Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Cây cam (Citrus sinensis (L.) Osbeck) thuộc họ Rutaceae, là loại cây ăn quả lâu năm có giá trị dinh dưỡng cao, chứa nhiều vitamin (A, B1, C, B9), khoáng chất, chất xơ và các hợp chất chống oxy hóa có hoạt tính sinh học. Tại Việt Nam, nguồn gen cây có múi phân bố đa dạng tại nhiều vùng sinh thái đặc trưng như Tuyên Quang (cam sành Hàm Yên), Hà Giang, Hòa Bình (cam Cao Phong), Nghệ An (cam Vinh), Hà Tĩnh (cam Bù) và Bắc Giang (cam sành Bố Hạ). Trong đó, cam Bố Hạ từng là giống cây ăn quả đặc sản, thương hiệu mũi nhọn đóng góp vào kinh tế tỉnh Bắc Giang. Tuy nhiên, nguồn gen này đang bị thoái hóa và đứng trước nguy cơ mất giống sau khi Nông trường cam Bố Hạ giải thể.
Nhóm nghiên cứu thuộc đề tài "Bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen cam Bố Hạ, Bắc Giang" đã tiến hành điều tra và thu thập các dòng cam Bố Hạ còn sót lại tại vùng trồng truyền thống. Khóa luận này được thực hiện nhằm phân tích đa dạng di truyền và thiết lập quan hệ phát sinh chủng loài giữa các mẫu thu thập được với các giống cam, quýt trồng phổ biến ở Việt Nam.
Mục tiêu của đề tài:
- Mục tiêu tổng quát: Xác định mối quan hệ di truyền giữa cam Bố Hạ, Bắc Giang với một số giống cam khác bằng chỉ thị phân tử DNA.
- Mục tiêu cụ thể:
- Tách chiết được DNA tổng số từ lá cam, quýt đủ điều kiện để thực hiện phản ứng RAPD và ISSR.
- Phân tích được các phân đoạn DNA của các giống cam nghiên cứu bằng kỹ thuật RAPD và ISSR.
- Phân tích được mối quan hệ di truyền của cam Bố Hạ với các giống cam thu thập dựa trên sơ đồ phả hệ DNA.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: 32 mẫu cây có múi thuộc chi Citrus, bao gồm 4 mẫu thu thập tại huyện Yên Thế (tỉnh Bắc Giang), 8 mẫu lưu giữ tại Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên, 8 mẫu từ Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Cây có múi thuộc Viện Nghiên cứu Rau Quả, và 12 mẫu cam sành Hàm Yên (Tuyên Quang) lưu giữ tại Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
- Phạm vi nghiên cứu: Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ phân tử thông qua các phân đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD) và chuỗi lặp đơn giản liên kết (ISSR), từ đó thiết lập ma trận tương đồng di truyền và cây phân loại phả hệ.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khóa luận áp dụng hệ thống phân loại thực vật học của Tanaka (chia chi Citrus thành 160–162 loài với 10 nhóm quan trọng trong nhóm True Citrus) kết hợp với các tài liệu phân loại của Swingle. Nghiên cứu tiếp cận đánh giá biến dị di truyền ở mức độ phân tử thông qua hai loại chỉ thị DNA ngẫu nhiên:
- Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA): Dựa trên phản ứng PCR sử dụng các đoạn mồi ngắn ngẫu nhiên (10 nucleotide) với tỷ lệ G/C tối thiểu 40% và nhiệt độ bắt mồi từ 32°C đến 34°C, khuếch đại các đoạn DNA không đòi hỏi biết trước thông tin hệ gen.
