Luận văn thạc sĩ sinh học phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ bằng kỹ thuật pcr dgge và tạo dòng

Luận văn thạc sĩ sinh học phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ bằng kỹ thuật PCR-DGGE và tạo dòng, nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại.

• Tác giả: Ngô Đức Duy
• Người hướng dẫn: TS Hoàng Quốc Khánh
• Trường học: Học Viện Khoa Học Và Công Nghệ
• Chuyên ngành: Sinh Học Thực Nghiệm
• Đề tài: Phân Tích Cộng Đồng Vi Khuẩn Phân Hủy Rơm Rạ Bằng PCR-DGGE Và Tạo Dòng
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI NÓI ĐẦU
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. RƠM RẠ, THÀNH PHẦN CẤU TẠO VÀ GIÁ TRỊ KINH TẾ
• 1.2. HỆ ENZYME CELLULASE VÀ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI RƠM
• 1.2.1. Hệ Enzyme cellulase và cơ chế phân giải cellulose
• 1.2.2. Hệ vi sinh phân giải cellulose
• 1.3. KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỊNH LOÀI VI SINH
• 1.3.1. Các phương pháp ly trích và thu nhận DNA vi sinh vật
• 1.3.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử trong định danh
• 1.3.3. Kỹ thuật PCR trong định danh vi khuẩn
• 1.3.4. Kỹ thuật PCR-DGGE trong định danh vi khuẩn
• 1.3.5. Kỹ thuật tạo dòng
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
• 2.1.1. Thiết bị và dụng cụ
• 2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Phương pháp ly trích và thu nhận DNA
• 2.2.2. Phương pháp PCR nhân bản gene 16S rDNA và vùng gene V3
• 2.2.3. Phương pháp tinh sạch sản phẩm gene V3
• 2.2.4. Phương pháp thực hiện kỹ thuật DGGE
• 2.2.5. Qui trình chuẩn bị gel polyacrylamine và thực hiện DGGE
• 2.2.6. Quy trình thu nhận sản phẩm DGGE từ gel polyacrylamide
• 2.2.7. PCR gene V3 sau khi thu nhận từ DGGE với cặp mồi 357F và 517R
• 2.2.8. Phương pháp tạo dòng
• 2.2.9. Giải trình tự gene V3 và xây dựng cây phát sinh loài
• 2.2.10. Khảo sát sinh cellulase phương pháp đĩa CMC
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả kiểm tra nhiệt độ
• 3.2. Kết quả thu nhận DNA genome của vi sinh vật trong mẫu rơm
• 3.3. Kết quả thu nhận gene 16S rDNA và gene V3 của mẫu R
• 3.4. Kết quả phân tích dữ liệu cộng đồng vi khuẩn của mẫu R
• 3.5. Kết quả DNA, gene 16S rDNA và gene V3 mẫu Rn
• 3.6. Kết quả tạo dòng trên vector pGEM@-T Easy của hãng Promega
• 3.7. Kết quả thu nhận vùng gene V3 sau khi đã tạo dòng
• 3.8. Kết quả kiểm tra gene V3 sau khi tạo dòng bằng kỹ thuật DGGE
• 3.9. Kết quả sơ bộ định tính enzyme cellulase trong mẫu Rn
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ

Nghiên cứu tập trung vào cộng đồng vi khuẩn tham gia vào quá trình phân hủy rơm rạ, một nguồn phế phẩm nông nghiệp dồi dào. Sử dụng kỹ thuật PCR-DGGE, nghiên cứu xác định sự đa dạng và biến động của các loài vi khuẩn trong mẫu rơm trước và sau quá trình ủ. Kết quả cho thấy sự hiện diện của nhiều loài vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose, hemicellulose và lignin, đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa rơm rạ thành các sản phẩm hữu ích.

1.1. Phân tích vi khuẩn phân hủy

Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR-DGGE để phân tích cộng đồng vi khuẩn trong rơm rạ. Kết quả cho thấy sự đa dạng của các loài vi khuẩn như Bacillus, Clostridium và Pseudomonas, những loài có khả năng sản xuất enzyme cellulase. Phương pháp này cho phép xác định các loài vi khuẩn mà không cần phân lập thuần chủng, giúp tiết kiệm thời gian và tăng hiệu quả nghiên cứu.

