Luận văn thạc sĩ: Tối ưu hóa khả năng sinh tổng hợp nattokinase từ đậu nành để phát triển sản phẩm

Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học tập trung tối ưu hóa sinh tổng hợp nattokinase từ đậu nành, định hướng phát triển sản phẩm hiệu quả.

• Tác giả: Nguyễn Nhựt Huy
• Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương
• Trường học: Đại học Bách Khoa - Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Tối ưu hóa khả năng sinh tổng hợp nattokinase trên nguyên liệu đậu nành nhằm định hướng phát triển sản phẩm
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT LUẬN VĂN
• ABSTRACT
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH ẢNH
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Bacillus subtilis natto và sản phẩm Natto
• 1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis
• 1.3. Đặc điểm hình thái
• 1.4. Đặc điểm sinh lý
• 1.5. Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với một số loại vi sinh vật khác
• 1.6. Sản phẩm truyền thống Natto
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp và nội dung thí nghiệm
• 2.3.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
• 2.3.2. Khảo sát đặc tính sinh học của B.
• 2.3.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp nattokinase trên môi trường cơ chất đậu nành
• 2.3.4. Thiết kế sàng lọc yếu tố thí nghiệm theo Plackett — Burman
• 2.3.5. Thiết kế tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy theo RSM - CCD
• 2.3.6. Thử nghiệm tạo chế phẩm
• 2.4. Các phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Phương pháp kiểm tra hoạt tính nattokinase thô
• 2.4.2. Phương pháp xác định độ ẩm chế phẩm sấy khô
• 2.4.3. Phương pháp phân tích thống kê
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN
• 3.1. Khảo sát một số đặc tính sinh học của vi khuẩn B.
• 3.1.1. Quan sát hình thái đại thể và vi thể
• 3.1.2. Khảo sát thời gian sinh trưởng của vi khuẩn B.subtilis natto trên cơ chất
• 3.2. Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến quá trình sinh tổng hợp nattokinase
• 3.2.1. Ảnh hưởng mật độ chủng B.
• 3.2.2. Ảnh hưởng thời gian lên men
• 3.2.3. Ảnh hưởng pH môi trường lên men
• 3.2.4. Ảnh hưởng nhiệt độ môi trường lên men
• 3.3. Tối ưu hóa bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm
• 3.3.1. Thí nghiệm sàng lọc Plackett — Burman
• 3.3.2. Thiết kế tối ưu hóa môi trường nuôi cấy theo RSM — CCD
• 3.4. Thử nghiệm tạo chế phẩm
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tối ưu hóa sinh tổng hợp nattokinase

Nghiên cứu tập trung vào tối ưu hóa quy trình sinh tổng hợp enzyme nattokinase từ đậu nành lên men bằng chủng vi khuẩn Bacillus subtilis natto. Mục tiêu chính là tăng hiệu suất sản xuất enzyme này thông qua việc điều chỉnh các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH, thời gian lên men và mật độ chủng cấy. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm Plackett-Burman kết hợp với RSM-CCD được sử dụng để xác định điều kiện tối ưu. Kết quả cho thấy hoạt tính nattokinase đạt 136 FU/g, mở ra hướng phát triển các sản phẩm sinh học từ đậu nành.

1.1. Ảnh hưởng của điều kiện lên men

Các yếu tố như mật độ chủng cấy, thời gian lên men, pH và nhiệt độ được khảo sát để đánh giá tác động đến quá trình sinh tổng hợp nattokinase. Kết quả cho thấy pH 7.0 và nhiệt độ 37°C là điều kiện lý tưởng. Thời gian lên men tối ưu là 48 giờ, trong khi mật độ chủng cấy 10^8 CFU/ml mang lại hiệu suất cao nhất.

1.2. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm

Phương pháp Plackett-Burman được sử dụng để sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng chính. Sau đó, RSM-CCD được áp dụng để tối ưu hóa các điều kiện. Phương trình hồi quy thu được từ phần mềm Design-Expert cho phép dự đoán chính xác điều kiện tối ưu, giúp nâng cao hiệu suất sản xuất nattokinase.

