Sàng lọc in silico các hợp chất tự nhiên tiềm năng được phân lập tại bộ môn dược liệu đại học y dược tp hồ chí minh ức chế trên protein e1 của hpv 18 human papilloma virus

• Tác giả: Đào Thị Hồng Loan
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thụy Việt Phương
• Trường học: Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Dược Phẩm Và Bào Chế Thuốc
• Đề tài: Sàng Lọc In Silico Các Hợp Chất Tự Nhiên Tiềm Năng Được Phân Lập Tại Bộ Môn Dược Liệu – Đại Học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh Ức Chế Trên Protein E1 Của Hpv 18 (Human Papilloma Virus)
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ Dược Học
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
• 1.1. Phân loại HPV
• 1.2. Cấu tạo của HPV
• 1.3. Protein E1 của virus HPV
• 1.4. Tiềm năng phát triển thuốc ức chế virus HPV từ dược liệu
• 1.5. Nghiên cứu thuốc ức chế trên virus HPV
• 1.6. Nghiên cứu thuốc ức chế trên E1 HPV 18
• 1.7. Sàng lọc in silico
• 1.8. Căn chỉnh nhiều trình tự và phân tích phát sinh loài
• 1.9. Gắn kết phân tử
• 1.10. Mô phỏng động lực học phân tử
• 1.11. Năng lượng gắn kết tự do
• 1.12. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 1.12.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 1.12.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 2. CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Mục tiêu tác động
• 2.3. Cơ sở dữ liệu
• 2.4. Phần mềm nghiên cứu
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6. Quy trình nghiên cứu
• 2.7. Căn chỉnh nhiều trình tự và phân tích phát sinh loài
• 2.8. Gắn kết phân tử
• 2.9. Mô phỏng động lực học phân tử
• 2.10. Tính toán năng lượng gắn kết
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ
• 3.1. Căn chỉnh nhiều trình tự và phân tích phát sinh loài
• 3.2. Đánh giá trình tự acid amin bằng phương pháp MSA
• 3.3. Phân tích phát sinh loài
• 3.4. Sàng lọc các hợp chất tự nhiên có tiềm năng ức chế protein E1 bằng phương pháp gắn kết phân tử
• 3.5. Các cấu trúc flavonoid monoglycosid
• 3.6. Các cấu trúc flavonoid diglycosid
• 3.7. Các cấu trúc flavonoid triglycosid
• 3.8. Các cấu trúc flavonoid chỉ có phần aglycon
• 3.9. Các hợp chất khác
• 3.10. Các thuốc được sử dụng trong điều trị HPV
• 3.11. Phân tích khả năng làm thuốc và ADMET của 5 hợp chất tiềm năng
• 3.12. Khảo sát độ ổn định của các phức hợp tiềm năng thông qua mô phỏng động lực học phân tử
• 3.12.1. Độ ổn định của phức hợp protein-ligand trong quá trình mô phỏng động lực học phân tử
• 3.12.2. Độ dao động của acid amin trong quá trình mô phỏng động lực học
• 3.12.3. Diện tích bề mặt có thể tiếp cận dung môi
• 3.12.4. Tần suất liên kết hydro giữa protein và ligand
• 3.13. Tính toán và đánh giá năng lượng gắn kết bằng 3 phương pháp: MM/PBSA và MM/GBSA, LIE
• 3.13.1. Phương pháp MM/PBSA
• 3.13.2. Phương pháp MM/GBSA
• 3.13.3. Phương pháp LIE
• 4. CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN
• 4.1. Căn chỉnh nhiều trình tự và phân tích phát sinh loài
• 4.2. Sàng lọc các hợp chất tự nhiên có tiềm năng ức chế protein E1 bằng phương pháp gắn kết phân tử
• 4.3. Khảo sát độ ổn định của các phức hợp tiềm năng thông qua mô phỏng động lực học phân tử
• 4.4. Tính toán và đánh giá năng lượng gắn kết tự do bằng 3 phương pháp: MM/PBSA và MM/GBSA, LIE
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

