nattokinase theo ba yếu tố chính được xây dựng với hệ số phù hợp cao (R² > 0.95). Điều kiện tối ưu được xác định là mật độ 10^7 CFU/g, thời gian 36 giờ, pH 7.5, cho hoạt tính enzyme tối đa 136 FU/g.

  6. Thử nghiệm tạo chế phẩm bột: Sản phẩm bột đậu nành giàu nattokinase được tạo ra bằng phương pháp sấy thăng hoa với độ ẩm 4.3% và hoạt tính enzyme đạt 515 FU/g, cao gấp gần 4 lần so với hoạt tính trong môi trường lên men thô, cho thấy hiệu quả bảo quản và tập trung enzyme.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu phù hợp với các nghiên cứu trong và ngoài nước, khẳng định vai trò quan trọng của các yếu tố môi trường như mật độ cấy, thời gian, pH và nhiệt độ trong việc tối ưu hóa sinh tổng hợp nattokinase. Sự tăng hoạt tính enzyme ở mật độ cấy cao và thời gian lên men vừa phải phản ánh giai đoạn sinh trưởng tích cực của vi khuẩn trước khi chuyển sang giai đoạn tạo bào tử.

So sánh với các nghiên cứu trước, hoạt tính nattokinase đạt được trong nghiên cứu này tương đương hoặc cao hơn, chứng tỏ hiệu quả của phương pháp quy hoạch thực nghiệm kết hợp Plackett-Burman và RSM-CCD trong tối ưu hóa điều kiện lên men. Việc sử dụng phương pháp sấy thăng hoa giúp bảo toàn hoạt tính enzyme cao, mở ra hướng phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng bột đậu nành giàu nattokinase tại Việt Nam.

Dữ liệu có thể được trình bày qua các biểu đồ bề mặt đáp ứng 3D thể hiện tương tác giữa các yếu tố, bảng phân tích ANOVA cho mô hình hồi quy, và biểu đồ so sánh hoạt tính enzyme dưới các điều kiện khác nhau để minh họa rõ ràng hiệu quả tối ưu hóa.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Áp dụng điều kiện lên men tối ưu: Khuyến nghị sử dụng mật độ cấy 10^7 CFU/g, thời gian 36 giờ, pH 7.5 và nhiệt độ 37°C trong quy trình sản xuất nattokinase để đạt hiệu quả enzyme cao nhất. Thời gian thực hiện: ngay trong giai đoạn sản xuất thử nghiệm và mở rộng quy mô.

  2. Phát triển sản phẩm bột nattokinase: Khuyến khích áp dụng công nghệ sấy thăng hoa để tạo ra sản phẩm bột đậu nành giàu hoạt tính nattokinase với độ ẩm dưới 5%, đảm bảo ổn định enzyme và tiện lợi cho người tiêu dùng. Chủ thể thực hiện: các doanh nghiệp thực phẩm chức năng và phòng thí nghiệm nghiên cứu.

  3. Nâng cao chất lượng chủng vi khuẩn: Đề xuất nghiên cứu và tuyển chọn các chủng Bacillus subtilis natto có khả năng sinh tổng hợp nattokinase cao hơn, kết hợp công nghệ tái tổ hợp gen để tăng năng suất enzyme. Thời gian thực hiện: 1-2 năm.

  4. Xây dựng quy trình sản xuất công nghiệp: Đề xuất xây dựng quy trình công nghiệp hóa sản xuất nattokinase từ đậu nành lên men, đảm bảo kiểm soát chất lượng và hiệu quả kinh tế. Chủ thể thực hiện: các công ty công nghệ sinh học và thực phẩm.

  5. Nghiên cứu ứng dụng lâm sàng: Khuyến nghị phối hợp với các cơ sở y tế để nghiên cứu hiệu quả và an toàn của sản phẩm nattokinase trong phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh tắc nghẽn mạch máu. Thời gian thực hiện: 2-3 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học: Luận văn cung cấp kiến thức chuyên sâu về vi sinh vật Bacillus subtilis natto, enzyme nattokinase và các phương pháp tối ưu hóa lên men, hỗ trợ nghiên cứu và phát triển sản phẩm enzyme.