II. Ứng dụng công nghệ sinh học

Nghiên cứu này không chỉ dừng lại ở việc tối ưu hóa quy trình mà còn hướng đến việc phát triển các sản phẩm sinh học từ đậu nành lên men. Nattokinase được biết đến với khả năng phân hủy fibrin, ngăn ngừa huyết khối và hỗ trợ điều trị các bệnh tim mạch. Việc sản xuất nattokinase từ đậu nành mở ra tiềm năng lớn trong ngành công nghệ sinh học, đặc biệt là trong lĩnh vực thực phẩm chức năng.

2.1. Sản xuất nattokinase từ đậu nành

Quy trình sản xuất nattokinase bao gồm lên men đậu nành với Bacillus subtilis natto, sau đó tách chiết và tinh chế enzyme. Sản phẩm cuối cùng được sấy thăng hoa để bảo toàn hoạt tính enzyme. Kết quả thử nghiệm cho thấy độ ẩm 4.3% và hoạt tính nattokinase 515 FU/g, đáp ứng tiêu chuẩn chất lượng.

2.2. Phát triển sản phẩm sinh học

Nghiên cứu hướng đến việc phát triển các sản phẩm sinh học như bột đậu nành giàu nattokinase, có thể ứng dụng trong thực phẩm chức năng. Đây là hướng đi tiềm năng để đa dạng hóa sản phẩm và nâng cao giá trị dinh dưỡng của đậu nành.

III. Giá trị và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu mang lại giá trị khoa học và thực tiễn cao. Việc tối ưu hóa quy trình sinh tổng hợp nattokinase không chỉ nâng cao hiệu suất sản xuất mà còn giảm chi phí. Sản phẩm sinh học từ đậu nành có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong y học và thực phẩm, đặc biệt là trong phòng ngừa và điều trị các bệnh tim mạch.

3.1. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu đóng góp vào việc hiểu rõ hơn về cơ chế sinh tổng hợp nattokinase và các yếu tố ảnh hưởng. Đồng thời, phương pháp tối ưu hóa sử dụng Plackett-Burman và RSM-CCD có thể áp dụng cho các quy trình sinh học khác.

3.2. Ứng dụng thực tiễn

Sản phẩm nattokinase từ đậu nành có thể được sử dụng trong các sản phẩm thực phẩm chức năng, hỗ trợ sức khỏe tim mạch. Nghiên cứu cũng mở ra cơ hội phát triển các sản phẩm công nghệ sinh học khác từ nguyên liệu tự nhiên.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới, bệnh tắc nghẽn mạch máu gây ra hơn 28% số ca tử vong trên toàn cầu, với khoảng 173 triệu người chết vì bệnh này trong năm 2008. Tại Mỹ, mỗi năm có khoảng 6 triệu người bị suy tim, trong đó 1,5 triệu người mắc bệnh tim mạch và một phần ba trong số đó tử vong. Nguyên nhân chủ yếu là do huyết khối – sự hình thành cục máu đông gây tắc nghẽn mạch máu. Enzyme plasmin trong cơ thể có khả năng phân hủy huyết khối, tuy nhiên, nattokinase – một enzyme tiêu sợi huyết được chiết xuất từ thực phẩm lên men Natto – có tính chất tương tự plasmin và được đánh giá cao về hiệu quả phân hủy fibrin và huyết khối.

Mục tiêu nghiên cứu là tối ưu hóa điều kiện lên men Bacillus subtilis natto trên nguyên liệu đậu nành nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme nattokinase, từ đó định hướng phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng bột đậu nành giàu hoạt tính nattokinase. Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 8/2015 đến tháng 6/2016 tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.

Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng phòng ngừa và hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến tắc nghẽn mạch máu, góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng và mở rộng ứng dụng enzyme nattokinase tại Việt Nam. Các chỉ số hiệu quả được đo lường bao gồm hoạt tính enzyme nattokinase (FU/g) và độ ẩm sản phẩm sau sấy thăng hoa.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nattokinase là enzyme serine protease thuộc họ subtilisin, có trọng lượng phân tử khoảng 27.728 Da, được mã hóa bởi gen aprN của Bacillus subtilis natto. Enzyme này có khả năng phân hủy trực tiếp sợi fibrin, thúc đẩy hoạt động của urokinase và tăng cường sản xuất mô plasminogen hoạt động, từ đó phá vỡ huyết khối hiệu quả. Cơ chế tiêu fibrin của nattokinase được minh họa qua ba con đường chính: phân hủy trực tiếp fibrin, chuyển hóa plasminogen thành plasmin qua urokinase, và kích hoạt mô plasminogen hoạt động.

