Phân tích protein lá đậu tương DT12 nhiễm gỉ sắt khi xử lý đất hiếm

Nghiên cứu thành phần điện di protein lá đậu tương DT12 nhiễm bệnh gỉ sắt, xử lý phức đất hiếm. Phân tích chuyên sâu, kết quả giá trị cho nông nghiệp.

• Tác giả: Dương Thị Lịch
• Người hướng dẫn: Ts. Vũ Thanh Trà
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Phân tích thành phần điện di protein lá của giống đậu tương DT12 nhiễm bệnh gỉ sắt khi xử lý phức đất hiếm
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1.1. Lí do chọn đề tài
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Nội dung nghiên cứu
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Cây đậu tƣơng và tình hình sản xuất đậu tƣơng
• 1.1.1. Cây đậu tương
• 1.1.2. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam
• 1.2. Bệnh gỉ sắt đậu tương
• 1.2.1. Lịch sử phát triển bệnh
• 1.2.2. Tác nhân gây bệnh
• 1.3. Tính kháng của cây và kích thích tính kháng của cây trồng
• 1.3.1. Khái niệm về tính kháng và cơ chế kháng ở cây
• 1.3.1.1. Khái niệm tính kháng
• 1.3.1.2. Cơ chế kháng ở thực vật
• 1.3.2. Kích thích tính kháng ở cây trồng
• 1.3.3. Tính kháng bệnh gỉ sắt hại đậu tương
• 1.3.4. Một số nghiên cứu ứng dụng kích thích tính kháng bệnh trên cây trồng
• 1.3.4.1. Những nghiên trên thế giới
• 1.3.4.2. Nghiên cứu ứng dụng kích thích tính kháng bệnh trên cây trồng ở Việt Nam
• 1.4. Đất hiếm và khả năng kích kháng đối với cây trồng
• 1.4.1. Các nguyên tố đất hiếm
• 1.4.2. Tác động của đất hiếm đối với cây trồng
• 1.4.3. Nghiên cứu ứng dụng đất hiếm đối với cây trồng ở Việt Nam
• 1.5. Protein ở lá cây đậu tương
• 1.5.1. Thành phần protein ở lá cây đậu tương
• 1.5.2. Những nghiên cứu protenin ở lá đậu tương
• 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu và phương pháp thu thập lá bệnh
• 2.2. Máy móc và thiết bị
• 2.3. Phương pháp nhiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp nhiễm bệnh nhân tạo và thu mẫu lá
• 2.3.2. Tách chiết protein từ lá đậu tương
• 2.3.3. Xác định hàm lượng protein
• 2.3.4. Điện di SDS-PAGE
• 2.3.5. Điện di hai chiều 2DE
• 2.3.6. Nhuộm protein và phân tích hình ảnh gel
• 2.3.7. Nhận diện protein trên bản điện di 2DE
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả gây nhiễm bệnh và kiểm tra tính kháng bệnh
• 3.2. Kết quả tách chiết protein
• 3.3. Kết quả điện di SDS-PAGE
• 3.4. Kết quả điện di 2 chiều 2DE
• 3.4.1. Nhận diện các protein lá mẫu DT12 thí nghiệm
• 3.4.2. So sánh mức độ biểu hiện của protein lá sau khi xử lý phức đất hiếm
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Đậu tương DT12 và bệnh gỉ sắt Hiểu rõ thách thức

Đậu tương (Glycine max) là cây trồng chiến lược trong nông nghiệp Việt Nam. Nó cung cấp nguồn đạm thực vật dồi dào và có giá trị kinh tế cao. Trong số nhiều giống, giống đậu tương DT12 được ưa chuộng nhờ tiềm năng năng suất. Tuy nhiên, giống này lại mẫn cảm với một trong những dịch bệnh nguy hiểm nhất: bệnh gỉ sắt châu Á. Bệnh do nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra, có khả năng làm giảm năng suất tới 80-100% trong các vụ dịch nặng. Việc tìm kiếm giải pháp phòng trừ hiệu quả và bền vững là một yêu cầu cấp thiết. Các phương pháp truyền thống như sử dụng thuốc hóa học bộc lộ nhiều hạn chế về chi phí và tác động môi trường. Hướng đi mới tập trung vào việc kích hoạt cơ chế kháng bệnh thực vật tự nhiên. Một trong những giải pháp tiềm năng là sử dụng các nguyên tố đất hiếm (REEs). Nghiên cứu của Dương Thị Lịch (2015) đã đi sâu phân tích sự thay đổi thành phần protein lá của giống DT12 sau khi xử lý phức đất hiếm để chống lại bệnh gỉ sắt. Cách tiếp cận này không chỉ mở ra một phương pháp bảo vệ cây trồng mới mà còn giúp tìm hiểu sâu hơn về phản ứng sinh hóa của cây ở cấp độ phân tử, cụ thể là sự thay đổi trong hệ protein lá - cơ quan trực tiếp chịu ảnh hưởng của bệnh.