1.2. Ứng dụng thực tiễn

Việc phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ có ý nghĩa lớn trong việc tận dụng nguồn phế phẩm nông nghiệp. Các loài vi khuẩn được xác định có thể được ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học, phân bón hữu cơ và giảm thiểu ô nhiễm môi trường từ việc đốt rơm rạ.

II. Kỹ thuật PCR DGGE và tạo dòng

Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật PCR-DGGE để phân tích đa dạng di truyền của cộng đồng vi khuẩn. Kỹ thuật này cho phép tách các trình tự gene với độ chính xác cao, giúp xác định các loài vi khuẩn trong mẫu rơm. Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng sử dụng kỹ thuật tạo dòng để nhân bản các gene quan trọng, tạo tiền đề cho việc nghiên cứu sâu hơn về chức năng và ứng dụng của các loài vi khuẩn.

2.1. Nguyên lý PCR DGGE

Kỹ thuật PCR-DGGE dựa trên nguyên lý tách các đoạn DNA có trình tự khác nhau dựa vào độ biến tính của chúng. Phương pháp này cho phép phân tích đa dạng di truyền của cộng đồng vi khuẩn mà không cần phân lập thuần chủng, giúp tiết kiệm thời gian và tăng hiệu quả nghiên cứu.

2.2. Quy trình tạo dòng

Nghiên cứu sử dụng vector pGEM@-T Easy để tạo dòng các đoạn gene V3 của vi khuẩn. Quy trình bao gồm các bước nhân bản gene, tinh sạch sản phẩm PCR và chèn vào vector. Kết quả tạo dòng thành công mở ra hướng nghiên cứu mới về chức năng và ứng dụng của các loài vi khuẩn phân hủy rơm rạ.

III. Giá trị kinh tế và ứng dụng

Nghiên cứu không chỉ tập trung vào việc phân tích cộng đồng vi khuẩn mà còn đánh giá giá trị kinh tế của rơm rạ. Rơm rạ là nguồn nguyên liệu dồi dào có thể được tận dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học, phân bón hữu cơ và các sản phẩm khác. Việc ứng dụng các loài vi khuẩn phân hủy rơm rạ có thể giảm thiểu ô nhiễm môi trường và tạo ra nguồn thu nhập mới cho nông dân.

3.1. Sản xuất nhiên liệu sinh học

Rơm rạ chứa lượng lớn cellulose, có thể được chuyển hóa thành glucose thông qua quá trình phân hủy bởi vi khuẩn phân hủy. Glucose là nguyên liệu quan trọng để sản xuất nhiên liệu sinh học như ethanol, giúp giảm sự phụ thuộc vào nhiên liệu hóa thạch.

3.2. Giảm thiểu ô nhiễm

Việc tận dụng rơm rạ thông qua quá trình phân hủy bởi vi khuẩn có thể giảm thiểu việc đốt rơm, một nguyên nhân gây ô nhiễm không khí và ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Nghiên cứu này góp phần vào việc phát triển các giải pháp bền vững trong nông nghiệp.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Sản xuất lúa gạo toàn cầu đạt mức kỷ lục với khoảng 769,9 triệu tấn lúa trong năm 2018, tăng 10,3 triệu tấn so với năm trước, trong đó khu vực châu Á chiếm phần lớn sản lượng. Việt Nam là một trong những quốc gia xuất khẩu gạo hàng đầu, với sản lượng lúa đạt khoảng 55 triệu tấn năm 2018 và xuất khẩu 6,1 triệu tấn, mang lại giá trị kinh tế 3,06 tỷ USD. Tương ứng với sản lượng lúa, lượng rơm rạ thải ra ước tính khoảng 1,5 lần sản lượng gạo, tức khoảng 55 triệu tấn rơm rạ mỗi năm tại Việt Nam. Tuy nhiên, chỉ khoảng 20% lượng rơm rạ được sử dụng hiệu quả cho chăn nuôi, trồng nấm và phân ủ, còn lại phần lớn bị đốt hoặc bỏ lại đồng ruộng, gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng.

