Lý do chọn đề tài Ciguatera (CFP) là dạng ngộ độc thực phẩm biển (NĐTPB) do ăn phải các loài cá rạn san hô vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt chứa độc tố ciguatoxin (CTX) và các dẫn xuất độc tố này. Độc tố CTXs được sản sinh ra do một loài vi tảo sống đáy là Gambierdiscus toxicus và được tích lũy qua chuỗi thức ăn biển. Đến nay đã phát hiện hơn 400 loài cá rạn có nguy cơ ngộ độc CFP. Mặc dù tỉ lệ tử vong thấp (0,1%), nhưng CFP hiện nay là một trong những mối lo ngại lớn của thế giới về mặt an toàn thực phẩm (ATTP), do độc tố có hiệu ứng dài hạn (vài tháng cho đến cả năm), là gánh nặng đối với dịch vụ y tế, chăm sóc sức khoẻ cộng đồng.
CFP cũng gây nên tâm lý hoang mang, bất ổn cho người tiêu dùng, dẫn đến thiệt hại về kinh tế đối với ngành công nghiệp thuỷ hải sản nội địa và xuất khẩu của nhiều quốc gia. Trước đây, tình trạng ngộ độc CFP chỉ xảy ra ở Nam Thái bình dương, Caribbe và Ấn Độ, nhưng đến nay đã lan khắp châu Á, châu Âu và Bắc Mỹ. Ở Mỹ, từ thập niên 1970 đến nay, các vụ ngộ độc CFP đã tăng gấp 5 lần lên hơn 250 vụ mỗi năm. Trong khi đó, do nhập khẩu phần lớn hải sản, Hồng Kông mỗi năm xảy ra hàng trăm vụ ngộ độc CFP so với mức chưa đến 10 vụ vào những năm 1980.
Tỷ lệ mắc và phân bố CFP trên thế giới ngày càng gia tăng, theo thống kê của FAO, hàng năm có khoảng 20,000 - 30,000 vụ ngộ độc CFP được ghi nhận, phần lớn tập trung tại các vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, theo thông tin từ y tế địa phương, từ 2007 đến nay, hàng năm đều ghi nhận được rải rác các vụ ngộ độc nghi ngờ CFP, xảy ra chủ yếu ở các vùng ven biển Quảng Ngãi, Ninh Thuận, Bình Thuận,… Năm 2012, hội thảo ATTP của EU đã báo cáo ghi nhận độc tố nghi ngờ CTXs trong cá Hồng nguồn gốc Việt Nam. Đến tháng 5/2017, EU chính thức cảnh báo về ATTP đối với mặt hàng cá Hồng xuất khẩu của Việt Nam. 4 Dù được rất nhiều sự quan tâm, hướng nghiên cứu về độc tố CTXs của thế giới vấp phải trở ngại lớn về phương pháp cũng như nguồn chất chuẩn rất quý hiếm.
CTXs là những hợp chất polyete tan trong các dung môi hữu cơ, bền nhiệt (nhiệt độ cao và đóng băng) và bền pH (axit hay kiềm), không nhạy với ánh sáng tia cực tím, nên không thể phân biệt bằng trực quan. Gần đây, nhóm nhà khoa học Nhật Bản đã công bố về kết quả phát triển phương pháp mới phân tích độc tố CTXs trong mẫu thịt cá sử dụng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ kép (LC/MS-MS). Tuy nhiên đến nay vẫn chưa có công bố về công trình nghiên cứu độc tố này tại Đông Nam Á, gây khó khăn trong việc giám sát và cảnh báo vấn đề ATTP. Hơn nữa, quá trình nghiên cứu CFP tại Việt Nam gặp nhiều khó khăn như về đặc tính sinh học loài, nguồn gốc, cơ chế tích lũy và lan truyền độc tố trong chuỗi thức ăn biển rất phức tạp, đặc biệt là chưa có phương pháp phân tích phù hợp do thiếu trang thiết bị phân tích hiện đại chuyên sâu và chưa tiếp cận, cập nhật phương pháp phân tích của thế giới.