1.1. Tổng quan về giống đậu tương DT12 Glycine max

Giống đậu tương DT12, có nguồn gốc từ Trung Quốc, đã được đưa vào sản xuất tại Việt Nam và cho thấy nhiều đặc tính nông học quý giá. Đây là giống có thời gian sinh trưởng ngắn, thích nghi rộng và có tiềm năng cho năng suất đậu tương cao. Hạt đậu tương DT12 có hàm lượng protein thô và lipid tốt, đáp ứng yêu cầu cho cả ngành công nghiệp chế biến thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Tuy nhiên, một trong những nhược điểm lớn nhất của giống DT12 là tính mẫn cảm cao với bệnh gỉ sắt. Khi không có biện pháp can thiệp, bệnh có thể bùng phát thành dịch và gây thiệt hại kinh tế nặng nề. Điều này đặt ra thách thức cho việc duy trì sản xuất bền vững và nâng cao chất lượng nông sản, đòi hỏi phải có các giải pháp bảo vệ thực vật tiên tiến và an toàn.

1.2. Mối đe dọa từ nấm Phakopsora pachyrhizi và bệnh gỉ sắt

Bệnh rỉ sắt châu Á, gây ra bởi nấm ký sinh chuyên tính Phakopsora pachyrhizi, là một trong những bệnh hại nghiêm trọng nhất trên cây đậu tương toàn cầu. Nấm tấn công chủ yếu trên lá, làm giảm khả năng quang hợp, gây rụng lá sớm và ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình hình thành, phát triển của hạt. Triệu chứng bệnh thể hiện qua hai kiểu phản ứng chính: vết bệnh màu nâu vàng (TAN) đặc trưng cho giống nhiễm bệnh và vết bệnh màu nâu đỏ (RB) đặc trưng cho giống kháng bệnh. Nghiên cứu cho thấy bệnh gây ra một dạng stress sinh học cực đoan, làm thay đổi toàn diện các quá trình sinh lý cây trồng. Các phương pháp phòng trừ hiện nay chủ yếu dựa vào thuốc diệt nấm, nhưng việc này gây tốn kém và tiềm ẩn nguy cơ kháng thuốc của mầm bệnh. Do đó, việc nghiên cứu các giải pháp kích kháng tự nhiên là hướng đi mang tính đột phá và bền vững.

II. Phân tích stress sinh học khi DT12 bị nhiễm bệnh gỉ sắt

Khi nấm Phakopsora pachyrhizi xâm nhiễm, cây đậu tương DT12 phải đối mặt với một tình trạng stress sinh học nghiêm trọng. Mầm bệnh không chỉ hút chất dinh dưỡng mà còn phá vỡ cấu trúc tế bào lá, cản trở quá trình quang hợp. Lá cây xuất hiện các vết bệnh, ban đầu là những chấm nhỏ, sau đó lớn dần và liên kết thành mảng lớn. Sự phá hủy mô lá làm giảm tổng lượng diệp lục, dẫn đến suy giảm khả năng tổng hợp năng lượng. Quá trình này kích hoạt một loạt các phản ứng phòng vệ của cây. Tuy nhiên, ở các giống mẫn cảm như DT12, các phản ứng này thường không đủ mạnh hoặc không kịp thời để ngăn chặn sự phát triển của nấm. Hậu quả là cây bị suy kiệt, lá rụng hàng loạt, hạt lép và sản lượng sụt giảm nghiêm trọng. Việc hiểu rõ những thay đổi về sinh hóa, đặc biệt là sự biến đổi của hệ protein, là chìa khóa để tìm ra cách tăng cường khả năng chống chịu cho cây. Nghiên cứu tập trung vào việc phân tích protein giúp xác định các protein liên quan trực tiếp đến cơ chế phòng vệ, từ đó có thể tìm cách tác động và kích hoạt chúng một cách hiệu quả hơn.