I. Tổng Quan Về Sàng Lọc In Silico Hợp Chất Ức Chế HPV18 55 ký tự

Ung thư cổ tử cung là một vấn đề sức khỏe toàn cầu, đặc biệt ở các quốc gia có thu nhập thấp và trung bình. Human Papillomavirus (HPV), đặc biệt là các tuýp 16 và 18, là nguyên nhân chính gây ra căn bệnh này. Mặc dù đã có vắc xin, nhưng tỷ lệ tiêm chủng còn thấp và hiệu quả giảm ở những người đã nhiễm HPV. Do đó, việc tìm kiếm các phương pháp điều trị mới là vô cùng cần thiết. Nghiên cứu này tập trung vào việc sử dụng phương pháp sàng lọc in silico để xác định các hợp chất tự nhiên tiềm năng có khả năng ức chế protein E1 của HPV 18. Protein E1 đóng vai trò quan trọng trong quá trình sao chép của virus, khiến nó trở thành một mục tiêu hấp dẫn cho việc phát triển thuốc. Nghiên cứu này tận dụng nguồn dược liệu phong phú và kinh nghiệm của Bộ môn Dược liệu - Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh để khám phá các giải pháp tiềm năng.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Protein E1 Trong Chu Trình HPV

Protein E1 là một yếu tố then chốt trong vòng đời của HPV. Nó không chỉ nhận diện vị trí sao chép trên trình tự ori, mà còn tham gia vào quá trình biến tính ADN. Với khoảng 50 bản sao chép trên một tế bào, protein E1 đóng vai trò quan trọng trong cả giai đoạn khởi đầu và duy trì bộ gen của virus. Hơn nữa, protein E1 có khả năng ảnh hưởng đến các gen liên quan đến chu trình tế bào và giảm hoạt động của các gen phản ứng miễn dịch, như IFNβ1 và IFNλ1. Do đó, việc ức chế protein E1 có thể mang lại hiệu quả đáng kể trong việc kiểm soát sự lây lan và phát triển của HPV.

1.2. Thực Trạng Nghiên Cứu Thuốc Điều Trị HPV Hiện Nay

Hiện nay, các nghiên cứu về điều trị HPV tập trung vào nhiều hướng tiếp cận khác nhau, bao gồm cả việc tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có khả năng ức chế các oncoprotein E6 và E7. Curcumin, được biết đến với khả năng làm giảm sự biểu hiện của protein E6 và E7 của HPV 16 và HPV 18, đã cho thấy tiềm năng trong việc biến đổi kiểu hình và ngăn chặn sự tăng trưởng của các tế bào ung thư. Withaferin A cũng được chứng minh là có khả năng ức chế hiệu quả E6 và E7 của HPV 16 và HPV 18. Ngoài ra, các hợp chất như stigmasterol và stereoemodin đã được báo cáo về khả năng ức chế protein E1. Tuy nhiên, vẫn còn thiếu các nghiên cứu chuyên sâu về việc tìm kiếm các hợp chất tự nhiên tác động trực tiếp lên protein E1, đặc biệt là ở Việt Nam.

II. Thách Thức Tìm Kiếm Giải Pháp Điều Trị HPV Hiệu Quả 58 ký tự

Mặc dù vắc xin HPV đã có mặt trên thị trường, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc ngăn ngừa ung thư cổ tử cung. Tỷ lệ tiêm chủng còn thấp, và vắc xin không bảo vệ chống lại tất cả các chủng HPV. Hơn nữa, hiệu quả của vắc xin giảm ở những người đã tiếp xúc với virus. Các phương pháp điều trị hiện tại có thể gây ra tác dụng phụ và không phải lúc nào cũng hiệu quả. Vì vậy, nhu cầu tìm kiếm các phương pháp điều trị mới, an toàn và hiệu quả hơn là rất lớn. Nghiên cứu này tập trung vào việc khám phá các hợp chất tự nhiên có khả năng ức chế protein E1, một mục tiêu đầy hứa hẹn trong việc phát triển thuốc kháng HPV. Việc sử dụng phương pháp sàng lọc in silico giúp tiết kiệm thời gian và chi phí so với các phương pháp truyền thống.

2.1. Giới Hạn Của Vắc Xin HPV Trong Ngăn Ngừa Ung Thư Cổ Tử Cung

Mặc dù vắc xin HPV đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc ngăn ngừa nhiễm trùng HPV và giảm nguy cơ ung thư cổ tử cung, vẫn còn một số hạn chế cần được xem xét. Các loại vắc xin hiện có trên thị trường chỉ bảo vệ chống lại một số chủng HPV phổ biến nhất, trong khi có hơn 100 chủng khác nhau. Hơn nữa, vắc xin có hiệu quả nhất khi được tiêm trước khi một người bắt đầu hoạt động tình dục và tiếp xúc với HPV. Điều này đặt ra thách thức trong việc đảm bảo rằng vắc xin được tiêm cho đúng đối tượng và vào đúng thời điểm. Cuối cùng, vắc xin không có tác dụng điều trị nhiễm trùng HPV hiện có hoặc các bệnh liên quan đến HPV khác.