Hiện nay, Viện Hải dương học đã xây dựng được quy trình phân tích độc tố trong cá Hồng nhưng chưa có quy trình phân tích đối với loài Chình biển, vì vậy, học viên chọn đề tài luận văn “Xây dựng quy trình thực nghiệm phân tích độc tố Ciguatoxins trong Chình biển bằng phương pháp sắc ký lỏng đầu dò khối phổ kép (LC/MS-MS)”. Nội dung phân tích độc tố CTXs trong đề tài này sẽ sử dụng quy trình phân tích độc tố CTXs cập nhật mới nhất của Nhật Bản. Tuy nhiên, quy trình thực nghiệm trên cần được hiệu chỉnh phù hợp với điều kiện hệ thiết bị hiện có của Việt Nam cũng như thành phần hoá sinh của Chình biển để đảm bảo độ tin cậy và tính chính xác của kết quả phân tích. Mục tiêu nghiên cứu - Dựa trên quy trình phân tích Ciguatoxins của Nhật Bản, tiến hành hiệu chỉnh để xây dựng được một quy trình thực nghiệm vừa phù hợp với điều kiện trang thiết bị tại Việt Nam vừa phù hợp với thành phần hóa sinh của Chình biển để đảm bảo độ tin cậy và tính chính xác của kết quả phân tích.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 3. Đối tượng nghiên cứu - 14 cá thể cá Chình, thuộc 4 loài Chình biển (cá Lịch vân vòng, cá Lịch vân sóng, cá Lịch chấm tia, cá Lịch mõm trắng) được thu mua tại đảo Lý Sơn (Quảng Ngãi), mỗi cá thể tách lấy 2 phần cơ và gan. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp chiết rút: dung môi Acetone được lựa chọn để hòa tan chất phân tích, tách chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu. - Phương pháp tinh sạch: thử nghiệm các điều kiện tinh sạch theo phương pháp chiết lỏng – lỏng và phương pháp chiết ly pha rắn SPE.
- Xác định độc tố CTX: phương pháp sắc ký lỏng khối phổ kép (LC/MS-MS). - Xử lý số liệu thực nghiệm, đánh giá hiệu quả của quy trình thực nghiệm bằng phương pháp thống kê F-test, T-test trong phần mềm Excel. Nội dung nghiên cứu - Chiết tách và tinh sạch độc tố CTX từ một số bộ phận của Chình biển (cơ, gan). - Lựa chọn pha tĩnh tối ưu để xác định độc tố CTX trong mẫu đã chiết bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ kép (LC/MS-MS).
- Xây dựng quy trình thực nghiệm phân tích độc tố CTX bằng phương pháp LC/MS-MS. - Đánh giá kết quả của quy trình thực nghiệm trên cơ sở so sánh, đối chiếu với kết quả kiểm chứng tại PTN của Nhật Bản. Ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu Trên cơ sở vận dụng những tiến bộ khoa học - kỹ thuật và công nghệ mới của thế giới, đây là hướng nghiên cứu mới, tiên phong tại Việt Nam. Mặt khác, kết quả của đề tài là dẫn liệu khoa học tin cậy phục vụ an toàn thực phẩm biển, và là tiền đề cần thiết để có những công trình công bố quốc tế về độc tố CTX trong sinh vật biển tại Việt Nam.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu Trước những năm 2010, kỹ thuật sắc ký lỏng đầu dò khối phổ đơn (single LC/MS) sử dụng chế độ quét ion chọn lọc (SIM) được áp dụng để phát hiện độc tố này. Sau đó, cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, sắc ký lỏng khối phổ sử dụng nguồn ion hóa phun mù điện tử (Electrospray ionization – ESI) được ứng dụng để định lượng độc tố CTXs với nguyên lý chọn lọc phân tử được proton hóa [M+NH4]+ hoặc [M+H]+ để cắt các phân tử nước trong bộ lọc khối tứ cực thứ 2 (Q2) của chế độ ghi phổ nhiều ion chọn lọc (Multi Reaction Monitoring, MRM). Tuy nhiên, các ion sau khi mất đi phân tử nước lại không đủ độ nhạy để phát hiện được ở nồng độ tương đương 0,01 ppb CTX-1B (giới hạn ATTP của US FDA). Khắc phục nhược điểm này, nhóm nghiên cứu của Yogi đã phát triển thành công phương pháp sử dụng LC/MS-MS với chế độ SIM và MRM có độ nhạy cao hơn, sử dụng cách bắt cặp phân tử CTX với một số ion dương hoặc âm (H+, Na+, K+, NH4-, SO42-, OH-…).