Phương pháp quy hoạch thực nghiệm Plackett-Burman (PB) được sử dụng để sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp nattokinase, giúp xác định các nhân tố quan trọng trong môi trường lên men. Tiếp đó, phương pháp đáp ứng bề mặt – thiết kế cấu trúc có tâm (RSM-CCD) được áp dụng để tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy dựa trên các yếu tố đã được sàng lọc, nhằm tìm ra điều kiện tối ưu cho hoạt tính enzyme cao nhất.

Các khái niệm chính bao gồm: enzyme nattokinase, Bacillus subtilis natto, phương pháp Plackett-Burman, phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM-CCD), và hoạt tính enzyme (FU/g).

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là các mẫu vi khuẩn Bacillus subtilis natto được nuôi cấy trên môi trường đậu nành nấu chín tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách Khoa TP. Hồ Chí Minh. Cỡ mẫu nghiên cứu bao gồm các nghiệm thức thí nghiệm được thiết kế theo ma trận Plackett-Burman và RSM-CCD với 3 yếu tố chính: mật độ cấy giống (log CFU/g), thời gian lên men (giờ), và pH môi trường.

Phân tích dữ liệu được thực hiện bằng phần mềm Design Expert phiên bản 10.0, sử dụng mô hình hồi quy bậc hai để xây dựng phương trình mô tả ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt tính nattokinase. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.

Quá trình nghiên cứu gồm các bước: khảo sát đặc tính sinh học của vi khuẩn, khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện lên men (mật độ cấy, thời gian, pH, nhiệt độ) đến hoạt tính enzyme, sàng lọc yếu tố bằng Plackett-Burman, tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy bằng RSM-CCD, và thử nghiệm tạo chế phẩm bột đậu nành giàu hoạt tính nattokinase bằng phương pháp sấy thăng hoa với điều kiện -80°C, 24 giờ, áp suất 6-7 Pa.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Ảnh hưởng của mật độ cấy giống: Hoạt tính nattokinase tăng theo mật độ cấy, đạt tối ưu ở mức 10^7 CFU/g với hoạt tính 136 FU/g, cao hơn khoảng 25% so với mật độ thấp nhất (10^5 CFU/g). Đồ thị biểu diễn mối quan hệ này cho thấy sự tăng trưởng enzyme theo mật độ cấy.

2. Ảnh hưởng của thời gian lên men: Hoạt tính enzyme đạt đỉnh tại 36 giờ lên men với giá trị 136 FU/g, tăng khoảng 30% so với 12 giờ và giảm nhẹ khi lên men quá 48 giờ do sự bắt đầu hình thành bào tử và giảm sinh tổng hợp enzyme.

3. Ảnh hưởng của pH môi trường: pH tối ưu cho sinh tổng hợp nattokinase là 7.5, với hoạt tính enzyme đạt 136 FU/g, cao hơn 20% so với pH 5.5 và 8.0. Biểu đồ bề mặt đáp ứng thể hiện rõ sự tương tác giữa pH và thời gian lên men.

4. Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ 37°C là điều kiện tối ưu cho hoạt tính nattokinase, đạt 136 FU/g, trong khi nhiệt độ cao hơn 42°C làm giảm hoạt tính enzyme khoảng 15% do enzyme bị bất hoạt.

5. Kết quả tối ưu hóa bằng RSM-CCD: Phương trình hồi quy mô tả hoạt tính nattokinase theo ba yếu tố chính được xây dựng với hệ số phù hợp cao (R² > 0.95). Điều kiện tối ưu được xác định là mật độ 10^7 CFU/g, thời gian 36 giờ, pH 7.5, cho hoạt tính enzyme tối đa 136 FU/g.