2.2. Nhu Cầu Nghiên Cứu Các Phương Pháp Điều Trị HPV Mới

Do những hạn chế của vắc xin HPV, việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp điều trị HPV mới là rất cần thiết. Các phương pháp điều trị hiện tại, chẳng hạn như phẫu thuật, xạ trị và hóa trị, có thể có tác dụng phụ đáng kể và không phải lúc nào cũng hiệu quả. Ngoài ra, các phương pháp điều trị này thường chỉ tập trung vào việc loại bỏ các tế bào ung thư đã phát triển, chứ không phải là loại bỏ virus HPV hoặc ngăn chặn sự lây lan của nó. Việc phát triển các phương pháp điều trị mới, chẳng hạn như các loại thuốc kháng virus nhắm mục tiêu cụ thể vào HPV, có thể mang lại một giải pháp hiệu quả hơn và ít xâm lấn hơn cho những người bị nhiễm HPV.

III. Phương Pháp Sàng Lọc In Silico Tìm Kiếm Hợp Chất 59 ký tự

Sàng lọc in silico là một phương pháp hiệu quả để tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có khả năng tương tác với một mục tiêu sinh học cụ thể. Trong nghiên cứu này, phương pháp docking phân tử được sử dụng để đánh giá khả năng liên kết của các hợp chất tự nhiên từ Bộ môn Dược liệu với protein E1 của HPV 18. Các hợp chất có điểm số docking tốt sẽ được đánh giá thêm bằng mô phỏng động lực học phân tử để kiểm tra độ ổn định của phức hợp protein-ligand. Cuối cùng, năng lượng gắn kết tự do được tính toán để xác định các hợp chất có khả năng ức chế protein E1 mạnh nhất. Phương pháp này giúp thu hẹp phạm vi các hợp chất tiềm năng, tiết kiệm thời gian và chi phí cho các thử nghiệm in vitro và in vivo.

3.1. Quy Trình Docking Phân Tử Để Xác Định Tương Tác E1 Ligand

Docking phân tử là một kỹ thuật mô phỏng máy tính được sử dụng để dự đoán cách một phân tử nhỏ, chẳng hạn như một hợp chất tự nhiên, liên kết với một phân tử lớn hơn, chẳng hạn như một protein. Trong nghiên cứu này, docking phân tử được sử dụng để xác định cách các hợp chất tự nhiên từ Bộ môn Dược liệu tương tác với protein E1 của HPV 18. Quá trình này bao gồm việc sử dụng các thuật toán máy tính để tìm kiếm vị trí và hướng tối ưu của hợp chất trong vị trí liên kết của protein, đồng thời tính toán năng lượng liên kết giữa hai phân tử. Kết quả docking phân tử có thể giúp xác định các hợp chất có khả năng liên kết mạnh với protein E1 và do đó có khả năng ức chế hoạt động của protein.

3.2. Mô Phỏng Động Lực Học Phân Tử Đánh Giá Độ Ổn Định Phức Hợp

Mô phỏng động lực học phân tử (MD) là một phương pháp tính toán được sử dụng để mô phỏng chuyển động của các nguyên tử và phân tử theo thời gian. Trong nghiên cứu này, MD được sử dụng để đánh giá độ ổn định của các phức hợp giữa protein E1 của HPV 18 và các hợp chất tự nhiên tiềm năng được xác định thông qua docking phân tử. MD mô phỏng chuyển động của các nguyên tử trong phức hợp theo thời gian, cho phép các nhà nghiên cứu quan sát cách phức hợp thay đổi cấu trúc và năng lượng của nó. Nếu phức hợp vẫn ổn định trong suốt quá trình mô phỏng, điều này cho thấy rằng hợp chất có khả năng liên kết mạnh với protein E1 và do đó có khả năng ức chế hoạt động của protein.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Hợp Chất Tiềm Năng Ức Chế HPV18 55 ký tự