2.1. Cơ chế kháng bệnh thực vật và phản ứng của cây trồng

Mọi thực vật đều sở hữu một cơ chế kháng bệnh thực vật tiềm tàng. Cơ chế này bao gồm các hàng rào vật lý (lớp cutin, vách tế bào) và các phản ứng sinh hóa (sản xuất phytoalexin, protein liên quan đến bệnh PR). Khi mầm bệnh tấn công, cây sẽ nhận diện và kích hoạt một chuỗi tín hiệu phòng vệ. Ở các giống kháng, quá trình này diễn ra nhanh chóng và mạnh mẽ, cô lập và tiêu diệt mầm bệnh tại điểm xâm nhiễm. Tuy nhiên, ở giống DT12, phản ứng này yếu ớt. Nấm Phakopsora pachyrhizi có thể dễ dàng vượt qua các hàng rào bảo vệ và phát triển lan rộng. Việc thiếu hụt hoặc biểu hiện chậm các gen kháng (R-genes) và các protein phòng vệ tương ứng là nguyên nhân chính dẫn đến tính mẫn cảm của giống này. Do đó, mục tiêu của các phương pháp kích kháng là "đánh thức" hoặc tăng cường hệ thống phòng vệ sẵn có này.

2.2. Hạn chế của các biện pháp kiểm soát bệnh gỉ sắt hiện nay

Việc kiểm soát bệnh gỉ sắt châu Á hiện nay vẫn phụ thuộc nhiều vào thuốc trừ nấm hóa học. Mặc dù có hiệu quả tức thời, giải pháp này tiềm ẩn nhiều rủi ro. Chi phí thuốc cao làm tăng giá thành sản xuất, ảnh hưởng đến lợi nhuận của nông dân. Việc phun thuốc thường xuyên có thể để lại dư lượng hóa chất trên nông sản, gây lo ngại về an toàn thực phẩm. Hơn nữa, việc lạm dụng một loại hoạt chất có thể dẫn đến hiện tượng nấm bệnh kháng thuốc, làm giảm hiệu quả phòng trừ trong dài hạn. Về phía chọn tạo giống, việc lai tạo ra một giống mới có tính kháng bền vững là một quá trình tốn nhiều thời gian và công sức. Do đó, việc tìm kiếm một giải pháp bổ trợ như sử dụng phân bón đất hiếm để kích kháng cho các giống năng suất cao sẵn có như DT12 là một hướng đi chiến lược, giúp cân bằng giữa hiệu quả kinh tế và phát triển nông nghiệp bền vững.

III. Giải pháp đất hiếm Kích kháng hiệu quả cho đậu tương DT12

Một hướng tiếp cận mới và đầy hứa hẹn trong việc tăng cường sức đề kháng cho cây trồng là sử dụng nguyên tố đất hiếm (REEs). Đây là một nhóm gồm 17 nguyên tố vi lượng, khi được cung cấp ở nồng độ thấp, có thể mang lại những tác động tích cực đến sinh lý cây trồng. Thay vì diệt trừ mầm bệnh trực tiếp như thuốc hóa học, REEs hoạt động như một chất kích kháng (elicitor). Chúng kích hoạt hệ thống phòng thủ tự nhiên của cây, giúp cây chủ động chống lại sự xâm nhiễm của mầm bệnh. Trong nghiên cứu của Dương Thị Lịch (2015), phức đất hiếm "Thủy tiên" đã được sử dụng để xử lý cho giống đậu tương DT12 nhiễm bệnh gỉ sắt. Kết quả ban đầu cho thấy, những cây được xử lý có biểu hiện kháng bệnh rõ rệt. Các vết bệnh không phát triển lan rộng, phiến lá giữ được màu xanh và cấu trúc tương tự như giống kháng DT2000. Điều này chứng tỏ phân bón đất hiếm có khả năng điều chỉnh các phản ứng sinh hóa bên trong cây, giúp tăng cường khả năng chống chịu stress sinh học một cách hiệu quả.

3.1. Tác động của phân bón đất hiếm đến sinh lý cây trồng

Phân bón đất hiếm cung cấp các dinh dưỡng vi lượng thiết yếu, đóng vai trò như chất xúc tác cho nhiều quá trình sinh hóa trong cây. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng REEs có thể làm tăng khả năng phát triển của bộ rễ, cải thiện hiệu quả hấp thụ nước và các chất dinh dưỡng đa lượng như N, P, K. Quan trọng hơn, chúng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình quang hợp. Việc xử lý đất hiếm giúp tăng hàm lượng diệp lục, làm lá có màu xanh đậm hơn và tăng hiệu suất chuyển hóa năng lượng mặt trời. Một cây trồng khỏe mạnh, được cung cấp đủ dinh dưỡng và có bộ máy quang hợp hoạt động tối ưu sẽ có sức đề kháng tốt hơn trước các tác nhân gây hại. Đây chính là cơ sở cho tác dụng kích kháng của các nguyên tố đất hiếm (REEs).