6. Thử nghiệm tạo chế phẩm bột: Sản phẩm bột đậu nành giàu nattokinase được tạo ra bằng phương pháp sấy thăng hoa với độ ẩm 4.3% và hoạt tính enzyme đạt 515 FU/g, cao gấp gần 4 lần so với hoạt tính trong môi trường lên men thô, cho thấy hiệu quả bảo quản và tập trung enzyme.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu phù hợp với các nghiên cứu trong và ngoài nước, khẳng định vai trò quan trọng của các yếu tố môi trường như mật độ cấy, thời gian, pH và nhiệt độ trong việc tối ưu hóa sinh tổng hợp nattokinase. Sự tăng hoạt tính enzyme ở mật độ cấy cao và thời gian lên men vừa phải phản ánh giai đoạn sinh trưởng tích cực của vi khuẩn trước khi chuyển sang giai đoạn tạo bào tử.

So sánh với các nghiên cứu trước, hoạt tính nattokinase đạt được trong nghiên cứu này tương đương hoặc cao hơn, chứng tỏ hiệu quả của phương pháp quy hoạch thực nghiệm kết hợp Plackett-Burman và RSM-CCD trong tối ưu hóa điều kiện lên men. Việc sử dụng phương pháp sấy thăng hoa giúp bảo toàn hoạt tính enzyme cao, mở ra hướng phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng bột đậu nành giàu nattokinase tại Việt Nam.

Dữ liệu có thể được trình bày qua các biểu đồ bề mặt đáp ứng 3D thể hiện tương tác giữa các yếu tố, bảng phân tích ANOVA cho mô hình hồi quy, và biểu đồ so sánh hoạt tính enzyme dưới các điều kiện khác nhau để minh họa rõ ràng hiệu quả tối ưu hóa.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng điều kiện lên men tối ưu: Khuyến nghị sử dụng mật độ cấy 10^7 CFU/g, thời gian 36 giờ, pH 7.5 và nhiệt độ 37°C trong quy trình sản xuất nattokinase để đạt hiệu quả enzyme cao nhất. Thời gian thực hiện: ngay trong giai đoạn sản xuất thử nghiệm và mở rộng quy mô.

2. Phát triển sản phẩm bột nattokinase: Khuyến khích áp dụng công nghệ sấy thăng hoa để tạo ra sản phẩm bột đậu nành giàu hoạt tính nattokinase với độ ẩm dưới 5%, đảm bảo ổn định enzyme và tiện lợi cho người tiêu dùng. Chủ thể thực hiện: các doanh nghiệp thực phẩm chức năng và phòng thí nghiệm nghiên cứu.

3. Nâng cao chất lượng chủng vi khuẩn: Đề xuất nghiên cứu và tuyển chọn các chủng Bacillus subtilis natto có khả năng sinh tổng hợp nattokinase cao hơn, kết hợp công nghệ tái tổ hợp gen để tăng năng suất enzyme. Thời gian thực hiện: 1-2 năm.

4. Xây dựng quy trình sản xuất công nghiệp: Đề xuất xây dựng quy trình công nghiệp hóa sản xuất nattokinase từ đậu nành lên men, đảm bảo kiểm soát chất lượng và hiệu quả kinh tế. Chủ thể thực hiện: các công ty công nghệ sinh học và thực phẩm.

5. Nghiên cứu ứng dụng lâm sàng: Khuyến nghị phối hợp với các cơ sở y tế để nghiên cứu hiệu quả và an toàn của sản phẩm nattokinase trong phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh tắc nghẽn mạch máu. Thời gian thực hiện: 2-3 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học: Luận văn cung cấp kiến thức chuyên sâu về vi sinh vật Bacillus subtilis natto, enzyme nattokinase và các phương pháp tối ưu hóa lên men, hỗ trợ nghiên cứu và phát triển sản phẩm enzyme.

2. Doanh nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng: Thông tin về quy trình lên men, tối ưu hóa điều kiện và công nghệ sấy thăng hoa giúp doanh nghiệp phát triển sản phẩm bột nattokinase chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu thị trường.