Nghiên cứu đã xác định được hai hợp chất tự nhiên tiềm năng, E186 (Hispidulin-7-O-rutinosid) và E221 (Limonin), có khả năng ức chế protein E1 của HPV18. Kết quả sàng lọc in silico cho thấy hai hợp chất này có ái lực liên kết cao với protein E1 và tạo thành các phức hợp ổn định. Đánh giá trình tự acid amin cho thấy có sự bảo tồn cao giữa các acid amin trong khoang gắn kết ADN của HPV 18 so với các tuýp HPV khác. Kết quả này gợi ý rằng có thể phát triển các hợp chất ức chế protein E1 có tác dụng trên nhiều tuýp HPV khác nhau, đặc biệt là các tuýp HPV nguy cơ cao.

4.1. E186 Hispidulin 7 O rutinosid Đặc Tính Và Khả Năng Ức Chế

E186, còn được gọi là Hispidulin-7-O-rutinosid, là một flavonoid diglycosid. Phân tích tương tác giữa E186 và protein E1 của HPV 18 cho thấy E186 có khả năng liên kết với protein thông qua nhiều liên kết hydro và liên kết kỵ nước. Điều này cho thấy E186 có khả năng liên kết mạnh với protein E1 và có thể ức chế hoạt động của protein. Kết quả tính toán năng lượng gắn kết tự do cho thấy E186 có năng lượng gắn kết âm, cho thấy rằng liên kết giữa E186 và protein E1 là thuận lợi về mặt năng lượng.

4.2. E221 Limonin Đặc Tính Và Khả Năng Ức Chế Protein E1

E221, hay Limonin, là một triterpenoid. Tương tự như E186, E221 cũng cho thấy khả năng liên kết tốt với protein E1 của HPV 18. Phân tích tương tác cho thấy E221 có thể tạo thành nhiều liên kết kỵ nước với protein, góp phần vào sự ổn định của phức hợp. Kết quả tính toán năng lượng gắn kết tự do cũng cho thấy E221 có năng lượng gắn kết âm, chứng minh rằng liên kết giữa E221 và protein E1 là thuận lợi về mặt năng lượng. Đặc biệt, năng lượng gắn kết tự do của E221 còn cao hơn so với E186, cho thấy khả năng ức chế protein E1 tiềm năng hơn.

V. Ứng Dụng Và Hướng Phát Triển Thuốc Điều Trị HPV 52 ký tự

Kết quả nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc điều trị HPV từ dược liệu. Các hợp chất tự nhiên E186 và E221 có thể được sử dụng làm tiền chất để tổng hợp các dẫn xuất có hoạt tính ức chế protein E1 mạnh hơn. Nghiên cứu cũng cho thấy tiềm năng phát triển các hợp chất ức chế protein E1 có tác dụng trên nhiều tuýp HPV khác nhau, đặc biệt là các tuýp HPV nguy cơ cao. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc đánh giá hoạt tính sinh học in vitro và in vivo của các hợp chất này, cũng như nghiên cứu độc tính và dược động học của chúng.

5.1. Tổng Hợp Các Dẫn Xuất Của E186 Và E221

Các hợp chất tự nhiên E186 và E221 có cấu trúc hóa học phức tạp, nhưng chúng có thể được sử dụng làm tiền chất để tổng hợp các dẫn xuất có cấu trúc đơn giản hơn và hoạt tính sinh học cao hơn. Quá trình tổng hợp có thể tập trung vào việc thay đổi các nhóm chức năng trên phân tử để tăng cường khả năng liên kết với protein E1 hoặc cải thiện tính tan trong nước và khả năng hấp thụ của hợp chất. Các dẫn xuất mới có thể được sàng lọc in silico và sau đó được đánh giá in vitro và in vivo để xác định các hợp chất có tiềm năng điều trị HPV tốt nhất.

5.2. Nghiên Cứu In Vitro Và In Vivo Để Xác Nhận Hoạt Tính

Mặc dù kết quả sàng lọc in silico cho thấy E186 và E221 có tiềm năng ức chế protein E1 của HPV 18, điều quan trọng là phải xác nhận hoạt tính sinh học của chúng bằng các thí nghiệm in vitro và in vivo. Các thí nghiệm in vitro có thể được sử dụng để đánh giá khả năng của các hợp chất trong việc ức chế sự sao chép của HPV trong các tế bào nuôi cấy. Các thí nghiệm in vivo có thể được sử dụng để đánh giá hiệu quả của các hợp chất trong việc điều trị nhiễm trùng HPV ở động vật. Kết quả của các nghiên cứu này sẽ cung cấp bằng chứng thuyết phục hơn về tiềm năng của E186 và E221 như là các thuốc điều trị HPV.

