Thiết kế chất ức chế interleukin-33 bằng phương pháp in silico dựa trên mảnh cấu trúc

Nghiên cứu thiết kế chất ức chế interleukin 33 bằng phương pháp in silico dựa trên mảnh cấu trúc, mở ra hướng đi mới trong điều trị bệnh.

• Tác giả: Vũ Ngọc Diệu Linh
• Người hướng dẫn: ThS. Mai Thành Tấn
• Trường học: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Dược
• Đề tài: Thiết kế chất ức chế IL-33 bằng phương pháp in silico
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Interleukin
• 1.2. Họ interleukin-1
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về thiết kế chất ức chế IL 33 bằng phương pháp in silico

Thiết kế chất ức chế IL-33 là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong y học hiện đại. IL-33, một cytokine thuộc họ interleukin-1, có vai trò quan trọng trong nhiều bệnh lý như viêm, tự miễn và nhiễm trùng. Việc phát triển các chất ức chế IL-33 có thể mở ra hướng điều trị mới cho các bệnh này. Phương pháp in silico, với khả năng mô phỏng và dự đoán tương tác giữa protein và ligand, đã trở thành công cụ hữu ích trong việc thiết kế thuốc. Nghiên cứu này sẽ tập trung vào việc áp dụng phương pháp in silico để phát triển các chất ức chế IL-33 hiệu quả.

1.1. IL 33 và vai trò sinh học của nó trong bệnh lý

IL-33 có vai trò quan trọng trong việc điều hòa đáp ứng miễn dịch. Nồng độ IL-33 tăng cao trong các bệnh tự miễn và viêm, cho thấy mối liên hệ giữa IL-33 và sự phát triển của các bệnh lý này. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc ức chế IL-33 có thể giúp giảm triệu chứng và cải thiện tình trạng bệnh nhân.

1.2. Phương pháp in silico trong thiết kế thuốc

Phương pháp in silico cho phép mô phỏng các tương tác giữa protein và ligand, giúp xác định các mảnh cấu trúc có khả năng gắn kết tốt với IL-33. Các công cụ như docking phân tử và mô phỏng động lực học phân tử được sử dụng để tối ưu hóa thiết kế thuốc, từ đó tăng khả năng ức chế IL-33.

II. Thách thức trong việc thiết kế chất ức chế IL 33

Mặc dù có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu chất ức chế IL-33, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức. Một trong những vấn đề chính là bề mặt tương tác của IL-33 tương đối phẳng, khiến cho việc phát triển các thuốc phân tử nhỏ gặp khó khăn. Hơn nữa, việc xác định các mảnh cấu trúc có khả năng gắn kết tốt với IL-33 cũng là một thách thức lớn. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng cần có các phương pháp mới để tối ưu hóa khả năng gắn kết của các chất ức chế.

2.1. Vấn đề về bề mặt tương tác của IL 33

Bề mặt tương tác phẳng của IL-33 làm cho các thuốc phân tử nhỏ khó gắn kết chặt chẽ. Điều này đòi hỏi các nhà nghiên cứu phải tìm ra các mảnh cấu trúc có khả năng tạo ra các liên kết mạnh mẽ với IL-33.

2.2. Khó khăn trong việc xác định mảnh cấu trúc tiềm năng

Việc xác định các mảnh cấu trúc có khả năng gắn kết tốt với IL-33 là một thách thức lớn. Cần có các phương pháp sàng lọc hiệu quả để tìm ra các mảnh cấu trúc phù hợp, từ đó phát triển các chất ức chế hiệu quả.

III. Phương pháp in silico trong thiết kế chất ức chế IL 33

Phương pháp in silico đã được áp dụng thành công trong việc thiết kế chất ức chế IL-33. Các bước chính bao gồm thu thập dữ liệu từ các thư viện mảnh cấu trúc, thực hiện docking phân tử và mô phỏng động lực học phân tử. Các công cụ như LeadIT và GROMACS được sử dụng để tối ưu hóa thiết kế thuốc. Kết quả từ các mô phỏng cho thấy nhiều mảnh cấu trúc có khả năng gắn kết tốt với IL-33, mở ra hướng đi mới trong nghiên cứu thuốc.

3.1. Thu thập và sàng lọc mảnh cấu trúc

Các mảnh cấu trúc được thu thập từ các thư viện như ChemDiv, Maybridge và ZINC. Sau đó, các mảnh này được sàng lọc bằng phương pháp docking để xác định khả năng gắn kết với IL-33.

3.2. Mô phỏng động lực học phân tử

Mô phỏng động lực học phân tử được thực hiện để đánh giá sự ổn định và khả năng gắn kết của các mảnh cấu trúc với IL-33. Kết quả từ mô phỏng cung cấp thông tin quan trọng để tối ưu hóa thiết kế thuốc.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu đã thu được nhiều kết quả đáng khích lệ trong việc thiết kế chất ức chế IL-33. Qua quá trình sàng lọc, nhiều mảnh cấu trúc đã được xác định có khả năng gắn kết tốt với IL-33. Chất tiềm năng nhất được xác định là CD_P207-8824_ZINC16911528_7prc_BPB1L401N13, cho thấy khả năng ức chế IL-33 hiệu quả. Kết quả này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc điều trị các bệnh liên quan đến IL-33.