3.2. Kích hoạt hoạt tính enzyme và cơ chế bảo vệ của REEs

Tác động của nguyên tố đất hiếm (REEs) ở cấp độ phân tử là rất đáng chú ý. Chúng có khả năng làm tăng hoạt tính enzyme phòng vệ trong cây. Các enzyme quan trọng như peroxidase (POD) và superoxide dismutase (SOD) đóng vai trò then chốt trong việc trung hòa các gốc oxy hóa tự do (ROS) được tạo ra khi cây bị stress. Bằng cách tăng cường hoạt động của các enzyme này, REEs giúp bảo vệ màng tế bào khỏi bị hư hại, duy trì sự ổn định của các quá trình trao đổi chất. Luận văn của Dương Thị Lịch (2015) cũng trích dẫn các nghiên cứu cho thấy REEs có thể điều chỉnh các hormone thực vật và tăng cường tổng hợp amino acid, góp phần vào việc nâng cao khả năng chống chịu chung của cây. Cơ chế này giải thích tại sao cây DT12 sau khi xử lý đất hiếm lại có khả năng kháng lại sự tấn công của nấm Phakopsora pachyrhizi.

IV. Phương pháp phân tích protein lá DT12 sau xử lý đất hiếm

Để chứng minh tác dụng kích kháng của đất hiếm ở cấp độ phân tử, nghiên cứu đã sử dụng các phương pháp phân tích protein hiện đại. Mục tiêu là so sánh hệ protein lá của ba nhóm mẫu: (1) DT12 đối chứng (nhiễm bệnh, không xử lý), (2) DT12 thí nghiệm (nhiễm bệnh, có xử lý phức đất hiếm), và (3) DT2000 (giống kháng bệnh). Bằng cách này, có thể xác định được liệu việc xử lý đất hiếm có làm thay đổi hàm lượng protein thô và cấu trúc hệ protein của DT12 theo hướng giống với giống kháng DT2000 hay không. Quá trình nghiên cứu bắt đầu bằng việc gây nhiễm bệnh nhân tạo với bào tử nấm Phakopsora pachyrhizi trong điều kiện nhà lưới được kiểm soát. Sau đó, lá cây từ các lô được thu thập để tiến hành tách chiết protein tổng số. Kỹ thuật điện di protein trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE) và điện di hai chiều (2DE) được áp dụng để phân tách và quan sát sự khác biệt trong biểu hiện protein giữa các mẫu. Đây là một phương pháp mạnh mẽ, cho phép "chụp lại" bức tranh toàn cảnh về những thay đổi sinh hóa xảy ra bên trong lá cây khi chúng phản ứng với mầm bệnh và chất kích kháng.

4.1. Tách chiết và xác định hàm lượng protein thô trong lá

Quy trình tách chiết protein từ lá đậu tương đòi hỏi sự cẩn trọng để thu được mẫu sạch và không bị biến tính. Lá cây được nghiền mịn trong nitơ lỏng, sau đó protein được kết tủa bằng dung dịch TCA/acetone. Phương pháp này giúp loại bỏ hiệu quả các hợp chất không phải protein như diệp lục, phenol và lipid. Sau khi tách chiết, hàm lượng protein thô của mỗi mẫu được xác định bằng phương pháp Bradford. Kết quả từ luận văn cho thấy, mẫu DT12 đối chứng (bị bệnh nặng) có nồng độ protein thấp nhất (1,67 mg/ml), trong khi mẫu DT12 thí nghiệm (1,84 mg/ml) và mẫu kháng DT2000 (1,92 mg/ml) có nồng độ cao hơn. Sự chênh lệch này phản ánh tình trạng sức khỏe của cây: bệnh tật làm suy giảm quá trình tổng hợp protein, trong khi việc kích kháng bằng đất hiếm giúp duy trì và phục hồi quá trình này.

4.2. Kỹ thuật điện di SDS PAGE và 2DE trong nghiên cứu protein

Điện di là kỹ thuật nền tảng để nghiên cứu sự đa dạng và biểu hiện của protein. Kỹ thuật SDS-PAGE phân tách các protein dựa trên khối lượng phân tử của chúng, cho thấy các băng protein chính. Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy hồ sơ protein của mẫu DT12 thí nghiệm có nhiều điểm tương đồng với mẫu kháng DT2000 hơn là mẫu DT12 đối chứng. Để có cái nhìn chi tiết hơn, kỹ thuật điện di hai chiều (2DE) được sử dụng. 2DE phân tách protein theo hai chiều: điểm đẳng điện (pI) và khối lượng phân tử, tạo ra một "bản đồ" protein với hàng trăm điểm riêng biệt. Bằng cách so sánh các bản đồ này, các nhà khoa học có thể xác định chính xác những protein nào có sự thay đổi về mức độ biểu hiện (tăng hoặc giảm) sau khi xử lý đất hiếm, từ đó suy ra vai trò của chúng trong cơ chế kháng bệnh thực vật.