VI. Kết Luận Tiềm Năng Dược Liệu Việt Nam Với HPV 50 ký tự

Nghiên cứu này đã chứng minh tiềm năng của dược liệu Việt Nam trong việc tìm kiếm các phương pháp điều trị HPV mới. Việc sử dụng phương pháp sàng lọc in silico đã giúp xác định được hai hợp chất tự nhiên tiềm năng có khả năng ức chế protein E1 của HPV 18. Kết quả này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc điều trị HPV từ dược liệu. Nghiên cứu cũng nhấn mạnh tầm quan trọng của việc kết hợp các phương pháp nghiên cứu hiện đại với nguồn tài nguyên dược liệu phong phú của Việt Nam để giải quyết các vấn đề sức khỏe cộng đồng.

6.1. Tầm Quan Trọng Của Dược Liệu Trong Nghiên Cứu Dược Phẩm

Dược liệu từ lâu đã được sử dụng trong y học truyền thống để điều trị nhiều loại bệnh tật. Ngày nay, dược liệu vẫn là một nguồn tài nguyên quan trọng cho việc khám phá và phát triển các loại thuốc mới. Nhiều loại thuốc hiện đại có nguồn gốc từ các hợp chất tự nhiên được tìm thấy trong dược liệu. Dược liệu có nhiều ưu điểm so với các hợp chất tổng hợp, bao gồm tính đa dạng về cấu trúc hóa học, khả năng tương tác với nhiều mục tiêu sinh học và ít tác dụng phụ hơn.

6.2. Hợp Tác Nghiên Cứu Giữa Các Trường Đại Học Và Viện Nghiên Cứu

Để tận dụng tối đa tiềm năng của dược liệu Việt Nam trong việc phát triển thuốc điều trị HPV, cần có sự hợp tác chặt chẽ giữa các trường đại học, viện nghiên cứu và các công ty dược phẩm. Các trường đại học và viện nghiên cứu có thể cung cấp kiến thức chuyên môn về dược liệu, sàng lọc in silico và các phương pháp nghiên cứu sinh học. Các công ty dược phẩm có thể cung cấp nguồn lực tài chính và kinh nghiệm trong việc phát triển và thương mại hóa thuốc mới. Sự hợp tác này sẽ giúp đẩy nhanh quá trình khám phá và phát triển các thuốc điều trị HPV hiệu quả và an toàn từ dược liệu.

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư cổ tử cung là một trong những bệnh ung thư phổ biến hàng đầu ở phụ nữ trên toàn cầu, với hơn 95% ca mắc bệnh liên quan đến Human Papillomavirus (HPV). Trong đó, HPV tuýp 16 và 18 chiếm khoảng 90% tổng số ca mắc bệnh. Tại Việt Nam, ung thư cổ tử cung đứng thứ 6 về tỷ lệ mắc mới với khoảng 4.177 trường hợp và 2.420 ca tử vong vào năm 2018, tương đương tỷ lệ mắc khoảng 7,1 trên 100.000 phụ nữ. Mặc dù đã có vắc xin phòng ngừa HPV, tỷ lệ tiêm chủng còn thấp, chỉ khoảng 12% trong giai đoạn 2020-2028, đồng thời vắc xin không hiệu quả với những người đã tiếp xúc với nhiều chủng HPV trước đó. Do đó, việc phát triển thuốc điều trị HPV, đặc biệt nhắm vào các protein quan trọng của virus, là nhu cầu cấp thiết.

Protein E1 của HPV 18 đóng vai trò thiết yếu trong quá trình sao chép ADN của virus, là enzym helicase/ATPase duy nhất trong bộ gen HPV, với chức năng nhận diện vị trí sao chép ori và biến tính ADN. Protein này có tính bảo tồn cao giữa các tuýp HPV, làm cho nó trở thành mục tiêu hấp dẫn để phát triển thuốc ức chế nhằm ngăn chặn sự nhân lên của virus. Mục tiêu nghiên cứu là sàng lọc in silico các hợp chất tự nhiên được phân lập tại Bộ môn Dược liệu – Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh nhằm tìm ra các hợp chất tiềm năng ức chế protein E1 của HPV 18. Nghiên cứu tập trung vào 286 hợp chất tự nhiên, sử dụng các phương pháp gắn kết phân tử, mô phỏng động lực học phân tử và tính toán năng lượng gắn kết tự do để đánh giá hiệu quả ức chế.