3. Chuyên gia y tế và dược phẩm: Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học về tác dụng của nattokinase trong phòng ngừa và điều trị bệnh tắc nghẽn mạch máu, hỗ trợ phát triển các sản phẩm hỗ trợ sức khỏe.

4. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách: Luận văn góp phần định hướng phát triển ngành công nghệ sinh học và thực phẩm chức năng tại Việt Nam, giúp xây dựng chính sách hỗ trợ nghiên cứu và ứng dụng enzyme nattokinase.

Câu hỏi thường gặp

1. Nattokinase là gì và có tác dụng gì?
   Nattokinase là enzyme tiêu sợi huyết được chiết xuất từ thực phẩm lên men Natto, có khả năng phân hủy fibrin và huyết khối, giúp phòng ngừa và hỗ trợ điều trị các bệnh tắc nghẽn mạch máu như nhồi máu cơ tim và đột quỵ.

2. Tại sao cần tối ưu hóa điều kiện lên men Bacillus subtilis natto?
   Tối ưu hóa giúp tăng hoạt tính enzyme nattokinase, nâng cao hiệu quả sản xuất, giảm chi phí và tạo điều kiện phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng chất lượng cao.

3. Phương pháp Plackett-Burman và RSM-CCD có vai trò gì trong nghiên cứu?
   Plackett-Burman giúp sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng quan trọng, còn RSM-CCD tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy dựa trên các yếu tố đã chọn, từ đó xác định điều kiện sản xuất hiệu quả nhất.

4. Sấy thăng hoa có ưu điểm gì trong bảo quản enzyme?
   Sấy thăng hoa giữ được hoạt tính enzyme cao, giảm độ ẩm sản phẩm, tăng thời gian bảo quản và tạo ra sản phẩm bột tiện lợi cho sử dụng và vận chuyển.

5. Sản phẩm nattokinase có an toàn khi sử dụng không?
   Nattokinase đã được sử dụng an toàn trong thực phẩm Natto truyền thống hơn 1000 năm, nghiên cứu lâm sàng cho thấy không có tác dụng phụ nghiêm trọng, phù hợp dùng dự phòng và hỗ trợ điều trị.

Kết luận

• Nghiên cứu đã xác định được điều kiện lên men tối ưu cho Bacillus subtilis natto trên cơ chất đậu nành gồm mật độ 10^7 CFU/g, thời gian 36 giờ, pH 7.5 và nhiệt độ 37°C, đạt hoạt tính nattokinase 136 FU/g.
• Phương pháp quy hoạch thực nghiệm Plackett-Burman kết hợp RSM-CCD là công cụ hiệu quả trong tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp enzyme.
• Sản phẩm bột đậu nành giàu hoạt tính nattokinase được tạo ra bằng sấy thăng hoa có độ ẩm 4.3% và hoạt tính enzyme 515 FU/g, mở rộng ứng dụng thực phẩm chức năng tại Việt Nam.
• Kết quả nghiên cứu góp phần phát triển công nghệ sinh học enzyme và sản phẩm phòng ngừa bệnh tắc nghẽn mạch máu.
• Đề xuất tiếp tục nghiên cứu nâng cao năng suất enzyme, phát triển quy trình công nghiệp và ứng dụng lâm sàng trong thời gian tới.

Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp áp dụng kết quả nghiên cứu để phát triển sản phẩm nattokinase chất lượng cao, đồng thời mở rộng hợp tác nghiên cứu ứng dụng trong y tế và thực phẩm chức năng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: TONG QUAN 1.1 Bacillus subtilis natto va san pham Natto 1.1 Lich sw Tên dau tiên của Bacillus subtilis là subtilis virio trong nam 1835 sau này được đôi tên là Bacillus subtilis năm 1872. Bacillus subtilis cồn có một số tên khác như Bacillus uniflagellatus, Bacillus globigii, va Bacillus natto (Entrez Genome Project, NCBI). Năm 1949-1957 Henry và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis (Gibson, Gordon, 1974).2 Đặc điểm phân loại va sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis Theo phan loại của Bergey (1974) vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc: Bo: Eubacteriales Ho: Bacillaceae Giống: Bacillus Loai: Bacillus subtilis (Haritha Meruvu, Meena Vangalapati, 2001) Khi giải trình tự gen 16S rDNA cho thay DNA của B.subtilis natto va B.subtilis có mức độ tương đồng cao (Gibson, Gordon, 1974). Điều nay chứng tỏ chúng cùng một loài.