V. Kết quả Đất hiếm tăng tính kháng bệnh gỉ sắt cho DT12

Các kết quả phân tích đã củng cố mạnh mẽ giả thuyết rằng phức đất hiếm có khả năng kích kháng bệnh gỉ sắt châu Á trên giống đậu tương DT12. Về mặt hình thái, lá cây DT12 được xử lý đất hiếm cho thấy sự phát triển của các vết bệnh bị kìm hãm đáng kể, lá giữ được màu xanh và ít bị biến dạng hơn so với lô đối chứng. Về mặt sinh hóa, sự thay đổi này được phản ánh qua nồng độ và thành phần protein. Nồng độ protein tổng số trong lá của cây được xử lý cao hơn, gần bằng với giống kháng DT2000. Phân tích điện di SDS-PAGE cho thấy các băng protein chính, đặc biệt là các protein liên quan đến quang hợp như Rubisco, được duy trì ở mức độ cao hơn ở mẫu thí nghiệm. Điều này cho thấy cây không chỉ chống lại sự tấn công của nấm Phakopsora pachyrhizi mà còn duy trì được các hoạt động sinh lý cơ bản, đảm bảo cho sự sinh trưởng và tiềm năng cho năng suất đậu tương. Những phát hiện này mở ra một hướng ứng dụng thực tiễn cho phân bón đất hiếm không chỉ như một nguồn dinh dưỡng vi lượng mà còn là một tác nhân bảo vệ thực vật sinh học.

5.1. So sánh biểu hiện protein lá giữa các mẫu nghiên cứu

Kết quả điện di SDS-PAGE trong nghiên cứu của Dương Thị Lịch (2015) đã chỉ ra những khác biệt rõ rệt. Ở mẫu DT12 đối chứng bị bệnh nặng, một số băng protein quan trọng có cường độ mờ hơn, cho thấy sự suy giảm trong quá trình tổng hợp. Ngược lại, ở mẫu DT12 thí nghiệm, các băng protein này đậm và rõ nét hơn, tương tự như ở mẫu kháng DT2000. Đặc biệt, các protein trong vùng khối lượng trung bình (35-66 kDa), nơi chứa nhiều enzyme và các tiểu phần của protein quang hợp, cho thấy sự khác biệt lớn nhất. Sự tương đồng trong hồ sơ protein giữa mẫu DT12 được xử lý và giống kháng DT2000 là một bằng chứng phân tử mạnh mẽ, cho thấy đất hiếm đã kích hoạt thành công một phản ứng phòng vệ hiệu quả, giúp cây duy trì trạng thái sinh lý ổn định dưới áp lực của stress sinh học.

5.2. Phân tích diệp lục và tác động đến quang hợp của cây

Mặc dù luận văn không thực hiện phân tích diệp lục định lượng, các quan sát hình thái và kết quả phân tích protein đều gián tiếp khẳng định tác động tích cực của đất hiếm lên bộ máy quang hợp. Lá cây DT12 thí nghiệm xanh hơn, ít bị vàng úa, cho thấy hàm lượng diệp lục được bảo vệ tốt hơn. Kết quả điện di cũng cho thấy các protein chủ chốt của quá trình quang hợp (ví dụ như Rubisco) được duy trì ở mức cao. Khi bộ máy quang hợp hoạt động hiệu quả, cây có đủ năng lượng để vừa sinh trưởng vừa huy động cho các cơ chế phòng vệ. Đây là yếu tố quyết định giúp cây vượt qua giai đoạn bị bệnh tấn công và tiếp tục phát triển, từ đó đảm bảo năng suất đậu tương và nâng cao chất lượng nông sản cuối cùng.

