Phân Tích Cộng Đồng Vi Khuẩn Phân Hủy Rơm Rạ Bằng PCR-DGGE Và Tạo Dòng

LỜI CAM ĐOAN

LỜI NÓI ĐẦU

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. RƠM RẠ, THÀNH PHẦN CẤU TẠO VÀ GIÁ TRỊ KINH TẾ

1.2. HỆ ENZYME CELLULASE VÀ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI RƠM

1.2.1. Hệ Enzyme cellulase và cơ chế phân giải cellulose

1.2.2. Hệ vi sinh phân giải cellulose

1.3. KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỊNH LOÀI VI SINH

1.3.1. Các phương pháp ly trích và thu nhận DNA vi sinh vật

1.3.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử trong định danh

1.3.3. Kỹ thuật PCR trong định danh vi khuẩn

1.3.4. Kỹ thuật PCR-DGGE trong định danh vi khuẩn

1.3.5. Kỹ thuật tạo dòng

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1. Thiết bị và dụng cụ

2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phương pháp ly trích và thu nhận DNA

2.2.2. Phương pháp PCR nhân bản gene 16S rDNA và vùng gene V3

2.2.3. Phương pháp tinh sạch sản phẩm gene V3

2.2.4. Phương pháp thực hiện kỹ thuật DGGE

2.2.5. Qui trình chuẩn bị gel polyacrylamine và thực hiện DGGE

2.2.6. Quy trình thu nhận sản phẩm DGGE từ gel polyacrylamide

2.2.7. PCR gene V3 sau khi thu nhận từ DGGE với cặp mồi 357F và 517R

2.2.8. Phương pháp tạo dòng

2.2.9. Giải trình tự gene V3 và xây dựng cây phát sinh loài

2.2.10. Khảo sát sinh cellulase phương pháp đĩa CMC

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả kiểm tra nhiệt độ

3.2. Kết quả thu nhận DNA genome của vi sinh vật trong mẫu rơm

3.3. Kết quả thu nhận gene 16S rDNA và gene V3 của mẫu R

3.4. Kết quả phân tích dữ liệu cộng đồng vi khuẩn của mẫu R

3.5. Kết quả DNA, gene 16S rDNA và gene V3 mẫu Rn

3.6. Kết quả tạo dòng trên vector pGEM@-T Easy của hãng Promega

3.7. Kết quả thu nhận vùng gene V3 sau khi đã tạo dòng

3.8. Kết quả kiểm tra gene V3 sau khi tạo dòng bằng kỹ thuật DGGE

3.9. Kết quả sơ bộ định tính enzyme cellulase trong mẫu Rn

4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ

Nghiên cứu tập trung vào cộng đồng vi khuẩn tham gia vào quá trình phân hủy rơm rạ, một nguồn phế phẩm nông nghiệp dồi dào. Sử dụng kỹ thuật PCR-DGGE, nghiên cứu xác định sự đa dạng và biến động của các loài vi khuẩn trong mẫu rơm trước và sau quá trình ủ. Kết quả cho thấy sự hiện diện của nhiều loài vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose, hemicellulose và lignin, đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa rơm rạ thành các sản phẩm hữu ích.

1.1. Phân tích vi khuẩn phân hủy

Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR-DGGE để phân tích cộng đồng vi khuẩn trong rơm rạ. Kết quả cho thấy sự đa dạng của các loài vi khuẩn như Bacillus, Clostridium và Pseudomonas, những loài có khả năng sản xuất enzyme cellulase. Phương pháp này cho phép xác định các loài vi khuẩn mà không cần phân lập thuần chủng, giúp tiết kiệm thời gian và tăng hiệu quả nghiên cứu.

1.2. Ứng dụng thực tiễn

Việc phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ có ý nghĩa lớn trong việc tận dụng nguồn phế phẩm nông nghiệp. Các loài vi khuẩn được xác định có thể được ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học, phân bón hữu cơ và giảm thiểu ô nhiễm môi trường từ việc đốt rơm rạ.

II. Kỹ thuật PCR DGGE và tạo dòng

Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật PCR-DGGE để phân tích đa dạng di truyền của cộng đồng vi khuẩn. Kỹ thuật này cho phép tách các trình tự gene với độ chính xác cao, giúp xác định các loài vi khuẩn trong mẫu rơm. Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng sử dụng kỹ thuật tạo dòng để nhân bản các gene quan trọng, tạo tiền đề cho việc nghiên cứu sâu hơn về chức năng và ứng dụng của các loài vi khuẩn.

2.1. Nguyên lý PCR DGGE

Kỹ thuật PCR-DGGE dựa trên nguyên lý tách các đoạn DNA có trình tự khác nhau dựa vào độ biến tính của chúng. Phương pháp này cho phép phân tích đa dạng di truyền của cộng đồng vi khuẩn mà không cần phân lập thuần chủng, giúp tiết kiệm thời gian và tăng hiệu quả nghiên cứu.

2.2. Quy trình tạo dòng

Nghiên cứu sử dụng vector pGEM@-T Easy để tạo dòng các đoạn gene V3 của vi khuẩn. Quy trình bao gồm các bước nhân bản gene, tinh sạch sản phẩm PCR và chèn vào vector. Kết quả tạo dòng thành công mở ra hướng nghiên cứu mới về chức năng và ứng dụng của các loài vi khuẩn phân hủy rơm rạ.

III. Giá trị kinh tế và ứng dụng

Nghiên cứu không chỉ tập trung vào việc phân tích cộng đồng vi khuẩn mà còn đánh giá giá trị kinh tế của rơm rạ. Rơm rạ là nguồn nguyên liệu dồi dào có thể được tận dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học, phân bón hữu cơ và các sản phẩm khác. Việc ứng dụng các loài vi khuẩn phân hủy rơm rạ có thể giảm thiểu ô nhiễm môi trường và tạo ra nguồn thu nhập mới cho nông dân.

3.1. Sản xuất nhiên liệu sinh học

Rơm rạ chứa lượng lớn cellulose, có thể được chuyển hóa thành glucose thông qua quá trình phân hủy bởi vi khuẩn phân hủy. Glucose là nguyên liệu quan trọng để sản xuất nhiên liệu sinh học như ethanol, giúp giảm sự phụ thuộc vào nhiên liệu hóa thạch.

3.2. Giảm thiểu ô nhiễm

Việc tận dụng rơm rạ thông qua quá trình phân hủy bởi vi khuẩn có thể giảm thiểu việc đốt rơm, một nguyên nhân gây ô nhiễm không khí và ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Nghiên cứu này góp phần vào việc phát triển các giải pháp bền vững trong nông nghiệp.

Luận Văn Thạc Sĩ Sinh Học: Phân Tích Cộng Đồng Vi Khuẩn Phân Hủy Rơm Rạ Bằng Kỹ Thuật PCR-DGGE Và Tạo Dòng