Đặt vấn đề Lan Hồ Điệp có tên khoa học Phalaenopsis Blullle, 1825. Họ phụ Vandoideae. Có tên từ chữ Phalaina nghĩa là “con bướm” và opsis có nghĩa là “giống như”. Giống Hồ Điệp có khoảng trên 60 loài và ngày càng được lai tạo ra rất nhiều cây lai hoa rất đẹp và quý phái.
Hồ Điệp được khám phá năm 1750, đầu tiên được ông Rumphius đặt tên là Angraecum album. Năm 1753, Linne đổi tên thành Epidendrum. Năm 1825, nhà thực vật Hà Lan định danh lại là Phalaenopsis. Hồ Điệp phân bố chủ yếu ở các nước Đông Nam Á như: Malaysia, Indonesia, Philipin, phía đông Ấn Độ và Úc.
Ở Việt Nam có 107 loài và 1 thứ, phân bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam và trên một số đảo ven biển. Tuy nhiên, do nhiều nguyên nhân khác nhau, đến nay nhiều loài đã bị tuyệt chủng hoặc bị đe dọa tuyệt chủng. Một số loài nằm trong danh lục Đỏ của “ Sách đỏ Việt Nam”. Ở Việt Nam cũng có một số loài vì có hoa nhỏ nên được gọi là tiểu Hồ Điệp (Phalaenopsis manni, gibbosa, lobbi, fuscata, cornucervi).
Hồ Điệp có thể mọc ở khí hậu nhiệt đới và đồi núi cao 2000m nên vừa chịu được khí hậu nóng ẩm vừa chịu được khí hậu mát. Các loài này đều có hoa nhỏ nhưng màu sắc đẹp, cấu trúc kỳ diệu, rất dễ thương và có hương thơm nên hấp dẫn đối với giới sưu tầm lan rừng nguyên thủy. Đây cũng là nguồn gen quý để phát triển công nghệ lai tạo hoa lan Việt Nam. Tuy nhiên, Hồ Điệp là loài lan khó nhân giống, hiện tại chỉ có một số cơ sở trường Đại học, Viện nghiên cứu có hướng phát triển trên những kĩ thuật mới như: Kỹ thuật nuôi cấy quang tự dưỡng, Bioreactor… nhưng vẫn chưa đưa ra áp dụng rộng rãi.
Công nghệ nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào là một trong những phương pháp nhân giống vô tính với những ưu điểm nổi trội là: Cho hệ số nhân giống rất cao, sản xuất quanh năm không phụ thuộc vào mùa vụ, cần ít diện tích sản xuất và vật liệu nhân giống ban đầu, cây giống sản xuất hoàn toàn sạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền (Nguyễn Quang Thạch, 1995)[12], việc vận chuyển cây giống đi xa thuận tiện, tổn thất ít, chất lượng cây được đảm bảo do đó đáp ứng được các yêu cầu về sản xuất cây giống với số lượng mang tính công nghiệp. n 2 Trên cơ sở đó tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nhân nhanh giống lan Hồ Điệp (P.Tai-Lin Red Angel) nhập nội bằng phương pháp in vitro”. Mục đích nghiên cứu Hoàn thiện các khâu kỹ thuật nhân giống in vitro cho cây lan Hồ Điệp, từ lựa chọn vật liệu đưa vào nuôi cấy, cải tiến phương pháp khử trùng đến cải tiến phương pháp nhân nhanh và môi trường nhân nhanh để gia tăng hệ số nhân và chất lượng cây hình thành. Trên cơ sở các biện pháp kỹ thuật, tìm ra quy trình phù hợp ứng dụng trong sản xuất giống hoa lan Hồ điệp có chất lượng, góp phần phát triển cây lan Hồ điệp giúp các cơ sở sản xuất kinh doanh áp dụng tiến bộ kỹ thuật một cách khoa học và có hiệu quả nhất.
Yêu cầu của đề tài - Xác định được nguồn vật liệu thích hợp để đưa vào nhân giống. - Cải tiến môi trường nuôi cấy khởi động tái sinh mẫu để gia tăng nguồn mẫu ban đầu. - Cải tiến môi trường nhân nhanh để gia tăng hệ số nhân. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài * Ý nghĩa khoa học - Thông qua đề tài, tìm hiểu được vai trò của một số chất kích thích sinh trưởng đối với quá trình tái sinh, nhân nhanh của cây lan Hồ Điệp.
- Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng phát sinh hình thái của lát mỏng. * Ý nghĩa thực tiễn sản xuất Sản xuất được cây con sinh trưởng, phát triển tốt, đồng đều và sạch bệnh với khối lượng lớn. Thuận tiện cho việc áp dụng các biện pháp kỹ thuật trong giai đoạn sản xuất hoa thương phẩm, giảm được giá thành, từ đó kích thích sản xuất hoa phát triển. n 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.
Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 2. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Nhân giống vô tính là hình thức nhân giống thông qua các cơ quan dinh dưỡng (thân, lá, vỏ, củ,…) bao gồm các phương pháp giâm cành, chiết cành, mắt ghép và nuôi cấy in vitro. Trong đó nuôi cấy in vitro được coi là phương pháp hữu hiệu nhất. Nhân giống vô tính in vitro được tiến hành trên nguyên tắc cắt nuôi đoạn thân có mang chồi ở nách lá, đoạn rễ hay mảnh củ, cánh hoa, có kích thước nhỏ phù hợp với điều kiện vô trùng của ống nghiệm (Ngô Xuân Bình và cs, 2003)[10].
Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống vô tính cổ điển như: giâm, chiết, ghép, tách dòng. Một kỹ thuật tiến bộ với những ưu điểm như: Tốc độ nhân giống cao từ 33 đến 1012 một năm (Ngô Xuân Bình và cs, 2003)[10], ví dụ trong 1ml dung dịch môi trường có từ 100.000 tế bào nuôi nếu ở điều kiện thích hợp mỗi tế bào có thể chuyển hóa tạo phôi và mọc cây, từ 1ml dung dịch môi trường có thể tạo ra cả rừng cây (Đỗ Năng Vịnh, 2005)[7]; Chủ động sản xuất, không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, mùa vụ; Có khả năng công nghiệp hóa cao do nuôi cấy trong điều kiện ổn định về môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ, ánh sáng, do đó có thể công nghiệp hóa hoàn toàn từ khâu nhân cây giống với số lượng lớn đến khi ươm trồng trong nhà lưới. Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa trên học thuyết về tính toàn năng của tế bào. Tính toàn năng của tế bào thực vật.
Cuối thế kỉ XIX đầu thế kỉ XX nhà sinh lý thực vật người Đức Haberlandt đã phát biểu tính toàn năng của tế bào như sau: Mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh (Lê Trần Bình và cs, 1997)[17]. Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Cho đến nay con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái n 4 sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ (Lê Trần Bình và cs, 1997)[17].
Trong nuôi cấy in vitro, tế bào thực vật thể hiện tính toàn năng thông qua sự phản phân hóa và phân hóa tế bào. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật Cơ thể thực vật trưởng thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau. Tuy nhiên ở tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyển hóa).
Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau. Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau của cơ thể. Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hóa có chức năng riêng biệt. Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình.
Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ cho ra các tế bào mới có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào. Sự giãn tế bào: Tế bào giãn ra cả về chiều ngang và chiều dọc làm tăng kích thước của từng cơ quan nói riêng và toàn bộ cơ thể nói chung. Sau hai giai đoạn này cùng với quá trình biệt hóa tế bào phân hóa thành các mô chức năng chuyên hóa chuyên biệt, đảm nhận các vai trò khác nhau trong cùng một cơ thể sống.
Phân hóa Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyển hóa Phản phân hóa n 5 Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh.
Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào (Lê Trần Bình và cs, 1997)[17]. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, yếu tố quyết định cho sự phân hóa tế bào và cơ quan nuôi cấy. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật * Điều kiện vô trùng Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng.
Nếu không đảm bảo tốt điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro. Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học, tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn. Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định.
Tuy vậy, nếu tìm được nồng độ và thời gian xử lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao, thông thường hay sử dụng một số hóa chất như: HgCl2 0,1%, nước Clolox, cồn 760, Ca(ClO)2,.