Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 3 PHẦN II: NỘI DUNG CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung về hà thủ ô đỏ 1. Nguồn gốc và hình thái Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora, đồng nghĩa: Polygonum multiflorum Thunb) - Ngành (Division) : Magnoliophyta - Lớp (Class) : Eudicots - Bộ (Ordo) : Caryophyllales - Họ (Familia) : Polygonaceae - Chi (Genus) : Fallopia - Loài (Species): Fallopia multiflora Tên gọi khác: Giao đằng, dạ hợp.1: Cây Hà thủ ô đỏ Hà thủ ô đỏ là loài dây leo, sống nhiều năm. Thân rễ phồng thành củ, thân quấn, mọc xoắn vào nhau, mặt ngoài thân có màu xanh tía, nhẵn, có vân.
Lá mọc so le, có cuống dài. Phiến lá hình tim, dài 4 – 8 cm, rộng 2,5 – 5 cm, đầu nhọn, mép nguyên hoặc hơi lượn sóng, cả hạị mặt đều nhẵn. Bẹ chìa mỏng, màu nâu nhạt, ôm lấy thân. Hoa tự chùm nhiều nhánh.
Hoa nhỏ, đường kính 2 mm, mọc cách xa nhau ở kẽ những lá bắc ngắn, mỏng. Bao hoa màu trắng, 8 nhụy (trong số đó có 3 nhụy hơi dài hơn). Bầu hoa có 3 cạnh, 3 vòi ngắn rời nhau. Đầu nhụy hình mào gà rủ xuống.
Quả 3 góc, nhẵn bóng, đựng trong bao hoa còn lại, 3 bộ phận ngoài của bao hoa phát triển thành cánh rộng, mỏng, nguyên [8]. Trên thế giới, hà thủ ô đỏ phân bố nhiều ở Trung Quốc, Ấn Độ, Đài Loan, bắc Lào. Ở Việt Nam, chúng phân bố chủ yếu ở vùng có điều kiện khí hậu ẩm mát như: Hà Giang, Lai Châu, Lào Cai, Sơn La, Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An…[3]. Tác dụng dƣợc lý Hà thủ ô đỏ có tác dụng hạ Cholesterol huyết thanh, được chứng minh rõ trên mô hình gây cholesterol cao ở thỏ nhà, thuốc còn có tác dụng làm giảm hấp thu cholesterol của ruột thỏ, theo tác giả, thuốc có thành phần hữu hiệu kết hợp với cholesterol.
Thuốc 4 có tác dụng phòng chống và giảm nhẹ xơ cứng động mạch. Có thể tác dụng giảm xơ cứng động mạch và do thuốc có thành phần Lecithin [3]. Thuốc làm chậm nhịp tim. Làm tăng nhẹ lưu lượng máu động mạch vành và bảo vệ được cơ tim thiếu máu.
Thuốc giữ được tuyến ức của chuột nhắt già không bị teo mà giữ được mức như lúc chuột còn non, tác dụng này có ý nghĩa chống lão hóa nhưng cơ chế còn cần nghiên cứu thêm. Thuốc có tác dụng nhuận tràng do dẫn chất oxymethylanthraquinone làm tăng nhu động ruột. Hà thủ ô sống có tác dụng nhuận tràng mạnh hơn hà thủ ô chín. Tác dụng kháng khuẩn và virus: thuốc có tác dụng ức chế đối với trực khuẩn lao ở người và trực khuẩn lỵ Flexner.
Thuốc có tác dụng ức chế virus cúm. Ngoài ra, sử dụng hà thủ ô đỏ lâu năm còn có tác dụng làm đen râu tóc đối với người bạc tóc sớm, làm tóc đỡ khô và đỡ rụng [3]. Thành phần hoá học: Thân rễ hà thủ ô chứa antranoid, trong đó có emodin, chrysophanol, rhein, physcion; protid, tinh bột, lipid, lecitin, rhaponticin (rhapontin, ponticin). Tanin… Trong tự nhiên, hà thủ ô đỏ được trồng bằng cách giâm cành hoặc trồng bằng hạt.