Phạm vi nghiên cứu bao gồm các hợp chất được phân lập từ năm 2005 đến 2020 tại Bộ môn Dược liệu, với phân tích protein E1 HPV 18 dựa trên cấu trúc tinh thể (PDB ID: 1R9W). Ý nghĩa nghiên cứu góp phần mở rộng nguồn thuốc điều trị HPV, đặc biệt cho các trường hợp không đáp ứng vắc xin, đồng thời cung cấp cơ sở khoa học cho phát triển thuốc kháng virus dựa trên các hợp chất tự nhiên.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Protein E1 của HPV: Là enzym helicase/ATPase tham gia vào quá trình sao chép ADN virus, có vùng liên kết ADN (DBD) và vùng enzym hoạt động. Protein này có tính bảo tồn cao giữa các tuýp HPV, đặc biệt trong khoang gắn kết ADN, làm cho nó trở thành mục tiêu thuốc tiềm năng.

• Gắn kết phân tử (Molecular docking): Phương pháp mô phỏng tương tác giữa protein và ligand nhằm dự đoán cấu trúc phức hợp tối ưu và ái lực gắn kết. Sử dụng kiểu gắn bán linh động, giữ protein cố định và cho phép ligand linh động, giúp tiết kiệm thời gian tính toán và phù hợp với các phân tử nhỏ.

• Mô phỏng động lực học phân tử (Molecular dynamics simulation - MDs): Kỹ thuật mô phỏng chuyển động và độ ổn định của phức hợp protein-ligand trong môi trường dung môi, nhiệt độ và áp suất xác định. Các chỉ số đánh giá gồm RMSD, RMSF, bán kính quay (Rg), diện tích bề mặt tiếp xúc dung môi (SASA) và tần suất liên kết hydro.

• Tính năng lượng gắn kết tự do (Binding Free Energy - BFE): Đánh giá độ mạnh của liên kết protein-ligand bằng các phương pháp MM/PBSA, MM/GBSA (phương pháp điểm cuối tương đối) và LIE (phương pháp điểm cuối tuyệt đối). Các phương pháp này dựa trên dữ liệu mô phỏng động lực học để tính toán năng lượng gắn kết chính xác hơn so với docking đơn thuần.

• Căn chỉnh nhiều trình tự (Multiple Sequence Alignment - MSA) và phân tích phát sinh loài (Phylogenetic analysis): Dùng để so sánh trình tự acid amin trong khoang gắn kết ADN của protein E1 giữa các tuýp HPV, xác định mức độ bảo tồn và mối quan hệ tiến hóa giữa các tuýp HPV nguy cơ cao và thấp.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: 286 hợp chất tự nhiên được phân lập từ dược liệu tại Bộ môn Dược liệu – Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh (2005-2020). Cấu trúc protein E1 HPV 18 lấy từ Protein Data Bank (PDB ID: 1R9W) với độ phân giải 1,80 Å.

• Chuẩn bị dữ liệu: Cấu trúc protein được bổ sung 7 acid amin còn thiếu bằng mô hình tương đồng. Hợp chất ligand được chuyển đổi từ cấu trúc 2D sang 3D và chuẩn bị định dạng phù hợp cho docking.

• Phương pháp phân tích:

  • Gắn kết phân tử sử dụng AutoDock Vina để sàng lọc các hợp chất có ái lực gắn kết tốt với protein E1.
  • Mô phỏng động lực học phân tử thực hiện trong 100 ns với phần mềm GROMACS, đánh giá độ ổn định phức hợp qua các chỉ số RMSD, RMSF, Rg, SASA và liên kết hydro.
  • Tính toán năng lượng gắn kết tự do bằng ba phương pháp MM/PBSA, MM/GBSA và LIE dựa trên dữ liệu mô phỏng động lực học.
  • Căn chỉnh nhiều trình tự và phân tích phát sinh loài protein E1 của 28 tuýp HPV bằng phần mềm Clustal Omega để đánh giá sự bảo tồn acid amin trong khoang gắn kết ADN.

• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trong năm 2023, bao gồm các giai đoạn chuẩn bị dữ liệu, sàng lọc docking, mô phỏng động lực học, tính toán năng lượng và phân tích trình tự.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Sàng lọc gắn kết phân tử: Từ 286 hợp chất tự nhiên, 5 hợp chất tiềm năng được lựa chọn gồm E157, E176, E186, E221 và E254 với điểm docking thấp hơn -7,0 kcal/mol, cho thấy ái lực gắn kết mạnh với protein E1 HPV 18.

2. Mô phỏng động lực học phân tử: Qua 100 ns mô phỏng, phức hợp protein E1 với E176 và E221 đạt độ ổn định cao với RMSD trung bình dưới 2,0 Å, tần suất liên kết hydro ổn định trên 70%, diện tích bề mặt tiếp xúc dung môi (SASA) và bán kính quay (Rg) duy trì ổn định, chứng tỏ sự bền vững của phức hợp.

3. Tính năng lượng gắn kết tự do: Phương pháp MM/PBSA và MM/GBSA cho thấy E186 và E221 có năng lượng gắn kết tự do lần lượt là -15,21 kJ/mol và -60,73 kJ/mol, trong khi phương pháp LIE cũng xác nhận giá trị tương tự, khẳng định tiềm năng ức chế protein E1 của hai hợp chất này.

4. Phân tích trình tự acid amin và phát sinh loài: Kết quả căn chỉnh nhiều trình tự cho thấy sự bảo tồn cao của các acid amin trong khoang gắn kết ADN của protein E1 giữa HPV 18 và các tuýp HPV khác, đặc biệt là các tuýp nguy cơ cao. Phân tích phát sinh loài phân biệt rõ ràng nhóm HPV nguy cơ cao và nguy cơ thấp, gợi ý khả năng phát triển thuốc ức chế đa tuýp HPV dựa trên protein E1.

Thảo luận kết quả

Kết quả sàng lọc và mô phỏng cho thấy hợp chất E186 (Hispidulin-7-O-rutinosid) và E221 (Limonin) là những ứng viên tiềm năng có khả năng ức chế protein E1 của HPV 18 hiệu quả. Độ ổn định phức hợp trong mô phỏng động lực học và năng lượng gắn kết thấp chứng tỏ sự tương tác mạnh mẽ và bền vững giữa ligand và protein. So sánh với các nghiên cứu quốc tế, các hợp chất này có điểm tương đồng về cấu trúc với các flavonoid và limonoid đã được báo cáo có hoạt tính kháng HPV.

Phân tích trình tự acid amin và phát sinh loài hỗ trợ giả thuyết rằng thuốc ức chế protein E1 có thể có tác dụng trên nhiều tuýp HPV nguy cơ cao, mở rộng phạm vi ứng dụng điều trị. Việc bảo tồn cao trong khoang gắn kết ADN giúp đảm bảo tính hiệu quả và giảm khả năng kháng thuốc do đột biến.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ RMSD, RMSF, SASA và Rg minh họa độ ổn định phức hợp, cùng bảng so sánh năng lượng gắn kết của các hợp chất tiềm năng, giúp trực quan hóa hiệu quả ức chế.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển thử nghiệm in vitro và in vivo: Tiến hành đánh giá hoạt tính ức chế protein E1 của hợp chất E186 và E221 trên các dòng tế bào nhiễm HPV 18 trong vòng 12-18 tháng, nhằm xác nhận hiệu quả và độc tính.

2. Mở rộng nghiên cứu đa tuýp HPV: Dựa trên kết quả phân tích trình tự, nghiên cứu khả năng ức chế của các hợp chất trên các tuýp HPV nguy cơ cao khác trong vòng 24 tháng, nhằm phát triển thuốc đa phổ.

3. Tối ưu hóa cấu trúc hợp chất: Sử dụng kỹ thuật hóa học tính toán để cải thiện tính dược động học và tăng cường ái lực gắn kết, giảm tác dụng phụ, thực hiện trong 12 tháng tiếp theo.

4. Xây dựng quy trình sản xuất và thử nghiệm lâm sàng sơ bộ: Sau khi có kết quả tiền lâm sàng khả quan, phối hợp với các đơn vị sản xuất dược liệu để phát triển quy trình chiết xuất, bào chế và thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I trong vòng 3 năm.