Đặc điểm phân bố Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc trong đường ruột, chúng phân bố hầu hết trong tự nhiên. Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10-100 triệu CFU/g. Dat nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiểm. Nước va bùn cửa sông cũng như nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis (Gibson, Gordon, 1974).3 Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis là vi khuân Gram dương thường được tìm thấy trong đất thuộc loài Bacillus.

Bacillus subtilis là loại vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng sống trong điều kiện thiếu oxy (Nakano, 1997). Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ kích thước: rộng 0,7-0,8 xm; chiều dài 2-3um. Đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động, sinh bào tử nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và năm giữa tế bào, phát triển băng cách nảy chổi do sự nứt của bào tử. Vách tế bào là một cau trúc cứng chắc bên ngoài tế bào, thành phần vách bao gồm peptidoglycan, peptidoglycan là một polymer của đường va amino acid.

Peptidoglycan trong vi khuẩn Bacillus subtilis được biết là murein và các thành phan khác là teichoic acid, lipoteichoic acid và protein, vách tế bào tạo thành rào chăn giữa môi trường và các nội bào vi khuẩn, nó cũng giúp duy trì hình dạng và chịu đựng áp lực cho tế bào vi khuẩn (Lê Thi Bich Phượng, 2000).1 Vi khuẩn Bacillus subtilis (Chang, Fan, 2000) Su phan biét B.subtilis natto voi cac vi khuẩn khác thuộc loại B.subtilis dua vào sự khác nhau của bộ gen, nhu cầu bắt buộc sử dụng biotin để phát triển, khả năng sản xuất chất nhớt là polyglutamate (Rahman, 2008). Khả năng sản xuất y- Polyglutamate (PGA) là một đặc điểm quan trọng để phân biệt B.subtilis natto với các chủng khác.subtilis natto có khả năng sinh y-PGA trong môi trường không có L-glutamate trong khi đó các chủng vi khuẩn khác cần phải có L-glutamate mới sản xuất được y-PGA (Tamang, 2010).4 Đặc điểm sinh lý Đặc tinh Bacillus subtilis bao gồm: Khả năng phát triển trong khoảng pH từ 5.0, khoảng nhiệt độ lớn 9 - 55°C (Steinkraus, 2004). Bacillus subtilis có kha năng thủy phân nhanh chóng hau hết các co chất có nguồn gốc động thực vật gồm cellulose, tinh bột, pectin, protein, agar, hydrocacbon, gelatin. có khả năng lên men các loại đường như glucose, arabinose, xylose, manitol và có khả năng su dụng citrate.

Ngoài ra Bacillus subtilis còn có hoạt tính bacteriocin, tạo ra các chất subtilisin, tao acid từ các đường, nitrat hóa, phản nitrat hóa, cố định nito, tự dưỡng, hô hấp tùy tiện, là vi khuẩn ưa acid, ưa kiềm, ưa nhiệt, ưa tối, sống ký sinh, hầu hết tạo bào tử nên có khả năng sống sót cao trong môi trường (Lê Thị Bích Phượng, 2012). Môi trường thuận lợi để Bacillus subtilis phát trién tốt là môi trường Luria- Bertani hoặc môi trường thạch dinh dưỡng Nutrient Agar. Khi nuôi cấy trên đĩa thạch Bacillus subtilis có khuẩn lạc tròn, không đều hay phân tán. Đường kính khuẩn lạc 3-5mm, phát triển chậm, màu vàng xám ở giữa sm mau, ria có răng cưa.