4.1. Các mảnh cấu trúc tiềm năng

Nghiên cứu đã xác định được nhiều mảnh cấu trúc có khả năng gắn kết tốt với IL-33. Các mảnh này được mô phỏng động lực học để đánh giá khả năng ức chế.

4.2. Chất ức chế IL 33 tiềm năng

Chất CD_P207-8824_ZINC16911528_7prc_BPB1L401N13 được xác định là chất ức chế IL-33 tiềm năng nhất. Kết quả cho thấy chất này có khả năng gắn kết chặt chẽ với IL-33 và tạo ra nhiều liên kết với các acid amin quan trọng.

V. Kết luận và triển vọng tương lai

Nghiên cứu đã chứng minh rằng phương pháp in silico có thể được áp dụng hiệu quả trong thiết kế chất ức chế IL-33. Các kết quả đạt được mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc điều trị các bệnh liên quan đến IL-33. Tuy nhiên, cần tiến hành thêm các thử nghiệm in vitro và in vivo để xác định tính khả thi của các chất ức chế này trong điều trị thực tế.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Nghiên cứu đã thành công trong việc thiết kế chất ức chế IL-33 bằng phương pháp in silico. Các mảnh cấu trúc tiềm năng đã được xác định và đánh giá.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Cần tiến hành các thử nghiệm in vitro và in vivo để xác định tính khả thi của các chất ức chế IL-33. Hơn nữa, việc tối ưu hóa cấu trúc của các chất này cũng cần được thực hiện để nâng cao hiệu quả điều trị.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Interleukin-33 (IL-33), còn được gọi là IL-1F11, là một cytokine thuộc họ Interleukin-1 (IL-1) được mã hóa bởi gen IL33 nằm trên nhiễm sắc thể 9p24. Cytokine này tham gia điều hòa cả miễn dịch tự nhiên và miễn dịch thu nhận thông qua việc liên kết đặc hiệu với thụ thể ST2 (IL-1R4) cùng đồng thụ thể IL-1RAcP (IL-1R3). Nhiều bằng chứng sinh học thực nghiệm và lâm sàng đã khẳng định nồng độ IL-33 gia tăng rõ rệt trong các bệnh lý viêm mạn tính đường hô hấp (đặc biệt là hen suyễn, bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính - COPD), các bệnh tự miễn (viêm khớp dạng thấp, lupus ban đỏ hệ thống, viêm loét đại tràng) và một số rối loạn hệ thần kinh trung ương. Do đó, việc ức chế tương tác giữa IL-33 và thụ thể ST2 được định hướng là một mục tiêu can thiệp điều trị tiềm năng.

Tuy nhiên, việc nghiên cứu phát triển các phân tử nhỏ ức chế trực tiếp IL-33 gặp phải thách thức lớn về mặt cấu trúc: bề mặt vị trí gắn kết của IL-33 tương đối phẳng và thiếu các túi gắn sâu đặc trưng, khiến các phân tử thuốc nhỏ thông thường khó tạo được liên kết bền vững và chặt chẽ. Để giải quyết trở ngại này, chiến lược thiết kế thuốc dựa trên mảnh cấu trúc (Fragment-Based Drug Discovery – FBDD) kết hợp các công cụ tính toán mô phỏng (in silico) được áp dụng. Phương pháp này cho phép nhận diện các phân tử phân tử lượng nhỏ có khả năng liên kết tối ưu vào từng tiểu vùng hoặc các acid amin trọng yếu, từ đó ghép nối thành phân tử hoàn chỉnh có ái lực và độ đặc hiệu cao.

Đề tài đặt ra mục tiêu tổng quát: "Thiết kế chất ức chế interleukin-33 bằng phương pháp in silico dựa trên mảnh cấu trúc". Các nhiệm vụ và mục tiêu cụ thể được xác định gồm 4 nội dung:

1. Thu thập cơ sở dữ liệu các mảnh cấu trúc từ ba thư viện hóa chất ChemDiv, Maybridge và ZINC.
2. Sàng lọc in silico các mảnh cấu trúc gắn kết tốt với IL-33 bằng phương pháp docking phân tử và mô phỏng động lực học phân tử (MDS).
3. Thiết kế và sàng lọc in silico các chất có tiềm năng ức chế IL-33 dựa trên các mảnh cấu trúc đã lựa chọn, hướng đến mục tiêu ức chế tương tác IL-33/ST2.
4. Tính toán năng lượng gắn kết tự do của hợp chất tiềm năng nhất thu được sau quá trình sàng lọc và thiết kế.