- Chỉ thị ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat): Khuếch đại vùng DNA nằm giữa hai chuỗi vi vệ tinh (microsatellite) ngược chiều, sử dụng các mồi dài hơn có chuỗi lặp đơn giản neo ở đầu 3' hoặc 5', cho độ lặp lại và lượng thông tin di truyền cao.
| Thông số / Hạng mục |
Quy cách & Phương pháp thực hiện trong nghiên cứu |
| Quy trình tách chiết DNA |
Phương pháp CTAB của Doyle & Doyle (1987) có hiệu chỉnh (nghiền mẫu lá với đệm CTAB, ủ 65°C trong 30 phút, chiết bằng CIAA, tủa bằng Isopropanol và NaOAc ở -20°C, rửa bằng ethanol 70%, hòa tan trong đệm TE 1X). |
| Kiểm tra chất lượng DNA |
Điện di trên gel agarose 1,0%; đo quang phổ hấp thụ UV ở bước sóng 260 nm và 280 nm để tính nồng độ ($OD_{260} \times 50 \times \text{hệ số pha loãng}$) và tỷ lệ tinh sạch ($OD_{260}/OD_{280}$). |
| Hệ thống mồi phân tích |
Gồm 13 mồi (10 mồi RAPD: OPT-01, OPA-04, OPO-04, OPA-08, OPC-08, OPM-13, OPG-16, OPG-17, OPB-18, OPQ-18; 3 mồi ISSR: T1, T2, T3) thiết kế theo Oliveira et al. (2010), tổng hợp bởi Macrogen (Hàn Quốc). |
| Hỗn hợp phản ứng PCR (50 µl) |
5,0 µl Buffer 10X; 3,0 µl $\text{MgCl}_2$ (25 mM); 3,5 µl dNTPs (2,5 mM); 2,0 µl Primer (10 µM); 0,4 µl Taq DNA polymerase (5 U/µl); 5,0 µl DNA khuôn; 31,1 µl $\text{H}_2\text{O}$. |
| Chu trình nhiệt PCR |
Biến tính ban đầu ở 94°C (5 phút); 40 chu kỳ gồm: biến tính 94°C (30 giây), gắn mồi 35–40°C (30 giây), kéo dài 72°C (1,0 phút); kéo dài cuối ở 72°C (3 phút); bảo quản 4°C. |
| Phân tích sản phẩm PCR |
Điện di trên gel agarose 2,0% trong đệm TAE 1X ở hiệu điện thế 100 V, 100 mA trong 30–35 phút; nhuộm ethidium bromide 15 phút; chụp ảnh bằng hệ thống Kodak Gel Logic 1500. |
| Xử lý số liệu nhị phân |
Mã hóa băng DNA theo dạng nhị phân (1: có băng, 0: không có băng); tính ma trận hệ số tương đồng di truyền và vẽ cây phát sinh chủng loài theo thuật toán UPGMA bằng phần mềm NTSYSpc phiên bản 2.1. |
Nội dung chính theo từng chương
Phần 1: Mở đầu
Trình bày cơ sở khoa học và thực tiễn về giá trị kinh tế, dược liệu của cây cam và sự suy thoái của giống cam đặc sản Bố Hạ tại Bắc Giang. Đặt ra nhiệm vụ phân tích nguồn gen phục vụ chương trình bảo tồn và phục hồi giống. Xác định rõ mục tiêu tổng quát, 3 mục tiêu cụ thể cùng ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài trong công tác chọn tạo và bảo tồn giống cây ăn quả có múi.
Phần 2: Tổng quan tài liệu
- Khái quát về cây cam, quýt: Nguồn gốc lịch sử từ châu Á/Trung Quốc/Ấn Độ; phân loại thực vật học; bảng thành phần dinh dưỡng trong 100g cam tươi (nước 88,8g, năng lượng 38 KJ, Glucid 8,3g, Canxi 34mg, Vitamin C 40mg...). Thống kê số liệu sản xuất cam toàn cầu (đạt 80 triệu tấn/năm, Brazil đứng đầu với 16 triệu tấn mùa vụ 2018/19) và số liệu sản xuất tại Việt Nam theo Tổng cục Thống kê (năm 2017 diện tích đạt 97,5 nghìn ha, sản lượng đạt 799,5 nghìn tấn).