VI. Hướng đi mới Nâng cao năng suất đậu tương với đất hiếm

Nghiên cứu về tác dụng kích kháng của phức đất hiếm trên giống đậu tương DT12 trước bệnh gỉ sắt đã mở ra một hướng đi mới và bền vững cho ngành nông nghiệp. Kết quả không chỉ cho thấy một giải pháp tiềm năng để bảo vệ cây trồng mà còn cung cấp những hiểu biết sâu sắc về cơ chế kháng bệnh thực vật ở cấp độ phân tử. Việc sử dụng nguyên tố đất hiếm (REEs) với liều lượng thích hợp có thể trở thành một công cụ quan trọng trong các chương trình quản lý dịch hại tổng hợp (IPM). Giải pháp này giúp giảm sự phụ thuộc vào thuốc trừ sâu hóa học, góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe người tiêu dùng. Hơn nữa, việc tăng cường sức khỏe nội tại của cây trồng thông qua dinh dưỡng vi lượng và kích kháng sinh học là con đường tất yếu để nâng cao năng suất đậu tương một cách ổn định. Tương lai của ngành trồng trọt đòi hỏi các giải pháp thông minh, kết hợp giữa tiềm năng di truyền của giống và các biện pháp canh tác tiên tiến, và đất hiếm chính là một trong những chìa khóa cho hướng đi đó.

6.1. Ứng dụng thực tiễn trong nông nghiệp bền vững

Từ kết quả nghiên cứu, việc ứng dụng phân bón đất hiếm vào thực tiễn sản xuất là hoàn toàn khả thi. Các sản phẩm này có thể được phát triển dưới dạng phân bón lá, phun định kỳ trong giai đoạn cây trồng dễ bị nhiễm bệnh nhất. Chi phí hợp lý và phương pháp sử dụng đơn giản sẽ giúp nông dân dễ dàng tiếp cận. Lợi ích kép của việc vừa cung cấp dinh dưỡng vi lượng, vừa tăng cường khả năng kháng bệnh sẽ giúp tối ưu hóa đầu tư và tăng lợi nhuận. Về lâu dài, việc áp dụng rộng rãi phương pháp này sẽ góp phần xây dựng một nền nông nghiệp bền vững, sản xuất ra những sản phẩm an toàn, chất lượng cao, đáp ứng yêu cầu ngày càng khắt khe của thị trường và nâng cao chất lượng nông sản Việt Nam.