Các chủ thể thực hiện bao gồm Bộ môn Dược liệu, các phòng thí nghiệm nghiên cứu dược học, các bệnh viện chuyên khoa ung bướu và các công ty dược phẩm trong nước.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu dược học và công nghệ sinh học: Nghiên cứu về phát triển thuốc kháng virus, đặc biệt các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học, có thể ứng dụng phương pháp in silico và mô phỏng động lực học phân tử.

2. Bác sĩ chuyên khoa ung bướu và y học cổ truyền: Tìm hiểu các phương pháp điều trị mới cho ung thư cổ tử cung, đặc biệt các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu, hỗ trợ tư vấn và điều trị bệnh nhân.

3. Sinh viên và học viên cao học ngành Dược, Công nghệ dược phẩm: Tham khảo quy trình nghiên cứu khoa học, phương pháp sàng lọc hợp chất và phân tích dữ liệu trong lĩnh vực dược liệu và thuốc kháng virus.

4. Các nhà quản lý và hoạch định chính sách y tế: Đánh giá tiềm năng phát triển thuốc điều trị HPV trong nước, từ đó xây dựng chiến lược phát triển dược liệu và nâng cao hiệu quả phòng chống ung thư cổ tử cung.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao protein E1 của HPV 18 được chọn làm mục tiêu nghiên cứu?
   Protein E1 là enzym helicase/ATPase duy nhất tham gia sao chép ADN của virus, có tính bảo tồn cao giữa các tuýp HPV, đặc biệt trong khoang gắn kết ADN. Việc ức chế E1 có thể ngăn chặn sự nhân lên của virus, làm giảm nguy cơ tiến triển ung thư cổ tử cung.

2. Phương pháp in silico có ưu điểm gì trong nghiên cứu này?
   In silico giúp tiết kiệm thời gian và chi phí so với thử nghiệm thực nghiệm, cho phép sàng lọc nhanh hàng trăm hợp chất, dự đoán ái lực gắn kết và độ ổn định phức hợp protein-ligand một cách chính xác, định hướng cho nghiên cứu tiếp theo.

3. Các hợp chất E186 và E221 có nguồn gốc từ đâu?
   Hai hợp chất này là các hợp chất tự nhiên được phân lập từ dược liệu tại Bộ môn Dược liệu – Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh, thuộc nhóm flavonoid và limonoid, có cấu trúc hóa học phù hợp với mục tiêu ức chế protein E1.

4. Kết quả mô phỏng động lực học phân tử thể hiện điều gì?
   Mô phỏng cho thấy phức hợp protein-ligand với E176 và E221 có độ ổn định cao trong 100 ns, với các chỉ số RMSD, RMSF, SASA và Rg duy trì ổn định, chứng tỏ sự tương tác bền vững và khả năng ức chế hiệu quả.

5. Nghiên cứu này có thể ứng dụng trong phát triển thuốc điều trị HPV như thế nào?
   Kết quả cung cấp cơ sở khoa học để phát triển thuốc ức chế protein E1, có thể áp dụng cho nhiều tuýp HPV nguy cơ cao, đặc biệt cho những trường hợp không đáp ứng vắc xin, góp phần đa dạng hóa phương pháp điều trị ung thư cổ tử cung.

Kết luận

• Ung thư cổ tử cung do HPV 16 và 18 chiếm khoảng 90% các ca mắc, trong khi tỷ lệ tiêm vắc xin còn thấp tại Việt Nam.
• Protein E1 của HPV 18 là mục tiêu tiềm năng để phát triển thuốc ức chế sự nhân lên của virus.
• Nghiên cứu sàng lọc in silico 286 hợp chất tự nhiên đã xác định 5 hợp chất tiềm năng, trong đó E186 và E221 có năng lượng gắn kết tự do thấp và độ ổn định phức hợp cao qua mô phỏng động lực học.
• Phân tích trình tự acid amin và phát sinh loài cho thấy khả năng phát triển thuốc đa tuýp HPV dựa trên protein E1.
• Đề xuất tiếp tục nghiên cứu tiền lâm sàng, tối ưu hóa hợp chất và thử nghiệm lâm sàng để phát triển thuốc điều trị HPV hiệu quả.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các nhóm nghiên cứu phối hợp triển khai thử nghiệm in vitro và in vivo, đồng thời mở rộng nghiên cứu đa tuýp HPV để phát triển thuốc kháng virus có hiệu quả cao và an toàn.