- Chỉ thị phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền: Tổng quan cấu trúc và cơ chế các kỹ thuật RAPD, ISSR, AFLP, RAMP, SSLP; đánh giá ưu thế và hạn chế của từng phương pháp.
- Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước: Tổng hợp các công trình nghiên cứu đa dạng di truyền chi Citrus trên thế giới (Abkenar et al., 2003 tại Nhật Bản; Dehesdtani et al., 2007 tại Iran; Martasari et al., 2012 tại Indonesia; Naz et al., 2014 tại Pakistan; Lamine et al., 2015 tại Tunisia) và các nghiên cứu tại Việt Nam (Vũ Văn Hiếu et al., 2015 trên cam sành Hà Giang; Nguyễn Hữu Hiệp et al., 2004 tại Kiên Giang; nghiên cứu trên cây trà hoa vàng, dó bầu, khoai môn sọ).
Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Thống kê chi tiết danh mục 32 mẫu nghiên cứu với ký hiệu mẫu và nguồn gốc thu thập. Liệt kê trình tự nucleotide và nhiệt độ nóng chảy ($T_m$) của 13 đoạn mồi sử dụng. Cung cấp danh mục thiết bị, hóa chất thí nghiệm tinh khiết và mô tả chi tiết quy trình 9 bước tách chiết DNA bằng dung dịch đệm CTAB, quy trình chạy PCR, kỹ thuật điện di gel agarose kiểm tra độ tinh sạch và cách mã hóa ma trận dữ liệu nhị phân trên phần mềm NTSYSpc 2.1.
| STT |
Ký hiệu mẫu |
Tên mẫu |
Địa điểm thu thập |
| 1 |
A |
Cam sành Bố Hạ số 1 |
Huyện Yên Thế, Tỉnh Bắc Giang |
| 2 |
B |
Cam sành Bố Hạ số 2 |
Huyện Yên Thế, Tỉnh Bắc Giang |
| 3 |
C |
Cam sành Bố Hạ số 5 |
Huyện Yên Thế, Tỉnh Bắc Giang |
| 4 |
CBH |
Cam chanh Bố Hạ |
Huyện Yên Thế, Tỉnh Bắc Giang |
| 5–12 |
QS, V2, CH, CV, CC, BH, QN, QO |
Quýt sen, Cam V2, Chấp, Cam Vinh, Cam chanh, Cam chín sớm ít hạt BH, Quýt ngọt, Quýt Ôn Châu |
Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên |
| 13–20 |
CP, NA, C36, CN, CS, C2, HG, Cr |
Cam Xã Đoài-Cao Phong, Cam Xã Đoài-Nghệ An, Cam C36, Chín muộn V2 (V2-1), Chín sớm, Cam canh, Cam sành Hà Giang, Cam ruột đỏ cara |
Viện Nghiên cứu Rau Quả Trung Ương |
| 21–32 |
S2-1, S3-1, S14-2, S12-2, S13-3, S1-5, S20-3, S4-4, S9-2, S17-2, S19-3, CS1-1 |
Các dòng Cam Sành Hàm Yên (So2-1 đến So19-3) và Cam sành CS 1-1 |
Trung tâm Cây ăn quả Hàm Yên, Tuyên Quang (lưu giữ tại ĐH Nông Lâm Thái Nguyên) |
Phần 4: Kết quả nghiên cứu và thảo luận
- Đánh giá DNA tổng số: Điện di kiểm tra trên gel agarose 1,0% cho thấy các vệt băng DNA sáng rõ, gọn, không có băng phụ hay hiện tượng đứt gãy, đạt tiêu chuẩn thực hiện phản ứng PCR.
- Phân tích sản phẩm PCR với 13 mồi: 10 mồi RAPD và 3 mồi ISSR đều khuếch đại thành công các phân đoạn DNA với mức độ đa hình rõ rệt:
- ISSR-T1: 4 phân đoạn (500–1000 bp; phân đoạn 500 bp xuất hiện ở toàn bộ 32 mẫu, phân đoạn 750 bp có ở 21 mẫu, 1000 bp ở 19 mẫu, 1500 bp ở 3 mẫu).