Đối tượng nghiên cứu của khóa luận là mô hình tương đồng (homology model) của IL-33 người (kế thừa từ nghiên cứu của Mai Thành Tấn và cộng sự, xây dựng bổ sung trên cấu trúc tinh thể mã PDB 4KC3) và cơ sở dữ liệu gồm 132.232 mảnh cấu trúc từ các thư viện thương mại. Về phạm vi không gian, nghiên cứu tập trung khảo sát khoang gắn kết tại vị trí 1 của IL-33 – nơi có tính bảo tồn cấu trúc cao trong tương tác với miền D1D2 của thụ thể ST2. Khóa luận được hoàn thành năm 2021 tại Bộ môn Hóa Dược, Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Nghiên cứu vận dụng cơ sở lý thuyết về sinh học phân tử của cytokine họ IL-1, cấu trúc tương tác protein - protein giữa IL-33 và thụ thể ST2, quy tắc lọc mảnh cấu trúc hóa học, cùng hệ thống phương pháp hóa tin và mô phỏng sinh học phân tử tính toán:

• Khung lý thuyết và mô hình đích tác động: Thụ thể ST2 tương tác với IL-33 tại hai vị trí không gian riêng biệt. Vị trí 1 có độ cứng vững và bảo tồn cấu trúc cao, được trung chuyển bởi các acid amin có tính acid và phân cực gồm Glu144, Glu148, Asp149 và Asp244; các gốc này tạo cầu muối và liên kết hydro trực tiếp với các acid amin đối ứng trên miền D1D2 của ST2 (Arg38, Lys22, Arg198, Arg35). Đột biến tại các acid amin này (đặc biệt là Asp149 và Glu148) làm suy giảm nghiêm trọng ái lực gắn kết IL-33/ST2. Do đó, các acid amin này được xác định là các điểm nóng ("hot spots") để định vị khoang gắn kết.
• Tiêu chuẩn lọc mảnh cấu trúc (Quy tắc Luật 3 - Rule of Three): Các mảnh cấu trúc được sàng lọc sơ bộ dựa trên các tiêu chí hóa lý: khối lượng phân tử (MW) < 300 Da, hệ số phân bố octanol/nước tính toán (ClogP) $\le$ 3, số lượng nhóm cho liên kết hydro $\le$ 3, số lượng nhóm nhận liên kết hydro $\le$ 3 và số liên kết quay $\le$ 3.
• Phương pháp nghiên cứu tính toán và nguồn dữ liệu:
  • Nguồn dữ liệu: Thư viện ZINC12 (ở khoảng pH 4,5–6,0), thư viện Maybridge, các tập con của thư viện ChemDiv (gồm thư viện chuẩn, thư viện 3D, thư viện mảnh chứa Fluor và thư viện mảnh chứa Brom), cùng thư viện các đoạn nối (linkers) từ ZINC và Protein Data Bank (PDB).
  • Xử lý dữ liệu và cấu trúc: Phần mềm Molecular Operating Environment (MOE 2015.10) được sử dụng để chuẩn bị cấu trúc protein bằng công cụ QuickPrep (proton hóa, tối thiểu hóa năng lượng với gradient RMS 0,0001 kcal/mol/Å) và tối thiểu hóa năng lượng phối tử bằng Energy Minimize. MOE cũng được dùng để lọc trùng lặp cấu trúc (công cụ Unique) và phân tích vân tay tương tác (PLIF - Protein-Ligand Interaction Fingerprints).
  • Docking phân tử: Thực hiện bằng công cụ FlexX tích hợp trong phần mềm LeadIT 2.8. Khoang gắn kết được định nghĩa dựa trên các acid amin Glu144, Glu148, Asp149, Asp244 và mở rộng bán kính 14 Å. Thuật toán chọn lưu cấu dạng tốt nhất (Top 1 pose) với tối đa 1.000 lời giải cho mỗi vòng lặp và tối đa 200 phân mảnh.
  • Mô phỏng động lực học phân tử (MDS): Sử dụng phần mềm GROMACS 2020.2 với trường lực CHARMM27. Hệ mô phỏng được đặt trong hộp đa diện 12 mặt với khoảng cách tối thiểu đến biên là 1 nm, solvat hóa bằng mô hình nước TIP3P và trung hòa điện tích bằng ion $Na^+/Cl^-$ ở nồng độ sinh lý 0,15 M NaCl. Hệ được tối thiểu hóa năng lượng (100 ps), cân bằng đẳng nhiệt - đẳng tích (NVT, 300 K, 100 ps) và cân bằng đẳng nhiệt - đẳng áp (NPT, 1 bar, 100 ps). Thời gian mô phỏng MDS là 10 ns cho các mảnh và chất ghép nối sàng lọc, mở rộng lên 50 ns cho hợp chất tiềm năng nhất.
  • Đánh giá quỹ đạo động lực học: Sử dụng phần mềm VMD để tính toán số lượng và tần suất hình thành liên kết hydro (khoảng cách cho - nhận $\le$ 3,5 Å, góc $\ge$ 130°); tính toán giá trị độ lệch trung bình bình phương (RMSD) của khung carbon protein và phối tử, cùng độ dao động trung bình bình phương (RMSF) của các acid amin carbon-alpha.
  • Ghép nối mảnh cấu trúc: Thực hiện trên phần mềm SeeSAR 11.2 thông qua các công cụ Binding Site, Inspirator và chế độ Linking & Merging, kết hợp các đoạn nối từ thư viện ZINC và PDB.
  • Tính toán năng lượng gắn kết tự do (Binding Free Energy - BFE): Sử dụng công cụ gmx_MMPBSA với phương pháp MM/GBSA (kết hợp cơ học phân tử và diện tích bề mặt Born tổng quát) ở điều kiện nhiệt độ 298 K, nồng độ muối 0,15 M trên dữ liệu quỹ đạo MDS.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương này hệ thống hóa các kiến thức nền tảng về cytokine IL-33 và cơ sở khoa học của hướng tiếp cận ức chế:

• Đặc điểm sinh học và cấu trúc của IL-33: Phân tích cấu trúc phân tử của IL-33 gồm vùng nhân ở đầu N-tận và vùng cytokine giống IL-1 ở đầu C-tận. Khối lượng phân tử lý thuyết 30.759 Da, pI = 8,89. Quá trình phóng thích và hoạt hóa từ dạng tiền chất (full-length, 270 acid amin, 30 kDa) thành dạng trưởng thành (mature, 18–21 kDa) nhờ các protease viêm (elastase, cathepsin G, proteinase 3), với hoạt tính sinh học tăng từ 10 đến 30 lần.
• Cơ chế tương tác IL-33/ST2: Chi tiết hóa cấu trúc ngoại bào của ST2 gồm ba miền D1, D2, D3 và bản lề linh động giữa D1D2 và D3. Làm rõ hai vị trí gắn kết giữa IL-33 và ST2, trong đó nhấn mạnh vị trí 1 có diện tích tiếp xúc lớn, tính bổ sung điện tích rõ rệt (IL-33 mang điện tích âm, ST2 mang điện tích dương) và vai trò của các acid amin thiết yếu Glu144, Glu148, Asp149, Asp244.
• Vai trò bệnh học: Tổng thuật chi tiết vai trò của trục tín hiệu IL-33/ST2 trong đáp ứng viêm (qua con đường MyD88, IRAK1/4, NF-$\kappa$B, MAP kinase), các bệnh viêm đường thở (hen suyễn, COPD), bệnh da liễu, tim mạch, các bệnh lý tự miễn (viêm khớp dạng thấp, lupus ban đỏ hệ thống, bệnh viêm ruột), nhiễm trùng và tổn thương thần kinh trung ương.
• Hiện trạng phát triển thuốc ức chế IL-33: Phân tích hiện trạng các liệu pháp sinh học (kháng thể đơn dòng, bẫy thụ thể hòa tan sST2, IL-33trap) đang thử nghiệm lâm sàng nhưng có nhược điểm phải dùng đường tiêm; khảo sát các nghiên cứu về chất ức chế phân tử nhỏ (Ro26-4550, SP-4206, hợp chất 13b AIK3-305, diacerein, các chất phát hiện qua sàng lọc ảo như DB00158, DB00642, UNPD36).
• Nguyên lý thiết kế thuốc hợp lý: Giới thiệu cơ sở lý thuyết về sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc, nguyên lý docking phân tử (docking bán linh động), phương pháp mô phỏng động lực học phân tử (MDS), phương pháp tính năng lượng tự do MM/PBSA - MM/GBSA và chiến lược thiết kế thuốc dựa trên mảnh cấu trúc (FBDD).

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm in silico và các thông số kỹ thuật được thiết lập:

• Chuẩn bị cơ sở dữ liệu: Thu thập 132.232 mảnh cấu trúc ban đầu từ 6 tập dữ liệu. Áp dụng bộ lọc Luật 3 trên phần mềm MOE 2015.10 để thu được 53.959 mảnh cấu trúc đạt chuẩn.
• Quy trình docking phân tử: Thiết lập mô hình thụ thể từ cấu trúc homology của IL-33. Định vị khoang gắn kết 14 Å quanh các gốc Glu144, Glu148, Asp149, Asp244 trên LeadIT 2.8. Thực hiện docking với thuật toán FlexX và trích xuất điểm docking (kJ/mol), kết hợp phân tích kiểu tương tác qua công cụ PLIF và Ligand Interaction.
• Mô phỏng động lực học phân tử: Trình bày chi tiết từng bước thiết lập hệ thống trên GROMACS 2020.2: xây dựng file topology cho protein và ligand (sử dụng trường lực CHARMM27), thiết lập hộp solvat hóa TIP3P, trung hòa điện tích bằng ion $Na^+$ và $Cl^-$ (0,15 M), tối thiểu hóa năng lượng trong 100 ps, cân bằng hệ qua hai giai đoạn NVT (100 ps, 300 K) và NPT (100 ps, 1 bar), và tiến hành mô phỏng 10 ns.
• Quy trình thiết kế chất mới và tính toán năng lượng tự do: Mô tả cách thức đưa các mảnh cấu trúc tối ưu vào SeeSAR 11.2, sử dụng công cụ Inspirator và liên kết phối tử bằng thư viện đoạn nối của ZINC và PDB để tạo các hợp chất lai. Thiết lập công cụ gmx_MMPBSA với phương pháp MM/GBSA để tính toán năng lượng liên kết Gibbs ($\Delta G_{gắn\ kết}$) trên quỹ đạo động lực học phân tử.