Rơm rạ chủ yếu cấu tạo từ cellulose (60%), lignin (14%) và các thành phần hữu cơ khác, là nguồn sinh khối tái tạo dồi dào có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học và các sản phẩm sinh học khác. Tuy nhiên, quá trình phân hủy cellulose trong rơm rạ tự nhiên diễn ra chậm do cấu trúc phức tạp và sự hiện diện của lignin bền vững. Nghiên cứu nhằm phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ bằng kỹ thuật PCR-DGGE kết hợp tạo dòng, nhằm đánh giá đa dạng vi khuẩn và khả năng sinh enzyme cellulase trong quá trình ủ rơm, từ đó làm cơ sở cho việc tuyển chọn vi khuẩn ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học.

Phạm vi nghiên cứu tập trung tại tỉnh Đồng Tháp, Việt Nam, với mẫu rơm rạ thu thập từ đồng ruộng và quá trình ủ trong vòng 18 ngày. Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển công nghệ sinh học phân tử ứng dụng trong xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp, góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường và nâng cao giá trị kinh tế của rơm rạ.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên hai lý thuyết chính: hệ enzyme cellulase và kỹ thuật sinh học phân tử PCR-DGGE. Hệ enzyme cellulase gồm ba loại enzyme ngoại bào phối hợp phân giải cellulose thành glucose: endoglucanase cắt ngẫu nhiên liên kết β-1,4 trong chuỗi cellulose, exoglucanase cắt đoạn cuối chuỗi cellulose, và β-glucosidase thủy phân cellobiose thành glucose. Sự phối hợp này quyết định hiệu quả phân hủy cellulose trong rơm rạ.

Kỹ thuật PCR-DGGE (Polymerase Chain Reaction - Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) là phương pháp sinh học phân tử hiện đại, cho phép khuếch đại và phân tách các đoạn gene 16S rDNA vùng V3 đặc trưng của vi khuẩn dựa trên sự khác biệt nucleotide, giúp xác định đa dạng cộng đồng vi khuẩn mà không cần phân lập thuần chủng. Kỹ thuật tạo dòng (cloning) được sử dụng để nhân bản các đoạn gene V3 thu nhận từ DGGE, giúp phân tích chi tiết và xây dựng cây phát sinh loài.

Các khái niệm chính bao gồm: gene 16S rDNA, vùng gene V3, enzyme cellulase, cộng đồng vi khuẩn phân hủy cellulose, và kỹ thuật PCR-DGGE.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là mẫu rơm rạ thu thập tại huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp, Việt Nam. Mẫu được lấy trước và sau quá trình ủ trong vòng 18 ngày, với nhiệt độ ủ dao động từ 18°C đến 80°C, đo tại các độ sâu khác nhau trong ụ rơm.

Phương pháp phân tích bao gồm:

• Ly trích DNA tổng số từ mẫu rơm bằng phương pháp SDS kết hợp CTAB, đảm bảo thu nhận DNA nguyên vẹn và tinh sạch.
• Khuếch đại gene 16S rDNA bằng PCR sử dụng cặp mồi 27F và 1492R, tiếp tục khuếch đại vùng gene V3 với cặp mồi 357F-GC và 517R.
• Phân tích đa dạng cộng đồng vi khuẩn bằng kỹ thuật DGGE trên gel polyacrylamide gradient biến tính từ 40% đến 60%.
• Tách và tinh sạch các đoạn gene V3 từ gel DGGE, nhân bản bằng vector pGEM®-T Easy và biến nạp vào E.coli JM109 để tạo dòng.
• Giải trình tự gene V3 và xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm BioEdit và so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI.
• Định tính enzyme cellulase bằng phương pháp đĩa CMC nhuộm Congo Red, đánh giá khả năng phân giải cellulose của vi khuẩn trong mẫu.

Cỡ mẫu DNA thu nhận từ nhiều mẫu rơm khác nhau, với các bước chọn mẫu và phân tích được thực hiện lặp lại nhằm đảm bảo tính đại diện và độ tin cậy của kết quả.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Biến động nhiệt độ trong quá trình ủ rơm: Nhiệt độ trong ụ rơm ủ dao động từ 18°C đến 80°C trong 18 ngày, với đỉnh nhiệt độ từ ngày 5 đến 11 đạt 60-80°C, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn chịu nhiệt phát triển. Nhiệt độ giảm dần sau ngày 15, phù hợp với giai đoạn phân hủy cellulose tích cực.