- ISSR-T2: 6 phân đoạn (250–1500 bp; phân đoạn 700 bp có ở 22 mẫu, 750 bp có ở 21 mẫu).
- ISSR-T3: 12 phân đoạn (300–2200 bp; phân đoạn 1000 bp xuất hiện ở 11 mẫu, 500 bp ở 10 mẫu).
- OPT-01: 11 phân đoạn (250–2000 bp; phân đoạn 650 bp xuất hiện ở 9 mẫu, 900 bp ở 7 mẫu).
- OPM-13: 11 phân đoạn (250–1600 bp; phân đoạn 250 bp xuất hiện ở 15 mẫu, 450 bp ở 12 mẫu).
- OPG-17: 12 phân đoạn (250–3000 bp; phân đoạn 500 bp xuất hiện ở toàn bộ 32 mẫu, 250 bp ở 30 mẫu).
- OPQ-18: 11 phân đoạn (250–1500 bp; các phân đoạn 1500 bp, 1300 bp và 1000 bp cùng xuất hiện ở 17 mẫu).
- OPA-08: 10 phân đoạn (250–1500 bp; phân đoạn 1000 bp có ở 22 mẫu, 750 bp ở 15 mẫu).
- OPB-18: 14 phân đoạn (250–3000 bp; phân đoạn 1500 bp xuất hiện ở 17 mẫu, 1200 bp ở 15 mẫu).
- OPA-04: 13 phân đoạn (250–2000 bp; phân đoạn 750 bp có ở 19 mẫu, 500 bp ở 17 mẫu).
- OPC-08: 12 phân đoạn (250–3000 bp; phân đoạn 1000 bp có ở 13 mẫu, 1500 bp ở 11 mẫu).
- OPO-04: 12 phân đoạn (250–3000 bp; phân đoạn 750 bp xuất hiện ở 11 mẫu, 1500 bp ở 10 mẫu).
- OPG-16: 13 phân đoạn (250–3000 bp; phân đoạn 750 bp và 500 bp cùng xuất hiện ở 21 mẫu).
- Phân tích quan hệ di truyền: Hệ số tương đồng di truyền giữa 32 mẫu dao động từ 0,64 đến 1,00. Cây phân loại chia 32 mẫu thành 2 nhóm chính:
- Nhóm I: Gồm 1 mẫu đối chứng Chấp (CH), đứng tách biệt với khoảng cách di truyền so với Nhóm II là 0,36.
- Nhóm II: Gồm 31 mẫu còn lại, phân nhánh thành 2 nhóm phụ:
- Nhóm phụ I (14 mẫu): Gồm Cụm 1 (các mẫu quýt QS, QO, QN; các giống cam C36, CS, V2, V2-1, CP, NA và các dòng cam sành Hàm Yên) và Cụm 2 (gồm 2 mẫu cam không hạt BH và Cr có độ tương đồng 0,85).
- Nhóm phụ II (8 mẫu): Gồm Cụm 3 (các mẫu cam sành Bố Hạ A, B, C; cam chanh Bố Hạ CBH; CS1-1; cam Vinh CV; cam chanh CC) và Cụm 4 (mẫu C2).