Chương 3. Kết quả và bàn luận

Chương này trình bày toàn bộ số liệu thu được từ các giai đoạn sàng lọc, thiết kế và phân tích liên kết:

• Kết quả sàng lọc thư viện mảnh và docking: Sau khi lọc theo Luật 3, 53.959 mảnh cấu trúc được đưa vào docking. Có 53.698 mảnh dock thành công vào khoang gắn kết của IL-33 (đạt tỷ lệ 99,52%). Sau khi loại bỏ các cấu trúc trùng lặp bằng công cụ Unique trong MOE 2015, thu được 42.626 mảnh cấu trúc độc bản. Phân bố điểm docking cho thấy phần lớn các mảnh (79,52%) có ái lực trung bình (từ –20 đến –10 kJ/mol); có 3.359 mảnh (chiếm 7,88%) đạt điểm docking nhỏ hơn –20 kJ/mol thể hiện khả năng gắn kết tốt.

Khoảng điểm số docking (kJ/mol)	Số lượng mảnh	Tỷ lệ (%)
Nhỏ hơn –30	4	0,01%
Từ –30 đến –20	3.355	7,87%
Từ –20 đến –10	33.896	79,52%
Từ –10 đến 0	5.371	12,60%
Tổng cộng	42.626	100,00%

• Phân tích tương tác đặc hiệu qua PLIF: Phân tích cho thấy tương tác phân bố chủ yếu ở Ile145; đối với các acid amin quan trọng, tỷ lệ mảnh tạo tương tác với Glu144 đạt 27,04% (trong đó 6,11% tạo liên kết hydro và 1,25% tạo liên kết ion), với Glu148 đạt 4,31% (trong đó 3,55% tạo liên kết hydro và 2,90% tạo liên kết ion). Ngược lại, các tương tác với Asp149 và Asp244 hầu như không đáng kể trong nhóm các mảnh có điểm số docking tốt (< –20 kJ/mol).
• Sàng lọc và mô phỏng động lực học các mảnh tiềm năng:
  • Nhóm tương tác với Glu144: Xác định được 251 mảnh tạo liên kết hydro/ion với Glu144 có điểm docking < –20 kJ/mol. Chọn 20 mảnh có điểm docking âm nhất để chạy MDS 10 ns. Kết quả phân tích độ ổn định RMSD, RMSF và tần suất liên kết hydro đã xác định được 4 mảnh tối ưu nhất gồm: CD_P207-8824, CD_P207-8825, ZINC72266122 và ZINC88324138 (đều duy trì tần suất tạo liên kết hydro với Glu144 > 75% trong suốt 10 ns).
  • Nhóm tương tác với Glu148: Xác định được 364 mảnh tạo tương tác với Glu148 có điểm docking < –20 kJ/mol. Chạy MDS 10 ns cho 20 mảnh hàng đầu. Kết quả chọn ra 5 mảnh ổn định và tạo liên kết hydro tốt nhất gồm: ZINC16911528, ZINC13856292, ZINC31720446, ZINC21952334 và ZINC72201364.
• Thiết kế và sàng lọc hợp chất mới: Tiến hành ghép nối ngẫu nhiên 4 mảnh gắn kết Glu144 và 5 mảnh gắn kết Glu148 trên SeeSAR 11.2 thông qua thư viện đoạn nối ZINC và PDB, thu được 2.573 hợp chất mới. Các hợp chất này được tiếp tục docking và mô phỏng MDS 10 ns để đánh giá lại ái lực và độ bền liên kết.
• Khảo sát hợp chất tiềm năng nhất: Hợp chất tối ưu nhất được xác định là CD_P207-8824_ZINC16911528_7prc_BPB1L401N13 (kết hợp giữa mảnh P207-8824 của ChemDiv, mảnh ZINC16911528 của ZINC và đoạn nối 7prc_BPB1L401N13 từ PDB). Hợp chất này được mô phỏng động lực học kéo dài đến 50 ns và tính toán năng lượng gắn kết tự do bằng phương pháp MM/GBSA. Kết quả cho thấy phức hợp duy trì giá trị RMSD ổn định, gắn kết bền vững trong khoang liên kết và duy trì mạng lưới liên kết hydro dày đặc với các acid amin đích.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đạt được các kết quả định lượng cụ thể qua quy trình sàng lọc và thiết kế nhiều giai đoạn:

Giai đoạn nghiên cứu / Quy trình	Dữ liệu đầu vào	Kết quả thu được	Tiêu chí đánh giá / Công cụ
Thu thập & lọc Luật 3	132.232 mảnh thô	53.959 mảnh chuẩn	Quy tắc RO3 ($MW < 300$, $ClogP \le 3$, ...)
Docking phân tử sàng lọc	53.959 mảnh	42.626 mảnh duy nhất dock thành công	FlexX (LeadIT 2.8), lọc trùng bằng MOE 2015
Phân tích ái lực cao	42.626 mảnh	3.359 mảnh	Điểm docking < –20 kJ/mol
Lọc tương tác amino acid đích	3.359 mảnh	251 mảnh (Glu144), 364 mảnh (Glu148)	Công cụ PLIF & Ligand Interaction
Mô phỏng MDS 10 ns chọn mảnh	Top 20 mỗi nhóm	4 mảnh (Glu144), 5 mảnh (Glu148)	GROMACS 2020.2 (RMSD, RMSF, H-bond > 75%)
Ghép nối mảnh cấu trúc	4 mảnh $\times$ 5 mảnh	2.573 hợp chất mới	SeeSAR 11.2 (thư viện đoạn nối ZINC & PDB)
Sàng lọc chất lai & MDS 50 ns	2.573 hợp chất	1 chất tiềm năng nhất	CD_P207-8824_ZINC16911528_7prc_BPB1L401N13
Tính năng lượng tự do	Phức hợp 50 ns	Đánh giá $\Delta G_{gắn\ kết}$	gmx_MMPBSA (MM/GBSA, 298 K, 0,15 M NaCl)

• Đóng góp về mặt học thuật và phương pháp:
  • Khóa luận đã giải quyết được trở ngại cấu trúc bề mặt phẳng của IL-33 – vốn gây khó khăn cho việc định vị các chất phân tử nhỏ trong các nghiên cứu sàng lọc truyền thống trước đây. Bằng cách chia nhỏ bài toán tương tác thành việc tìm kiếm các mảnh gắn kết riêng biệt với hai amino acid quan trọng là Glu144 và Glu148, sau đó ghép nối qua đoạn nối thích hợp, nghiên cứu đã tạo ra một phân tử lai có độ khớp không gian và tương tác vượt trội.
  • Quy trình in silico được thiết lập chặt chẽ và nhất quán, tích hợp tuần tự từ sàng lọc quy tắc Luật 3, docking phân tử thông lượng lớn, phân tích vân tay tương tác PLIF, mô phỏng động lực học phân tử MDS và tính toán năng lượng tự do MM/GBSA.
• Đề xuất của tác giả: Tác giả kiến nghị cần tiếp tục tiến hành các thử nghiệm sinh học thực nghiệm in vitro (đo ái lực gắn kết qua SPR, thử nghiệm ức chế tế bào) và in vivo trên mô hình động vật, đồng thời tiến hành tối ưu hóa cấu trúc hóa dược của hợp chất CD_P207-8824_ZINC16911528_7prc_BPB1L401N13 để cải thiện các đặc tính dược động học nhằm hướng đến dạng thuốc dùng đường uống.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Nghiên cứu dừng lại ở mức độ tính toán và mô phỏng trên máy tính (in silico), toàn bộ các tương tác và năng lượng gắn kết được dự đoán qua mô hình lý thuyết mà chưa được kiểm chứng qua tổng hợp hóa học và thử nghiệm sinh học thực tế (in vitro, in vivo). Bên cạnh đó, trong quá trình sàng lọc mảnh cấu trúc, chưa tìm thấy các mảnh có ái lực cao (< –20 kJ/mol) tương tác trực tiếp được với hai acid amin trọng yếu còn lại là Asp149 và Asp244. Nghiên cứu cũng mới chỉ tập trung can thiệp vào vị trí gắn kết 1 mà chưa khảo sát đồng thời vị trí gắn kết 2 của phức hợp IL-33/ST2.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Tiến hành tổng hợp hóa học hợp chất CD_P207-8824_ZINC16911528_7prc_BPB1L401N13; thực hiện các thử nghiệm sinh hóa in vitro để xác định ái lực gắn kết ($K_d$, $IC_{50}$) và đánh giá tác động ức chế tế bào; mở rộng sàng lọc thêm các đoạn nối và dẫn xuất hóa học nhằm tối ưu hóa các thông số sinh khả dụng đường uống (ADMET).