2. Thu nhận DNA và khuếch đại gene 16S rDNA: DNA tổng số thu được từ mẫu rơm chưa ủ có nồng độ phù hợp, sản phẩm PCR gene 16S rDNA đạt kích thước khoảng 1500 bp, vùng gene V3 khuếch đại thành công với kích thước khoảng 200 bp. Kỹ thuật DGGE lần 1 phân tách được 5 đoạn gene V3 riêng biệt, cho thấy sự đa dạng của cộng đồng vi khuẩn trong mẫu.

3. Phân tích DGGE và tạo dòng: DGGE lần 2 tách riêng từng đoạn gene V3, các đoạn này được nhân bản và giải trình tự. Kết quả xây dựng cây phát sinh loài cho thấy sự hiện diện của nhiều chủng vi khuẩn phân hủy cellulose, trong đó có các loài chịu nhiệt và có khả năng sinh enzyme cellulase.

4. Khả năng sinh enzyme cellulase: Kiểm tra định tính enzyme cellulase trên môi trường CMC cho thấy mẫu rơm ủ có khả năng phân giải cellulose rõ rệt, tạo vòng phân giải nhạt màu trên đĩa nhuộm Congo Red, chứng tỏ vi khuẩn trong mẫu có hoạt tính cellulase cao.

Thảo luận kết quả

Sự gia tăng nhiệt độ trong quá trình ủ rơm tạo điều kiện thuận lợi cho các vi khuẩn chịu nhiệt phát triển, làm thay đổi thành phần cộng đồng vi khuẩn. Kết quả DGGE cho thấy đa dạng vi khuẩn trong mẫu rơm, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về cộng đồng vi sinh vật phân hủy cellulose trong môi trường tự nhiên và ủ phân.

Việc sử dụng kỹ thuật PCR-DGGE kết hợp tạo dòng giúp phân tách và xác định chính xác các chủng vi khuẩn có mặt trong mẫu, vượt qua hạn chế của phương pháp nuôi cấy truyền thống. Các chủng vi khuẩn được xác định có tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp sinh học, đặc biệt trong sản xuất nhiên liệu sinh học từ cellulose.

Khả năng sinh enzyme cellulase được xác nhận qua phương pháp đĩa CMC, phù hợp với giả thuyết rằng vi khuẩn trong rơm ủ có thể phân giải cellulose hiệu quả. Dữ liệu này hỗ trợ cho việc tuyển chọn vi khuẩn chịu nhiệt, sinh cellulase để ứng dụng trong công nghệ xử lý rơm rạ và sản xuất biofuel.

Kết quả có thể được trình bày qua biểu đồ nhiệt độ ủ theo thời gian, hình ảnh gel DGGE với các band phân tách gene V3, cây phát sinh loài vi khuẩn và hình ảnh vòng phân giải enzyme cellulase trên đĩa CMC.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển quy trình tuyển chọn vi khuẩn chịu nhiệt và sinh cellulase: Tập trung vào các chủng vi khuẩn được xác định qua PCR-DGGE và tạo dòng, nhằm nâng cao hiệu quả phân hủy cellulose trong rơm rạ. Thời gian thực hiện trong 12-18 tháng, do các viện nghiên cứu sinh học phân tử chủ trì.

2. Ứng dụng vi khuẩn phân hủy cellulose trong sản xuất nhiên liệu sinh học: Xây dựng mô hình thử nghiệm quy mô pilot sử dụng vi khuẩn tuyển chọn để ủ rơm rạ, tăng sản lượng glucose làm nguyên liệu cho bioethanol. Thời gian triển khai 2 năm, phối hợp giữa viện nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học.

3. Xây dựng hệ thống giám sát đa dạng vi sinh vật trong quá trình ủ: Áp dụng kỹ thuật PCR-DGGE định kỳ để theo dõi biến động cộng đồng vi khuẩn, đảm bảo ổn định và hiệu quả quá trình phân hủy. Thời gian thực hiện liên tục trong quá trình vận hành mô hình.

4. Tuyên truyền và đào tạo kỹ thuật xử lý rơm rạ bằng vi sinh vật: Hướng dẫn nông dân và doanh nghiệp nông nghiệp áp dụng công nghệ sinh học phân tử trong xử lý rơm rạ, giảm thiểu đốt rơm gây ô nhiễm. Thời gian triển khai trong 1-2 năm, do các cơ quan quản lý nông nghiệp và môi trường phối hợp thực hiện.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành sinh học phân tử, vi sinh vật: Nghiên cứu cung cấp phương pháp và dữ liệu thực nghiệm về phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy cellulose bằng kỹ thuật PCR-DGGE và tạo dòng, hỗ trợ phát triển các đề tài liên quan.