Phần 5: Kết luận và kiến nghị
Tổng kết kết quả thực hiện đề tài về chất lượng tách chiết DNA, tỷ lệ đa hình qua các mồi RAPD/ISSR và cấu trúc phân cụm phả hệ. Đưa ra kiến nghị ứng dụng thêm các chỉ thị đồng trội (SSR, RFLP) để nâng cao độ chính xác trong các nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả và đóng góp
Kết quả chính và số liệu phân tích di truyền
Khóa luận đã định lượng cụ thể mối quan hệ di truyền giữa các dòng/giống cam, quýt thông qua ma trận tương đồng di truyền:
| Nhóm / Cụm phân loại |
Các mẫu đại diện |
Hệ số tương đồng di truyền ($r$) |
| Nhóm I (Mẫu đối chứng ngoài) |
Chấp (CH) |
Sai khác di truyền 0,36 so với Nhóm II |
| Nhóm phụ I - Cụm 1a-1 |
Quýt sen (QS), Quýt Ôn Châu (QO), Quýt ngọt (QN) |
QS và QO đạt 0,94; QN với 2 mẫu quýt đạt 0,80 |
| Nhóm phụ I - Cụm 1a-2 |
Cam V2, Chín muộn V2 (CN/V2-1), C36, Chín sớm (CS), Cam Xã Đoài (CP, NA) |
V2 và V2-1 đạt 1,00; C36 và CS đạt 0,93; CP và NA đạt 0,88 |
| Nhóm phụ I - Cụm 1b |
Các dòng Cam sành Hàm Yên (So2-1 đến So19-3) |
Cụm 1b-1 tương đồng 0,79 với cụm 1b-2 |
| Nhóm phụ I - Cụm 2 |
Cam ít hạt BH, Cam ruột đỏ cara (Cr) |
BH và Cr đạt 0,85; BH với (CS, C36) đạt 0,845 |
| Nhóm phụ II - Cụm 3 |
Cam sành Bố Hạ (A, B, C), Cam chanh Bố Hạ (CBH), CS1-1, Cam Vinh (CV), Cam chanh (CC) |
A và B đạt 0,90; CV và CC đạt 0,90; CS1-1 với (A, B) đạt 0,84; CBH với (CV, CC) đạt 0,83 |
| Mối quan hệ cam Bố Hạ |
Cam chanh Bố Hạ (CBH) và Cam sành Hàm Yên |
Đạt 0,75 (thuộc hai nhánh nhưng có quan hệ gần) |
Đóng góp của đề tài
- Đóng góp khoa học: Cung cấp dẫn liệu thực nghiệm về mức độ đa hình phân tử của 32 nguồn gen cam, quýt tại Việt Nam thông qua hệ thống 13 chỉ thị phân tử (10 RAPD, 3 ISSR); chứng minh hai mẫu cam V2 và V2-1 có hệ số tương đồng di truyền tuyệt đối ($r = 1,00$), xác định tính tương đồng cao ($r = 0,83$) giữa cam chanh Bố Hạ với cam Vinh và cam chanh trồng tại Thái Nguyên.
- Đóng góp thực tiễn: Cung cấp cơ sở khoa học phục vụ công tác giám định, bảo tồn và phục tráng nguồn gen cam Bố Hạ tại tỉnh Bắc Giang; bổ sung tài liệu phục vụ giảng dạy và nghiên cứu chuyên ngành Công nghệ sinh học và Cây có múi.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
- Hạn chế: Nghiên cứu sử dụng hai loại chỉ thị phân tử RAPD và ISSR. Đây là các chỉ thị trội (dominant markers), không có khả năng phân biệt cá thể ở trạng thái đồng hợp tử và dị hợp tử tại locus nghiên cứu. Ngoài ra, chỉ thị RAPD sử dụng các đoạn mồi ngắn ngẫu nhiên và nhiệt độ bắt mồi thấp nên tính lặp lại của kết quả có thể bị ảnh hưởng bởi điều kiện phản ứng.
- Hướng nghiên cứu tiếp: Khóa luận kiến nghị tiếp tục kết hợp các kỹ thuật chỉ thị phân tử đồng trội có độ đặc hiệu và độ tin cậy cao hơn như SSR (Simple Sequence Repeat) và RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) nhằm đối soát và xác định chính xác hơn mối quan hệ di truyền của các giống cam.
Giá trị tham khảo
- Đối tượng tham khảo: Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các ngành Công nghệ sinh học, Nông học, Khoa học cây trồng, Di truyền và Chọn giống thực vật.