Phương pháp này được đánh giá có ưu thế về độ nhạy và tính ứng dụng trong phân tích định lượng độc tố CTXs, mặc dù đầu dò khối phổ độ phân giải cao (HRMS) ghép nối với hệ sắc ký đã được chứng minh được khả năng phát hiện các đồng phân của độc tố CTXs trong điều kiện thiếu vắng chất chuẩn. Tuy nhiên, tuỳ thuộc vào thông số kỹ thuật của từng hệ thống thiết bị LC/MS-MS, đòi hỏi quá trình thăm dò, thử nghiệm nhằm tối ưu hoá quy trình phân tích bao gồm công đoạn tách chiết, loại tạp chất trong mẫu, điều kiện phản ứng (nhiệt độ, áp suất…) và hệ dung môi pha động (đẳng dòng hay đổi dòng), cột sắc ký… phù hợp để có được LOD và LOQ tốt nhất đối với phân tích độc tố CTXs. Báo cáo này trình bày quy trình thực nghiệm tối ưu hoá phương pháp phân tích độc tố CTXs trong mẫu Chình biển sử dụng hệ thống sắc ký lỏng ghép nối đầu dò khối phổ kép Shimadzu LCMS 8040 tại phòng thí nghiệm trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KHCNVN về An toàn thực phẩm và môi trường (khu vực miền Trung) tại Viện Hải dương học. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
NGỘ ĐỘC CIGUATERA 1. Khái niệm Ciguatera Fish Poisoning (CFP) là một dạng ngộ độc thực phẩm biển ở người do tiêu thụ các loài cá rạn vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới đã tích lũy độc tố Ciguatoxin (CTX). Độc tố CTX được biết đến có nguồn gốc từ loài vi tảo giáp sống đáy Gambierdiscus toxicus [2]. Theo một bài báo cáo được FAO công bố năm 2004, hơn 400 loài cá được biết đến là nơi di truyền ngộ độc CFP.
Đối tượng gây ngộ độc Con người đều được cho là nhạy cảm với độc tố CTX [3]. Dân cư ở các vùng biển nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới có khả năng ảnh hưởng cao nhất do tần suất cao tiêu thụ các loài cá độc. Tuy nhiên, sự gia tăng mức tiêu thụ sản phẩm thủy sản cùng với sự gia tăng giao thông liên khu vực của các sản phẩm thủy sản đã mở rộng phạm vi địa lý của các vụ ngộ độc CFP [3]. Triệu chứng lâm sàng “Ciguatera” là một hội chứng lâm sàng với chuẩn đoán chủ yếu vẫn dựa trên tiền sử tiêu thụ cá rạn san hô và biểu hiện lâm sàng được xác định bởi cả triệu chứng tiêu hóa và thần kinh [2].
Sự khác biệt về địa lý cũng sẽ gây ra sự khác biệt về triệu chứng của các bệnh nhân. Khởi phát của triệu chứng CFP thường bắt đầu bằng các vấn đề của đường tiêu hóa như buồn nôn, nôn, tiêu chảy và đau bụng trong vòng 12 giờ sau khi ăn phải cá có độc tố. Các triệu chứng thường thuyên giảm trong vòng 24 giờ [2]. Các vấn đề về tim mạch cũng có thể xuất hiện trong suốt giai đoạn cấp tính này, thường là nhịp tim chậm và hạ huyết áp.
Từ vài giờ đến hai tuần sau khi ngộ độc cá ciguatera, những vấn đề về thần kinh như đau đầu, đau cơ, dị cảm (tê và ngứa ran ở vùng ngoại vi và tứ chi), rối loạn cảm giác nhiệt độ (sự đảo ngược cảm giác nhiệt độ với các vật 8 thể lạnh sẽ cảm thấy nóng và ngược lại),… có thể xuất hiện [2].