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh: Thuộc các chuyên ngành Hóa Dược, Dược học, Công nghệ sinh học và Tin sinh học (Bioinformatics) đang thực hiện các đề tài về thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc (SBDD) hoặc thiết kế thuốc dựa trên mảnh cấu trúc (FBDD).
• Các nhóm nghiên cứu về bệnh lý miễn dịch - dị ứng: Cung cấp bức tranh tổng quan chi tiết và hệ thống về sinh học phân tử của cytokine IL-33, cấu trúc phức hợp IL-33/ST2 và các vị trí tương tác chức năng.
• Nội dung đáng tham khảo nhất: Quy trình chi tiết chuẩn bị hệ thống và các tham số kỹ thuật trong mô phỏng động lực học phân tử bằng GROMACS 2020.2; phương pháp phân tích vân tay tương tác PLIF trên MOE; và kỹ thuật ghép nối mảnh cấu trúc sử dụng SeeSAR 11.2 kết hợp thư viện đoạn nối PDB/ZINC.

Câu hỏi thường gặp

Vì sao tác giả lựa chọn chiến lược thiết kế thuốc dựa trên mảnh cấu trúc (FBDD) thay vì sàng lọc phân tử nhỏ thông thường trên IL-33?

Theo tác giả trình bày, IL-33 có bề mặt tại vị trí gắn kết với thụ thể ST2 tương đối phẳng, không có các túi gắn sâu rõ rệt. Đặc điểm này khiến các phân tử thuốc nhỏ thông thường khó thâm nhập sâu và gắn kết bền vững. Chiến lược FBDD cho phép nhận diện các mảnh phân tử rất nhỏ có khả năng gắn kết tối ưu vào từng acid amin quan trọng (như Glu144 hoặc Glu148), sau đó liên kết chúng lại bằng các đoạn nối phù hợp để tạo thành hợp chất mới có ái lực cao hơn và bao phủ tốt bề mặt phẳng của protein.

Vị trí gắn kết nào trên IL-33 được lựa chọn làm đích tác động và các acid amin trọng yếu gồm những gốc nào?

Nghiên cứu lựa chọn vị trí gắn kết 1 của IL-33 với miền D1D2 của thụ thể ST2 vì vị trí này có tính bảo tồn cấu trúc cao và ổn định hơn so với vị trí 2. Bốn acid amin trọng yếu ("hot spots") của IL-33 tại vị trí này được xác định là Glu144, Glu148, Asp149 và Asp244. Đây là các acid amin tích điện âm, tạo các liên kết ion (cầu muối) và liên kết hydro mang tính quyết định với các gốc Arg38, Lys22, Arg198 và Arg35 tích điện dương trên ST2.

Hợp chất tiềm năng nhất được phát hiện trong khóa luận có cấu trúc như thế nào và được tạo thành từ những thành phần nào?

Hợp chất tiềm năng nhất được định danh với mã CD_P207-8824_ZINC16911528_7prc_BPB1L401N13. Hợp chất này được tạo thành từ việc ghép nối mảnh P207-8824 (từ thư viện ChemDiv, có khả năng gắn kết tốt với Glu144), mảnh ZINC16911528 (từ thư viện ZINC, có khả năng gắn kết tốt với Glu148) thông qua đoạn nối có mã 7prc_BPB1L401N13 (trích xuất từ thư viện đoạn nối PDB).

Quá trình mô phỏng động lực học phân tử (MDS) và tính năng lượng gắn kết tự do được thực hiện bằng công cụ gì với các điều kiện nào?

Quá trình MDS được thực hiện bằng phần mềm GROMACS 2020.2 sử dụng trường lực CHARMM27, solvat hóa trong mô hình nước TIP3P với nồng độ 0,15 M NaCl để mô phỏng môi trường sinh lý; hệ được mô phỏng trong 10 ns (đối với các mảnh và chất lai sàng lọc) và 50 ns (đối với chất tiềm năng nhất). Năng lượng gắn kết tự do ($\Delta G_{gắn\ kết}$) của phức hợp được tính toán bằng công cụ gmx_MMPBSA theo phương pháp MM/GBSA ở điều kiện nhiệt độ 298 K và nồng độ muối 0,15 M.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Vũ Ngọc Diệu Linh đã xây dựng và ứng dụng thành công quy trình tính toán in silico tích hợp để thiết kế chất ức chế IL-33 dựa trên chiến lược mảnh cấu trúc. Từ hơn 132.000 mảnh cấu trúc ban đầu, nghiên cứu đã chọn lọc ra các mảnh gắn kết tối ưu với các acid amin trọng yếu Glu144 và Glu148, từ đó ghép nối thành công 2.573 hợp chất mới và xác định được phân tử tiềm năng nhất là CD_P207-8824_ZINC16911528_7prc_BPB1L401N13. Kết quả mô phỏng động lực học phân tử 50 ns và tính toán năng lượng tự do khẳng định hợp chất này có khả năng liên kết bền vững với IL-33, tạo tiền đề khoa học rõ ràng cho các thử nghiệm tổng hợp hóa dược và đánh giá hoạt tính sinh học tiếp theo.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Interleukin Thuật ngữ “interleukin” (IL) được sử dụng để chỉ một nhóm các cytokin phân tử nhỏ có chức năng điều hòa hệ thống miễn dịch, bao gồm sự tăng sinh, trưởng thành, di chuyển và bám dính của tế bào. Các cytokin này cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình biệt hoá và hoạt hóa tế bào miễn dịch.