- Nội dung có giá trị ứng dụng:
- Quy trình 9 bước tách chiết DNA tổng số từ lá cây có múi nhiều hợp chất thứ sinh bằng phương pháp đệm CTAB cải tiến.
- Danh mục trình tự mồi và chu trình nhiệt PCR chuẩn hóa cho 10 mồi RAPD và 3 mồi ISSR trên chi Citrus.
- Bộ dữ liệu ma trận nhị phân và hệ số tương đồng di truyền của 32 mẫu cam, quýt phục vụ tra cứu phả hệ trong công tác chọn giống và bảo tồn nguồn gen.
Câu hỏi thường gặp
1. Nghiên cứu đã sử dụng những loại chỉ thị phân tử nào và tổng số bao nhiêu mồi?
Nghiên cứu sử dụng kết hợp 2 loại chỉ thị phân tử dựa trên PCR là RAPD và ISSR, với tổng cộng 13 mồi (gồm 10 mồi RAPD: OPT-01, OPA-04, OPO-04, OPA-08, OPC-08, OPM-13, OPG-16, OPG-17, OPB-18, OPQ-18 và 3 mồi ISSR: T1, T2, T3).
2. Mẫu Chấp (CH) có vai trò gì và phân bố ở đâu trên cây phát sinh chủng loài?
Mẫu Chấp (CH) được sử dụng làm mẫu đối chứng ngoài (outgroup). Trên cây phát sinh chủng loài, mẫu CH nằm riêng biệt hoàn toàn ở Nhóm I, có khoảng cách sai khác di truyền là 0,36 so với 31 mẫu còn lại thuộc Nhóm II.
3. Mối quan hệ di truyền giữa cam chanh Bố Hạ và các giống cam khác được xác định như thế nào?
Cam chanh Bố Hạ (CBH) thuộc Nhóm phụ II, có hệ số tương đồng di truyền cao ($r = 0,83$) với cam Vinh (CV) và cam Chanh (CC) trồng tại Thái Nguyên, cho thấy chúng có xuất xứ gần nhau hoặc có quan hệ lai tạo. Đồng thời, cam chanh Bố Hạ có hệ số tương đồng 0,75 với các dòng cam sành Hàm Yên (Tuyên Quang).
4. Kết quả phân tích phân tử cho thấy mối liên hệ gì giữa mẫu cam V2 và mẫu chín muộn V2 (V2-1/CN)?
Hai mẫu cam V2 và Chín muộn V2 (V2-1) có hệ số tương đồng di truyền đạt mức tối đa ($r = 1,00$), chứng minh hai mẫu nghiên cứu này có cùng kiểu gen ở các locus chỉ thị khảo sát.
5. Tác giả đề xuất kỹ thuật phân tử nào để mở rộng nghiên cứu trong tương lai?
Tác giả đề xuất ứng dụng bổ sung các kỹ thuật chỉ thị phân tử đồng trội như SSR (Simple Sequence Repeat) và RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) nhằm đạt độ tin cậy và độ lặp lại cao hơn trong việc xác định quan hệ di truyền.
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Thái Thùy đã hoàn thành việc tách chiết DNA tổng số và đánh giá đa dạng di truyền của 32 mẫu cam, quýt thông qua 10 mồi RAPD và 3 mồi ISSR. Dữ liệu thực nghiệm xác định hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,64 đến 1,00, phân chia tập đoàn mẫu thành hai nhóm chính với vị trí phân loại rõ rệt giữa mẫu đối chứng Chấp và các nhóm giống cam, quýt thương phẩm. Kết quả nghiên cứu làm rõ mối quan hệ di truyền gần gũi giữa cam Bố Hạ với cam Vinh và cam sành Hàm Yên, cung cấp cơ sở khoa học trực tiếp phục vụ công tác bảo tồn và phục hồi nguồn gen cam Bố Hạ tại tỉnh Bắc Giang.