2. Chuyên gia công nghệ sinh học và sản xuất nhiên liệu sinh học: Thông tin về vi khuẩn chịu nhiệt, enzyme cellulase và quy trình phân hủy cellulose trong rơm rạ giúp thiết kế quy trình sản xuất biofuel hiệu quả.

3. Cơ quan quản lý nông nghiệp và môi trường: Cơ sở khoa học để xây dựng chính sách xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp, giảm thiểu ô nhiễm môi trường do đốt rơm rạ, đồng thời thúc đẩy phát triển kinh tế tuần hoàn.

4. Doanh nghiệp chế biến nông sản và công nghệ sinh học: Áp dụng kết quả nghiên cứu để phát triển sản phẩm mới từ rơm rạ, như phân bón sinh học, enzyme cellulase thương mại, hoặc nhiên liệu sinh học, nâng cao giá trị gia tăng.

Câu hỏi thường gặp

1. PCR-DGGE là gì và tại sao được sử dụng trong nghiên cứu này?
   PCR-DGGE là kỹ thuật khuếch đại gene kết hợp điện di gel gradient biến tính, giúp phân tách các đoạn gene có sự khác biệt nucleotide nhỏ. Kỹ thuật này cho phép xác định đa dạng cộng đồng vi khuẩn trong mẫu mà không cần nuôi cấy, rất phù hợp để phân tích vi khuẩn phân hủy cellulose trong rơm rạ.

2. Tại sao chọn vùng gene V3 của 16S rDNA để phân tích?
   Vùng V3 của gene 16S rDNA có độ biến đổi cao, giúp phân biệt các loài vi khuẩn với độ chính xác tốt. Đây là vùng được nhiều nghiên cứu sử dụng để khảo sát đa dạng vi khuẩn trong các hệ sinh thái khác nhau.

3. Làm thế nào để xác định vi khuẩn có khả năng sinh enzyme cellulase?
   Vi khuẩn được kiểm tra định tính enzyme cellulase bằng phương pháp đĩa CMC nhuộm Congo Red. Vi khuẩn sinh cellulase sẽ tạo vòng phân giải nhạt màu trên đĩa, chứng tỏ khả năng phân giải cellulose.

4. Tạo dòng có vai trò gì trong nghiên cứu này?
   Tạo dòng giúp nhân bản các đoạn gene V3 thu nhận từ DGGE, cho phép phân tích chi tiết từng chủng vi khuẩn riêng biệt, xây dựng cây phát sinh loài và xác định chính xác thành phần cộng đồng vi khuẩn.

5. Nghiên cứu này có thể ứng dụng thực tiễn như thế nào?
   Kết quả nghiên cứu giúp tuyển chọn vi khuẩn phân hủy cellulose hiệu quả, ứng dụng trong xử lý rơm rạ để sản xuất nhiên liệu sinh học hoặc phân bón sinh học, góp phần giảm ô nhiễm môi trường và nâng cao giá trị kinh tế của phế phụ phẩm nông nghiệp.

Kết luận

• Nghiên cứu thành công trong việc sử dụng kỹ thuật PCR-DGGE kết hợp tạo dòng để phân tích đa dạng cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ tại Đồng Tháp.
• Nhiệt độ ủ rơm dao động từ 18°C đến 80°C, tạo điều kiện phát triển vi khuẩn chịu nhiệt và sinh enzyme cellulase.
• Xác định được 5 đoạn gene V3 đại diện cho các chủng vi khuẩn phân hủy cellulose khác nhau, có khả năng sinh enzyme cellulase cao.
• Phương pháp đĩa CMC nhuộm Congo Red xác nhận hoạt tính cellulase của vi khuẩn trong mẫu rơm ủ.
• Đề xuất phát triển quy trình tuyển chọn vi khuẩn và ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học, đồng thời khuyến nghị đào tạo và tuyên truyền kỹ thuật xử lý rơm rạ bền vững.