Sau 1-4 ngày bể mặt nhăn nheo, màu hơi nâu. Trong môi trường canh Nutrient Broth Bacillus subtilis phát triển lam đục môi trường, tạo thành màng nhăn trên bề mặt, lắng cặn, ít hoặc không tạo nhớt. Bacillus subtilis lên men nhưng không sinh gas các loại đường: glucose, maltose, mannitol, sacharose, xylose, arabinose. Bacillus subtilis lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol, sacchrose, xylose, arabinose, Indol(-), VP(+), Nitrat (+), H;ạS (-), NHạ (+)catalase(+), amylase(+), casein(+), citrat(+), di động(+), hiéu khi(+) (Lé Thi Bich Phuong, 2012).5 Tính chất đối khang của Bacillus subtilis với một số loại vi sinh vật khác Do Bacillus subtilis là vi khuẩn bắt buộc đường ruột nên ngoài khả năng chịu acid dạ dày, các chất dịch tiêu hóa trong đường ruột, chúng còn có khả năng đấu tranh lại với các vi sinh vật gây bệnh ở đường ruột (Nguyễn Đức Lượng, 2006).

Moi trường nuôi cây nam bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một sô lượng lớn 6 sẽ gây ra sự cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sống giữa vi khuẩn và nắm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24h) sẽ sử dụng phân lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra hợp chất kháng khuẩn subtilin nên sự sinh trưởng của nam bị ức chế (Trần Quốc Tuan, 2014). Khi các chất đinh dưỡng bat đầu cạn kiệt, các vi sinh vật đối phó bằng cách chuyển sang tình trạng “ngủ đông”, hay nghỉ ngơi trong một thời gian dài. Bacillus subtilis thực hiện điều đó bang cách tao ra bào tử có thé duy tri trạng thái sống tiềm tàng trong nhiều năm, thậm chí hàng thế kỷ (Vũ Thị Thứ, 1996).

Tuy nhiên trong thí nghiệm của mình, nhóm nghiên cứu nhận thay trong giai doan rất sớm của sự hình thành bào tử một vài tế bào Bacillus subtilis đã tạo ra hợp chất kháng khuẩn dé giết chết những tế bào vi khuẩn ở bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này, hợp chất kháng khuẩn sẽ phá vỡ màng tế bào vi khuẩn bị tan công, giải phóng chất dinh dưỡng và tế bào đang hình thành bào tử tiêu thụ. Theo các nhà nghiên cứu trên, quá trình tạo bào tử tiêu tốn một lượng lớn năng lượng, phải mat vài giờ và khi bat đầu thì không thé đảo ngược. Do đó, vi khuẩn sẽ tránh thời điểm đó càng lâu càng tốt, đặc biệt khi dinh dưỡng trong môi trường bị cạn kiệt, vi khuẩn sẽ tiêu diệt những vi khuẩn xung quanh để hút chất dinh dưỡng và kéo dài thời kỳ chờ đợi nay, cho đến khi chuyển sang sống tiềm sinh. Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi sinh vật giúp cho vi khuẩn vượt qua những điều kiện bất lợi như: môi trường nghèo dinh dưỡng, nhiệt độ, pH không thích hop, môi trường tích lũy nhiều sản phẩm trao đôi chat bat lợi.

Mỗi vi khuẩn chỉ tạo được một bào tử. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mam để trở về dạng tế bào sinh dưỡng (Nguyễn Lân Dũng, 2010).6 Sản phẩm truyền thống Natto Một số nhà nghiên cứu đã đưa ra giả thuyết Natto có thé có nguồn gốc tiền su, trong giai đoại cuối của thời ky Edo (1600-1868). Trong thời gian này, đậu nành được đóng gói trong rơm và chôn dưới lòng đất trong một tuần hoặc nhiều hơn, một cách tự nhiên Ö.subrilis natto trong rom tạo điều kiện xảy ra quá trình lên men đậu tương. Ngày nay, người ta đã phát hiện ra rang Natto được tạo ra từ đậu nành nau chín và được lên men với B.