Vấn đề gặp phải với phương pháp nhân giống truyền thống đối với cây hà thủ ô đỏ là khả năng nảy mầm hạt lâu, tỷ lệ sống thấp còn phương pháp giâm cành tạo ra cây con có tuổi thọ ngắn. Và Lin (2003) đã xác định các cây hà thủ ô đỏ có nguồn gốc in vitro sẽ cho tỉ lệ các chất emodin và physcion cao hơn so với cây ngoài tự nhiên.1: Tỷ lệ emodin và physcion [1] Hàm lượng Emodin Hàm lượng Physcion Sản phẩm Hà thủ ô đỏ (mg/g sấy khô) (mg/g sấy khô) Phần thân ngoài tự nhiên 0. 00 Phần rễ ngoài tự nhiên 0. 001 Phần chồi nhân giống in vitro 0.
044 Cây trong nhà kính sau in vitro 0. 064 5 Vì vậy, nhân giống in vitro là phương pháp rất hiệu quả và phù hợp với cây hà thủ ô đỏ. Nuôi cấy in vitro từ mẫu chồi 1. Khái niệm nuôi cấy in vitro tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy in vitro tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát sinh hình thái tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo vô trùng) một cách có định hướng dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật [2].
Các bước cơ bản: Tạo mẫu in vitro vô trùng. Tăng sinh mẫu in vitro và tạo cây hoàn chỉnh. Nuôi trồng thực nghiệm trong nhà kính với các điều kiện có kiểm soát và ngoài tự nhiên. Quy trình tạo mẫu chồi in vitro Quy trình tạo chồi in vitro quá trình khử trùng mẫu chồi bằng các thuốc khử trùng có sẵn: kháng sinh, thuốc diệt nấm, javel hoặc calcihypochloride, cồn.
Quá trình này được xây dựng từ quá trình khử trùng mẫu chuẩn với các thí nghiệm thay đổi thời gian quá trình khử trùng đối với từng chất khử trùng dựa vào tỷ lệ nhiễm. Chọn mẫu từ tự nhiên: Mẫu chồi được chọn cần phải khỏe mạnh, không có biểu hiện bệnh sẽ được cắt đem vào phòng thí nghiệm và rửa sơ bộ với xà phòng và nước sạch. Quy trình khử trùng: Toàn bộ chất khử trùng đều được pha với nước cất vô trùng, khi thay đổi dung dịch khử trùng thì phải thao tác trong tủ cấy. Đánh giá kết quả và xây dựng nghiệm thức khử trùng mẫu: Dựa vào kết quả tỷ lệ nhiễm và tỷ lệ sống sau 15 ngày của quá trình khử trùng lần đầu chúng ta sẽ xây dựng nghiệm thức khử trùng mẫu.
Nếu mẫu bị nhiễm nấm nhiều thì chúng ta sẽ tăng thời gian lắc thuốc kháng nấm thêm 15 phút, 30 phút và tương tự với nhiễm khuẩn. Ngoài ra, chúng ta có thể tăng thời gian lắc javel vì đây là một chất khử trùng có thể tiêu diệt cả hai tác nhân nhiễm trên [6]. Sự tái sinh chồi từ mẫu chồi Là quá trình tạo chồi bất định phát triển trực tiếp từ mẫu chồi ngoài tự nhiên đã được vô trùng. Môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy tế mô tế bào thực vật: Các môi trường khoáng cơ bản được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy tế bào thực vật là MS hoặc B5 [5].
Tăng sinh cụm chồi in vitro Chồi sau khi được tái sinh sẽ được cấy chuyền sang môi trường nhân nhanh được bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng phù hợp, mục đích tạo ra thêm nhiều chồi con để phục vụ cho quá trình ra rễ tạo cây hoàn chỉnh. Tạo rễ và cây con hoàn chỉnh và chuyển ra vƣờn ƣơm Từ cụm chồi tiến hành tách thành các chồi đơn và được cấy vào các môi trường tạo rễ (chứa Auxin riêng lẽ hoặc Auxin kết hợp Cytokinin). Sau khi hình hành rễ, môi trường sẽ được khảo sát với nồng độ Auxin và Cytokinin phù hợp nhất cho ra các cây hoàn chỉnh với hình thái khỏe nhất, lá to thân khỏe và khoảng cách 2 đốt ngắn. Chỉ có những cây này mới có tỷ lệ sống cao khi nuôi trồng ở trong nhà kính.