Tiếp theo, cần triển khai nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn hiệu quả hơn, xây dựng mô hình ứng dụng quy mô pilot và mở rộng đào tạo kỹ thuật cho cộng đồng nông dân. Mời các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp quan tâm hợp tác phát triển ứng dụng công nghệ sinh học trong xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGÔ ĐỨC DUY PHÂN TÍCH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN PHÂN HỦY RƠM RẠ BẰNG KỸ THUẬT PCR-DGGE VÀ TẠO DÕNG LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGÔ ĐỨC DUY PHÂN TÍCH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN PHÂN HỦY RƠM RẠ BẰNG KỸ THUẬT PCR-DGGE VÀ TẠO DÕNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC : TS HOÀNG QUỐC KHÁNH Thành phố Hồ Chí Minh- 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những thông tin đƣợc viết trong luận văn này là do tôi thực hiện và sự hƣớng dẫn nhiệt tình của Ts Hoàng Quốc Khánh. Mọi kết quả nghiên cứu cũng nhƣ ý tƣởng, cùng với các thông tin nghiên cứu khác đƣợc trích dẫn rõ ràng, cụ thể trong luận văn. Nội dung trong đề tài luận văn này cho đến nay chƣa đƣợc bảo vệ bất cứ Hội đồng khoa học bảo vệ luận văn Thạc sĩ nào và chƣa đƣợc công bố. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những lời cam đoan trên.

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2019 Ngƣời cam đoan Ngô Đức Duy i LỜI CẢM ƠN Luận văn đƣợc hoàn thành nhờ vào sự hƣớng dẫn nhiệt tình của Ts Hoàng Quốc Khánh và tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Thầy. Cảm ơn Ban Lãnh Đạo Viện Sinh học Nhiệt đới tạo điều kiện thuận lợi nhất hoàn thành khóa học, Thầy cô Giảng viên và Học Viện Khoa học và Công nghệ. Cảm ơn Gs Yasuo Igarashi, Gs Masahura Ishii của Trƣờng GSALS (The Graduate School of Agricultural and Life Sciences), Đại học Tokyo Nhật Bản, đã hỗ trợ kỹ thuật và tài chính cho nghiên cứu này thuộc dự án “Kết hợp bền vững nền nông nghiệp địa phƣơng với công nghiệp chế biến biomass” của JICA (Japan International Cooperation Agency), JST (Japan Science and Technology Agency) và Đại học Bách Khoa TP. Lời cảm ơn những Anh Chị đồng nghiệp; Ts Kouji Yoshida, Ts Mannix Pedro, Makoto Ato, Chihaya Yamada, Đào Thị Thu Hiền, Hoàng Ngọc Phƣơng Thảo, Nguyễn Hoàng An, Nguyễn Ngọc Liên, Ts Nguyễn Hoàng Dũng và các Em trong phòng Vi sinh đã hỗ trợ nhiều trong nghiên cứu.

Với những chia sẽ vui buồn từ các bạn Học viên Cao học là động lực cho tôi hoàn thành luận văn. Đặc biệt gửi lời cảm ơn tới Mẹ Cha, vợ Trần Thị Hồng Vân, con Ngô Đức Anh, Ngô Đức Dũng rất nhiều và Anh Chị trong Gia đình đã luôn ủng hộ tôi trong mọi điều kiện. Ngô Đức Duy ii LỜI NÓI ĐẦU Hiện nay định danh chủng vi sinh không còn nhiều khó khăn nhƣ trƣớc, vì sự phát triển các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại với những phƣơng pháp đa dạng và độ chính xác cao. Phần lớn định loại loài trƣớc đây luôn dựa vào quá trình phân lập thuần chủng hoặc sàng lọc đặc tính quan trọng cho mục đích nghiên cứu.