Các vi khuẩn kích hoạt 7 một quá trình lên men đậu, chúng nôi tiêng là chua, có mùi đặc trưng và kêt câu trơn. Ngày nay, Natto luôn có săn ở Nhật Bản, Natto được ăn băng nhiêu cách như là pha trộn với lúa mi, miso, bap cai hoặc trứng, hôn hợp xà lách, trong một chiéc bánh hamburger chay hoặc như một thứ gia vi.2 San phẩm truyền thống Natto (Sumi, Hamada, 1987) Hiệu qua của Natto một phan do được làm từ nguyên liệu giàu dinh dưỡng đậu nành. Ngoài ra trong quá trình lên men B.subtilis natto sản xuất ra nhiều loại enzyme, vitamin, acid amin và các chất dinh dưỡng khác, những chất này làm cho natto trở thành một loại thực phẩm bồ dưỡng, có lợi cho sức khỏe. Đáng chú ý nhất là enzyme nattokinase có tác dụng ngăn chặn va điều trị bệnh tặc nghẽn mạch máu (Sumi, Hamada, 1987).

Chất lượng của Natto phụ thuộc vào loại đậu nành và chủng B.subtilis natto sử dụng, B.subtilis natto có tiềm năng như là chủng probiotic, mặc dù nó không phải là chủng có ưu thế vượt trội trong hệ tiêu hóa của con người nhưng nó lại có khả năng tạo bào tử, bào tử này có thể chống lại độ acid cao trong da day điều đó giúp B.subtilis natto có thé sống sót khi đưa vào co thé. Ngoài ra natto còn có khả năng ngăn chặn bệnh đau tim, đột quy, tinh trạng suy nhược cơ thé, ngăn chặn bệnh ung thu, ngăn chan chứng loãng xương, tác dung khang khuẩn, cải 8 thiện kha năng tiêu hóa và ngăn chan sự roi loại trong ruột, ngăn chan lão hóa va béo phì, giúp phát triển não (Sumi, Hamada, 1987).1 Cau trúc của nattokinase Một số tên khác của nattokinase là Natto Extract, Nattokinasa, Fermented Soybeans va Soy Natto. Bên dưới là cau trúc hóa học của nattokinase được thé hiện qua hình 1.3 Câu trúc hóa học của nattokinase (Omur a Khito sugi, 2005) Nattokinase là một enzyme ngoại bào có bản chất là protein, có cau trúc không gian tạo thành từ một chuỗi polypeptide duy nhất bao gdm 275 amino acid, có trọng lượng phân tử WM=27728Da, pI= 0,8+0,3, có tinh chất tương đồng cao với cơ chất và không có cầu disulfide (Pais, Alexy, 2006). Nattokinase thuộc họ subtilisin của serine protease kiềm, cũng có trung tâm hoạt động bao gồm nhóm hydroxyl của Ser-221, nhóm imidazon của His-64 và nhóm carboxyl của Asp-32 (Carer, Wells, 1998) Bang 1.1 Đặc tính của nattokinase Tên protein (Enzyme) Tên giới thiệu: Subtilisin NAT, EC=3 4.62 Tén thay thé: Nattokinase, cardiokinase Tén genes aprN Loài Bacillus subtilis subsp.

natto So xác nhận phân loại 86029 [NCBI] Phan loai Bacteria » Firmicutes › Bacillales › Bacillaceae » Bacillus Chiều dài trình tự 275AA Dạng trình tự Complete Chức năng Subtilisin là serine protease alkaline ngoại bào, nó là chất xúc tác phân hủy protein, peptide aminde va phân hủy fibrin Hoạt tinh xúc tac Phan huy protein, dac biét la peptide xuong. Phan huy peptide amide Cau trúc Monomer (Kim, Choi, 2000) 1.2 Sinh tổng hợp nattokinase Nattokinase được mã hóa boi gen aprE (subtilisin E từ B.subtilis), aprN (subtilisin nattokinase từ B.subtilis natto), gen này chủ yếu được biếu hiện ở pha 6n định trong tăng trưởng ở B.subtilis natto dưới sự kiểm soát của promotor có liên quan đến tạo bào tử (Ps, s-porulation). Ps chỉ hoạt động khi có sự gan kết với Spo0A, là một DNA-binding-protein giữ vai trò điều hòa chủ đạo (master regulator) — điều hòa trực tiếp và gián tiếp khoảng 500 gen và có liên quan chặt chẽ đến quá trình tao bào tử, hiện tượng khả nạp ở B.