Những vấn đề trong nuôi cấy mô 1. Sự tạp nhiễm Nhiễm là vấn đề rất được quan tâm và dễ xảy ra trong nuôi cấy mô thực vật, gây ảnh huởng nghiêm trọng đến hiệu suất nuôi cấy. Một số nguồn gây tạp nhiễm như từ mẫu cấy, thao tác trong quá trình cấy, từ môi trường, dụng cụ và các máy móc thiết bị như màng lọc của tủ cấy, hệ thống thông khí trong phòng cấy [6]. Trong giai đoạn vô mẫu, mẫu cấy là nguồn gây nhiễm chính và đây cũng được xem là giai đoạn khó nhất trong vi nhân giống.
Mẫu cấy có thể là đốt thân, đỉnh sinh trưởng, mẫu lá hay rễ non. Tuy nhiên, để mẫu sống và phát triển trong điều kiện vô trùng thì không phải dễ. Môi trường bên ngoài luôn có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, các rãnh nhỏ, nách lá, lớp vẩy…. của cây mẹ, đây là nơi cư ngụ khá vững chắc mà chất khử trùng không dễ tiếp xúc được chúng.
Đặc biệt, vi khuẩn thường 7 nhiễm vào hệ thống mô mạch và gây nhiễm môi trường sau 1 tuần nuôi cấy. Nhiễm khuẩn trong trường hợp này thường gây những vệt trắng sữa xuất phát từ mô cấy và quan sát rõ nhất khi xem từ dưới đáy chai nuôi cấy. Vài loài vi khuẩn thường gây nhiễm: Acinebacter, Aerococcus, Agrobacterium, Bacillus, Clostridium, Curtobacterium, Erwinia, Pseudomonas…. Điều kiện trồng cây mẹ và vị trí lấy mẫu từ cây mẹ là yếu tố quan trọng thiết lập quá trình nuôi cấy sạch.
Cây trồng trong nhà kính ít nhiễm vi sinh vật hơn ngoài đồng ruộng. Các bộ phận như rễ, củ, thân bò thì thường khó làm sạch hơn các bộ phận khác. Môi trường không khí, phòng sáng, phòng cấy gây nhiễm nghiêm trọng nếu không được xử lý kịp thời, nấm thường là nguyên nhân gây nhiễm chính trong trường hợp này. Nấm thường tồn tại dạng bào tử lơ lửng trong không khí, khi phòng nuôi có nhiều người ra vào tạo điều kiện tích lũy vi sinh vật càng nhiều.
Nếu màng lọc tủ cấy không tốt sẽ gây nhiễm mẫu hàng loạt ngay trong quá trình cấy. Ngoài ra, bào tử nấm còn tấn công gây nhiễm những chai môi trường chưa sử dụng hoặc những bình đã được nuôi 2 - 3 tháng. Các loài nấm thường gặp: Aspergillus, Candida, Cladosporium, Microsprium và Phialophra [2]. Tính bất định về mặt di truyền Kỹ thuật nhân giống vô tính áp dụng với mục đích tạo quần thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp cũng tạo ra những biến dị tế bào qua nuôi cấy mô sẹo.
Những biến dị này cũng là cơ sở nghiên cứu ứng dụng vào cải thiện giống cây trồng nhưng thực tế có rất ít biến dị có lợi được báo cáo. Nuôi cấy mô sẹo cho biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh [2]. Đến nay việc gây ra biến dị chưa được làm sáng tỏ nhưng được đồng ý nhất là do thay đổi vị trí DNA. Nhân tố thường gây ra biến dị tế bào là số lần cấy chuyền.
Số lần cấy chuyền càng nhiều càng cho độ biến dị cao. Biến dị nhiễm sắc thể nhiều hơn khi nuôi cấy kéo dài [7]. Số lần cấy chuyền ít và thời gian giữa hai lần cấy chuyền ngắn làm giảm sự biến dị. Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy Thường chúng ta hay thấy hiện tượng hóa nâu hay hoá đen mẫu làm sinh trưởng của mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu.
Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có 8 chứa các hợp chất Tannin và Hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn trong mô non. Các phân tử Phenol làm nâu mẫu Cattleya là Eucomic acid và Tyramine.