Tuy nhiên có những nghiên cứu đỏi hỏi biết rõ các thành phần loài vi sinh tồn tại trong mẫu vật, quá trình thay đổi thành phần, số lƣợng chủng loài phụ thuộc nhiều vào thành phần cơ chất, điều kiện sống và quá trình trao đổi chất. Trong tự nhiên vi sinh vật rất đa dạng, mức độ thay đổi theo điều kiện môi trƣờng, phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi sinh thông qua việc xác định gene trƣớc tiên dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử. Nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đã và đang đƣợc sử dụng trong hầu hết các lĩnh vực nghiên cứu về gene của công nghệ sinh học, trong đó có kỹ thuật phân tích PCR-DGGE cơ bản tách độc lập riêng biệt mỗi trình tự gene với độ chuẩn xác khác biệt 1 nuclotide. Chính vì vậy mà có thể sử dụng kỹ thuật DGGE xác định cộng đồng vi khuẩn trong mẫu mà không cần giai đoạn phân lập làm thuần chủng, bên cạnh đó có thể kết hợp với kỹ thuật Tạo dòng trong nghiên cứu sẽ giúp hiệu suất nghiên cứu cao hơn và tăng tính ứng dụng đa dạng phƣơng pháp sinh học phân tử trong phân tích cộng đồng vi sinh vật.

Mục tiêu nội dung của nghiên cứu là sử dụng phƣơng pháp PCR- DGGE và tạo dòng để xác định cộng đồng vi khuẩn trong rơm trƣớc và sau ủ. Nhằm phân tích đánh giá khả năng biến động đa dạng vi khuẩn có trong nguồn rơm ủ dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử. Tạo nền tảng cho việc phân lập, tuyển chọn những loài vi khuẩn nhƣ chịu nhiệt, sinh cellulase và các định hƣớng nghiên cứu ứng dụng cho việc sản xuất nhiên liệu sinh học trong tƣơng lai. iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT APS: Ammonium Persulfate BA: Bis-Acrylamine bp: base pairs CTAB: Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide DFB: Diffusion buffer DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DNA: Deoxylribonucleic acid dNTPs: Deoxyrinonucleotide triphosphates EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetic Acid PCR: Polymerase Chain Reaction PFGE: Pulse Field Gel Electrophoresis RAPD: Random amplified polymorphic DNA RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphisms RNA: Ribonucleic acid SDS: Sodium dodecyl sulfate TAE: Tris Acetic TEMED: Tetramethyl ethylene diamine UF: Urea Formamide UV: Ultra violet iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.

Thống kê sản lƣợng gạo sản xuất trên Thế giới. Thành phần cấu tạo chung của rơm rạ. Thành phần hóa học chính của rơm rạ. Số liệu thống kê sản lƣợng gạo và rơm rạ trên thế giới.

Phƣơng pháp PCR với mồi chuyên biệt xác định một số bệnh trên lúa mì. Các cặp mồi cho vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu. Thành phần phản ứng PCR. Chu trình nhiệt phản ứng PCR.

Thành phần phản ứng PCR vùng gene V3. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR gene V3. Chuẩn bị cách pha nồng độ bảng gel polyacrylamine. Tỷ lệ phối trộn nồng độ gel polyacrylamide vào hai xilanh.8: Thành phần Big – dye PCR.

35 v DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 1.Diện tích gieo trồng, năng suất và sản lƣợng gạo Việt Nam………. Qui trình phân giải cellulose thành glucose. Một số hình ảnh thu nhận lấy mẫu rơm. Qui trình thực hiện trong nghiên cứu.

Qui trình ly trích và thu nhận DNA từ mẫu rơm. Qui trình thu nhận gene V3 từ gel polyacrylamdie. Cấu trúc pGEM@-T Easy vector của hãng Omega. Biểu đồ thay đổi nhiệt độ trong qúa trình ủ rơm.

Kết quả ly trích thu nhận DNA bộ gene vi sinh trong mẫu R. Kết quả sản phẩm PCR và DGGE đoạn gene V3 của mẫu R. Cây phát sinh loài vi khuẩn trong mẫu R. Kết quả sản phẩm PCR và DGGE đoạn gene V3 của mẫu Rn.

Kết quả thu nhận sản phẩm tạo dòng. Kết quả 32 sản phẩm PCR đoạn gene V3. Kết quả 30 sản phẩm DGGE chạy trên hệ thống BioRad. Cây phát sinh loài vi khuẩn trong mẫu Rn.

Thử khả năng sinh cellulase trên đĩa CMC của mẫu Rn. 48 vi MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN. ii LỜI NÓI ĐẦU. iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT.

iv DANH MỤC CÁC BẢNG. v DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ. vi MỤC LỤC. vii CHƢƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU .RƠM RẠ, THÀNH PHẦN CẤU TẠO VÀ GIÁ TRỊ KINH TẾ. Thành phần cấu tạo rơm rạ. Giá trị kinh tế của rơm rạ. HỆ ENZYME CELLULASE VÀ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI RƠM 9 1.