  2. Doanh nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng: Thông tin về quy trình lên men, tối ưu hóa điều kiện và công nghệ sấy thăng hoa giúp doanh nghiệp phát triển sản phẩm bột nattokinase chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu thị trường.

  3. Chuyên gia y tế và dược phẩm: Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học về tác dụng của nattokinase trong phòng ngừa và điều trị bệnh tắc nghẽn mạch máu, hỗ trợ phát triển các sản phẩm hỗ trợ sức khỏe.

  4. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách: Luận văn góp phần định hướng phát triển ngành công nghệ sinh học và thực phẩm chức năng tại Việt Nam, giúp xây dựng chính sách hỗ trợ nghiên cứu và ứng dụng enzyme nattokinase.

Câu hỏi thường gặp

  1. Nattokinase là gì và có tác dụng gì?
    Nattokinase là enzyme tiêu sợi huyết được chiết xuất từ thực phẩm lên men Natto, có khả năng phân hủy fibrin và huyết khối, giúp phòng ngừa và hỗ trợ điều trị các bệnh tắc nghẽn mạch máu như nhồi máu cơ tim và đột quỵ.

  2. Tại sao cần tối ưu hóa điều kiện lên men Bacillus subtilis natto?
    Tối ưu hóa giúp tăng hoạt tính enzyme nattokinase, nâng cao hiệu quả sản xuất, giảm chi phí và tạo điều kiện phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng chất lượng cao.

  3. Phương pháp Plackett-Burman và RSM-CCD có vai trò gì trong nghiên cứu?
    Plackett-Burman giúp sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng quan trọng, còn RSM-CCD tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy dựa trên các yếu tố đã chọn, từ đó xác định điều kiện sản xuất hiệu quả nhất.

  4. Sấy thăng hoa có ưu điểm gì trong bảo quản enzyme?
    Sấy thăng hoa giữ được hoạt tính enzyme cao, giảm độ ẩm sản phẩm, tăng thời gian bảo quản và tạo ra sản phẩm bột tiện lợi cho sử dụng và vận chuyển.

  5. Sản phẩm nattokinase có an toàn khi sử dụng không?
    Nattokinase đã được sử dụng an toàn trong thực phẩm Natto truyền thống hơn 1000 năm, nghiên cứu lâm sàng cho thấy không có tác dụng phụ nghiêm trọng, phù hợp dùng dự phòng và hỗ trợ điều trị.

Kết luận

  • Nghiên cứu đã xác định được điều kiện lên men tối ưu cho Bacillus subtilis natto trên cơ chất đậu nành gồm mật độ 10^7 CFU/g, thời gian 36 giờ, pH 7.5 và nhiệt độ 37°C, đạt hoạt tính nattokinase 136 FU/g.
  • Phương pháp quy hoạch thực nghiệm Plackett-Burman kết hợp RSM-CCD là công cụ hiệu quả trong tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp enzyme.
  • Sản phẩm bột đậu nành giàu hoạt tính nattokinase được tạo ra bằng sấy thăng hoa có độ ẩm 4.3% và hoạt tính enzyme 515 FU/g, mở rộng ứng dụng thực phẩm chức năng tại Việt Nam.
  • Kết quả nghiên cứu góp phần phát triển công nghệ sinh học enzyme và sản phẩm phòng ngừa bệnh tắc nghẽn mạch máu.
  • Đề xuất tiếp tục nghiên cứu nâng cao năng suất enzyme, phát triển quy trình công nghiệp và ứng dụng lâm sàng trong thời gian tới.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp áp dụng kết quả nghiên cứu để phát triển sản phẩm nattokinase chất lượng cao, đồng thời mở rộng hợp tác nghiên cứu ứng dụng trong y tế và thực phẩm chức năng.