6.2. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của dinh dưỡng vi lượng

Nghiên cứu này là một bước khởi đầu quan trọng. Để tối ưu hóa ứng dụng, các nghiên cứu trong tương lai cần đi sâu hơn. Cần xác định chính xác những protein nào được kích hoạt bởi đất hiếm bằng các kỹ thuật tiên tiến như khối phổ (mass spectrometry). Việc tìm hiểu chuỗi tín hiệu phân tử từ khi cây tiếp xúc với REEs đến khi các gen phòng vệ được biểu hiện sẽ giúp làm sáng tỏ hoàn toàn cơ chế tác động. Ngoài ra, cần khảo nghiệm các nồng độ, thời điểm phun và sự kết hợp của các nguyên tố đất hiếm (REEs) khác nhau trên nhiều giống cây trồng và đối với nhiều loại mầm bệnh. Những nghiên cứu này sẽ cung cấp cơ sở khoa học vững chắc để phát triển các sản phẩm kích kháng sinh học thế hệ mới, hiệu quả và chuyên biệt hơn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM DƢƠNG THỊ LỊCH PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ĐIỆN DI PROTEIN LÁ CỦA GIỐNG ĐẬU TƢƠNG DT12 NHIỄM BỆNH GỈ SẮT KHI XỬ LÝ PHỨC ĐẤT HIẾM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM DƢƠNG THỊ LỊCH PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ĐIỆN DI PROTEIN LÁ CỦA GIỐNG ĐẬU TƢƠNG DT12 NHIỄM BỆNH GỈ SẮT KHI XỬ LÝ PHỨC ĐẤT HIẾM Chuyên ngành: Di Truyền Học Mã số: 62 46 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Vũ Thanh Trà THÁI NGUYÊN - 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.vn/ LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Vũ Thanh Trà đã tận tình hướng dẫn và truyền thụ cho tôi kiến thức cũng như lòng say mê khoa học trong suốt quá trình học tập và thực hiện khoá luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới GS. Chu Hoàng Mậu vì những góp ý quý báu cho quá trình làm luận văn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ trong Viện Bảo Vệ Thực Vật đã nhiệt tình dạy bảo, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khoá luận. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân - những người đã luôn động viên, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Thái Nguyên, ngày 15 tháng 04 năm 2015 Học viên Dƣơng Thị Lịch Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN i http://www.vn/ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi cùng gióa viên hướng dẫn. Các nội dung nêu trong luận văn là kết quả làm việc củachúng tôi và chưa được công bố trong bất cứ một công trình nào khác. Thái Nguyên, ngày 15 tháng 04 năm 2015 Học viên Dƣơng Thị Lịch Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN ii http://www.vn/ MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN . i LỜI CAM ĐOAN. ii MỤC LỤC . iii DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT . iv DANH MỤC BẢNG . v DANH MỤC HÌNH . vi MỞ ĐẦU . Lí do chọn đề tài . Mục tiêu nghiên cứu . Nội dung nghiên cứu . TỔNG QUAN TÀI LIỆU . Cây đậu tương và tình hình sản xuất đậu tương . Cây đậu tương. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam . Bệnh gỉ sắt đậu tương . Lịch sử phát triển bệnh . Tác nhân gây bệnh . Tính kháng của cây và kích thích tính kháng của cây trồng . Khái niệm về tính kháng và cơ chế kháng ở cây . Khái niệm tính kháng . Cơ chế kháng ở thực vật . Kích thích tính kháng ở cây trồng . Tính kháng bệnh gỉ sắt hại đậu tương . Một số nghiên cứu ứng dụng kích thích tính kháng bệnh trên cây trồng . Những nghiên trên thế giới . Nghiên cứu ứng dụng kích thích tính kháng bệnh trên cây trồng ở Việt Nam . 17 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN iii http://www. Đất hiếm và khả năng kích kháng đối với cây trồng . Các nguyên tố đất hiếm . Tác động của đất hiếm đối với cây trồng . Nghiên cứu ứng dụng đất hiếm đối với cây trồng ở Việt Nam . Protein ở lá cây đậu tương . Thành phần protein ở lá cây đậu tương . Những nghiên cứu protenin ở lá đậu tương . NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . Vật liệu và phương pháp thu thập lá bệnh . Máy móc và thiết bị . Phương pháp nhiên cứu . Phương pháp nhiễm bệnh nhân tạo và thu mẫu lá. Tách chiết protein từ lá đậu tương . Xác định hàm lượng protein .4 Điện di SDS-PAGE . Điện di hai chiều 2DE . Nhuộm protein và phân tích hình ảnh gel . Nhận diện protein trên bản điện di 2DE . KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . Kết quả gây nhiễm bệnh và kiểm tra tính kháng bệnh . Kết quả tách chiết protein . Kết quả điện di SDS-PAGE . Kết quả điện di 2 chiều 2DE. Nhận diện các protein lá mẫu DT12 thí nghiệm . So sánh mức độ biểu hiện của protein lá sau khi xử lý phức đất hiếm . 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN iv http://www.vn/ DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa của từ viết tắt 2DE Two dimentional electrophoresis - điện di hai chiều µl Microliter APS Ammonium persulfate CHAPS 3-[(3- Cholamidoppropyl)dimethylammonio] DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiamine tetra acetic acid ESI-Q TRAP - IAA Indole-3-acetamide IEF Isoelectric Focusing - đẳng điện IPG - kDa Kilo Dalton mA MiliAmpe ml Mililiter MS/MS - OD - pI Isoelectric point - Điểm đẳng điện PMSF Phenylmethanesulphonylfluoride SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE - - TCA Trichloracetic acid TEMED N,N,N‟,N‟ Tetramethylethylenediamine V Volt - Vôn w/v Weight/volume - Khối lượng/thể tích Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN iv http://www.vn/ DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Phương pháp và nồng độ đất hiếm đối với một số cây trồng [32]. Ứng dụng phân bón vi lượng đất hiếm . Nguồn gốc, đặc điểm của giống thí nghiệm . Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE . Nồng độ protein lá của các giống đậu tương . Kết quả nhận diện của 8 điểm protein trên gel DT12 thí nghiệm . 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN v http://www.vn/ DANH MỤC HÌNH Hình 1. Diện tích trồng và sản lượng cây đậu tương tại Việt Nam (2007 - 2013) . So sánh các kiểu hình khác nhau của lá đậu tương khi nhiễm bệnh (A) khi kháng bệnh (B) và khi miễn nhiễm với bệnh (C) . Hình ảnh lá nhiễm bệnh với 2 vòng bệnh gỉ sắt (A). Bảng phân bố các nguyên tố . Các giống đậu tương được trồng trên đồng ruộng tại Viện bảo vệ thực vật . Đánh giá khả năng nhiễm bệnh và kháng bệnh của giống DT12 36 Hình 3. Kết quả điện di SDS - PAGE protein lá của 3 mẫu . Kết quả điện di protein lá mẫu DT12 thí nghiệm sau khi xử lý phức đất hiếm . So sánh mức độ biểu hiện protein lá đậu tương ở mẫu DT12 đối chứng (A) và mẫu DT12 thí nghiệm (B) . 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN vi http://www.vn/ MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Trong chương trình khung về nghiên cứu khoa học, công nghệ nông nghiệp giai đoạn 2013-2020, đậu tương đã được xác định là một trong những cây công nghiệp chủ lực. Chọn tạo giống đậu tương năng suất cao, chất lượng tốt, kháng sâu bệnh hoặc tăng cường khả năng chống chịu sâu bệnh là một nội dung của chương trình. Cây đậu tương là một trong những loại cây trồng được biết đến từ rất sớm. Ở trung du Việt Nam đậu tương được trồng từ lâu đời, sớm nhất là các tỉnh thuộc khu vực trung du, miền núi phía Bắc và miền đông Nam Bộ. Đậu tương (Glycine max (L.) Merill) vừa là cây công nghiệp ngắn ngày vừa là cây thực phẩm, thuộc họ đậu, có phổ thích nghi rộng. Hạt đậu tương có giá trị dinh dưỡng cao. Các thực phẩm làm từ đậu tương được xem là một loại "thịt không xương" vì chứa tỷ lệ đạm thực vật dồi dào, có thể thay thế cho nguồn đạm từ thịt động vật. Tại các quốc gia như Nhật Bản, Trung Quốc, 60% lượng đạm tiêu thụ hằng ngày là do đậu tương cung cấp. Hàm lượng chất đạm chứa trong đậu tương cao hơn nhiều so với lượng chất đạm chứa trong các loại đậu khác. Các sản phẩm từ đậu tương được ứng dụng rộng rãi cho nhiều mục đích khác nhau để làm thức ăn, dầu ăn, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm, nguyên liệu cho y học và công nghiệp…. Cây đậu tương có khả năng thích nghi với nhiều vùng sinh thái khác nhau.Với chu kì sinh trưởng phát triển ngắn, đậu tương trồng được nhiều vụ/năm, trị gia tăng, góp phần khai thác triệt để diện tích gieo trồng và nâng cao hiệu quả kinh tế cho người sản xuất. Mặc dù diện tích gieo trồng đậu tương hàng năm có tăng, tuy n Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 1 http://www.vn/ gây ra bởi các yếu tố sinh học, trong đó đậu tương. Bệnh gỉ sắt ở đậu tương do loài nấm Phakopsora pachyrhizi Sydow gây ra và đang được coi là một trong những mối đe dọa chính trên cây đậu tương [64]. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt (Phakopsora pachyrhisi Sydow) ở đậu tương đã được tiến hành và thu được những kết quả đáng kể trong những năm gần đây. Những đề tài, dự án tập trung nghiên cứu bệnh gỉ sắt và đánh giá khả năng chống chịu bệnh gỉ sắt của cây đậu tương là cơ sở để đánh giá và tuyển chọn giống đậu tương kháng bệnh. Các nghiên cứu, đánh giá sâu hơn trên phương diện phân tử như sử dụng chỉ thị phân tử SSR với các cặp mồi có vị trí liền kề với gen kháng gỉ sắt, để lập bản đồ gen kháng hoặc nghiên cứu ở mức độ phân tử protein với phương pháp điện di một chiều và hai chiều để so sánh và phát hiện sự khác nhau giữa điểm protein của giống kháng với giống nhiễm. Trên thực tế, một số giống kháng bệnh gỉ sắt được chọn tạo, xác định tính kháng bệnh và đã phát huy hiệu quả rõ rệt trong sản xuất cũng như làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống kháng bệnh như giống đậu tương ĐT2000 [2], Cao Bằng U8352, Vàng Hà Giang, Nhất tiến Hữu Lũng Lạng Sơn. Các kết quả nghiên cứu về bệnh gỉ sắt và nguồn gen kháng bệnh đều chứng tỏ sử dụng giống kháng bệnh là biện pháp duy nhất có hiệu quả cho sản xuất [35] và phát triển bền vững. Tuy nhiên, tại các vùng ổ dịch, việc tuyển chọn giống kháng có lúc chưa đáp ứng đựợc ngay với nhu cầu của sản xuất. Bởi vậy rất cần tìm ra các chế phẩm có tác dụng làm tăng tính kháng của cây trồng để hỗ trợ cho các giống có năng suất cao thích hợp với điều kiện sản xuất của mỗi vùng. Nghiên cứu khả năng chống chịu của các nguồn gen, các dòng, giống đậu tương triển vọng, có tính kháng với các nòi ký sinh gây hại tại một số vùng ổ địch và một số vùng sinh thái khác nhau là nhiệm vụ trọng tâm; đồng thời tìm kiếm giải pháp nâng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 2 http://www.vn/ cao tính kháng của cây đậu tương cũng như nghiên cứu ở mức độ phân tử protein với phương pháp điện di để so sánh và phát hiện khả năng kích kháng đối với cây trồng này là vấn đề bức xúc cần được giải quyết.