Bên cạnh đó, các IL cũng cho thấy vai trò lớn trong các phản ứng viêm. IL khởi đầu một phản ứng bằng cách gắn với các thụ thể có ái lực cao nằm trên bề mặt tế bào [13]. Cho đến nay đã tìm ra hơn 60 cytokin được xem là IL. Vai trò của các IL trong cơ thể cũng như trong các bệnh lý ngày càng được làm rõ.

Dựa trên sự khác biệt về đặc điểm cấu trúc, các IL đã biết tính đến nay được chia thành bốn nhóm lớn, bao gồm: i. Các cytokin giống IL-1 ii. Các cytokin có cấu trúc xoắn bậc 1 (giống IL-4, chuỗi γ và giống IL-6/12) iii. Các cytokin có cấu trúc xoắn bậc 2 (giống IL-10 và IL-28) iv.

Các cytokin giống IL-17. Ngoài ra còn có một số IL không thuộc 4 nhóm kể trên do chưa có thông tin đầy đủ hoặc có sự khác biệt về cấu trúc như các cytokin gây đáp ứng miễn dịch loại 2, các IL với hoạt tính protein hóa tế bào bạch cầu, và một số IL khác. Họ interleukin-1 Họ interleukin 1 (IL-1) có 11 thành viên (Bảng 1. Mỗi cytokin trong họ được mã hóa bởi một gen riêng biệt, bao gồm 7 chất có hoạt tính chủ vận (IL-1α, IL-1β, IL- 18, IL-33, IL-36α, IL-36β, IL-36γ), 3 chất đối kháng thụ thể (IL-1Ra, IL-36Ra, IL- 38), và 1 cytokin chống viêm (IL-37) [1, 15].

Các cytokin họ IL-1 chủ yếu được tiết ra bởi các tế bào đơn nhân hoặc đại thực bào được kích thích. Tuy nhiên, các loại tế bào liên quan đến miễn dịch và không liên quan đến miễn dịch khác (bao gồm bạch cầu trung tính, tế bào lympho, tế bào sừng, tế bào chondrocytes, nguyên bào sợi và tế bào nội mô, biểu mô và cơ trơn) cũng sản xuất các IL này [13]. Họ IL-1 có liên quan đến khả năng miễn dịch tự nhiên hơn các họ IL khác, được biểu hiện bằng tình trạng viêm, hoạt động như một cơ chế bảo vệ vật chủ nhưng khi không được kiểm soát sẽ gây ra các phản ứng bất lợi. Bên cạnh đó, các cytokin này còn tham gia vào hệ thống miễn dịch thu nhận thông qua việc tăng sức đề kháng không đặc hiệu trong nhiễm trùng và tăng đáp ứng miễn dịch với các kháng nguyên lạ [1].

Rối loạn điều hòa tín hiệu các cytokin giống IL-1 có liên quan đến nhiều rối loạn viêm và tự miễn. Do đó, ức chế hoạt động của các IL này được coi là một liệu pháp can thiệp điều trị đầy hứa hẹn [13]. 2 Khoá luận tốt nghiệp DSĐH Tổng quan tài liệu Theo Bảng 1.1, họ thụ thể của IL-1 (IL-1R) là tập hợp những thụ thể của họ IL-1, gồm 10 thành viên: IL-1R1 (IL-1RI), IL-1R2 (IL-1RII), IL-1R3 (IL-1RAcP), IL-1R4 (ST2), IL-1R5 (IL-18Rα), IL-1R6 (IL-1Rrp2, IL-36R), IL-1R7 (IL-18Rβ), IL-1R8 (TIR8, SIGIRR), IL-1R9 (TIGIRR-2, IL-1RAPL1) và IL-1R10 (TIGIRR-1). Trong đó có các thụ thể kháng viêm là IL-1R8, IL1R9 và IL-1R10 [1].

Các thành viên của họ IL-1 và IL-1R [1] Họ IL-1 Thụ thể Đồng thụ thể IL-1α, IL-1β IL-1R1 IL-1R3 IL-1β IL-1R2 IL-1R3 IL-1Ra IL-1R1 IL-18 IL-1R5 IL-1R7 IL-33 IL-1R4 IL-1R3 IL-36α, β, γ IL-1R6 IL-1R3 IL-36Ra IL-1R6 IL-1R3 IL-37 IL-1R5 IL-1R8 IL-38 IL-1R6 IL-1R9 1. Năm 2003, IL-33 lần đầu tiên được tìm thấy trong các mô của cơ thể người và được đặt tên là NF-HEV (nuclear factor - high endothelial venule), nghĩa là yếu tố nhân của tế bào thành mạch nội mô [17].