Hệ Enzyme cellulase và cơ chế phân giải cellulose. Hệ vi sinh phân giải cellulose .KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỊNH LOÀI VI SINH. Các phƣơng pháp ly trích và thu nhận DNA vi sinh vật. Các kỹ thuật sinh học phân tử trong định danh.

Kỹ thuật PCR trong trong định danh vi khuẩn. Kỹ thuật PCR-DGGE trong định danh vi khuẩn. Kỹ thuật tạo dòng. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU.

23 Thiết bị và dụng cụ.CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .Phƣơng pháp ly trích và thu nhận DNA. Phƣơng pháp PCR nhân bản gene 16S rDNA và vùng gene V3. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm gene V3. Phƣơng pháp thực hiện kỹ thuật DGGE.

Qui trình chuẩn bị gel polyacrylamine và thực hiện DGGE. Quy trình thu nhận sản phẩm DGGE từ gel polyacrylamide. PCR gene V3 sau khi thu nhận từ DGGE với cặp mồi 357F và 517R. Phƣơng pháp tạo dòng.

Giải trình tự gene V3 và xây dựng cây phát sinh loài. Khảo sát sinh cellulase phƣơng pháp đĩa CMC. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Kết quả kiểm tra nhiệt độ.

Kết quả thu nhận DNA genome của vi sinh vật trong mẫu rơm. Kết quả thu nhận gene 16S rDNA và gene V3 của mẫu R. Kết quả phân tích dữ liệu cộng đồng vi khuẩn của mẫu R. Kết quả DNA, gene 16S rDNA và gene V3 mẫu Rn.

Kết quả tạo dòng trên vector pGEM@-T Easy của hãng Promega. Kết quả thu nhận vùng gene V3 sau khi đã tạo dòng. Kết quả kiểm tra gene V3 sau khi tạo dòng bằng kỹ thuật DGGE. Kết quả sơ bộ định tính enzyme cellulase trong mẫu Rn.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 51 viii 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

RƠM RẠ, THÀNH PHẦN CẤU TẠO VÀ GIÁ TRỊ KINH TẾ 1. Rơm rạ Theo thống kê của Tổ chức Nông Lƣơng của Liên Hợp Quốc (FAO- Food and Agriculture Organization) [1], sản xuất lúa gạo trên thế giới chạm mức kỷ lục 759,6 triệu tấn lúa (503,9 triệu tấn gạo) trong năm 2017 và năm 2018 tiếp tục tăng sản lƣợng thêm 10,3 triệu tấn lên mức cao mới 769,9 triệu tấn lúa (510,6 triệu tấn gạo). Dự báo sản lƣợng sẽ tăng trƣởng 1,4% trong năm 2019, khu vực sản xuất lúa gạo tập trung ở Châu Á là chính, trong đó 2 vùng sản xuất lớn là Nam Á và Đông Nam Á với mức tăng sản lƣợng tuyệt đối lớn nhất đƣợc dự đoán sẽ là Ấn Độ, sản xuất tăng đáng kể ở các nƣớc nhƣ Bangladesh, Sri Lanka, Indonesia, Lào, Malaysia, Myanmar, Nepal, Philippines và Thái Lan, Việt Nam xem bảng 1. Tƣơng ứng với việc tăng trƣởng sản xuất lúa gạo hàng năm thì sản lƣợng rơm rạ đƣợc thải ra ngoài đồng ruộng trên toàn cầu cực kỳ lớn, nhƣng tới nay chƣa có thống kê chính xác về lƣợng rơm rạ thải ra sau thu hoạch lúa, vì tùy thuộc vào văn hóa bản địa, loại giống lúa trồng trọt, vùng canh tác và điều kiện thổ nhƣỡng.

Nhƣng tổng thể ƣớc lƣợng trung bình sản xuất ra 1 tấn gạo thì sẽ thải ra khoảng 1,5 tấn rơm rạ. Thống kê sản lƣợng gạo sản xuất trên Thế giới. Khu vực/Quốc gia Số lƣợng gạo Khu vực/Quốc gia Số lƣợng gạo (triệu tấn) (triệu tấn) Thế giới 758.8 Việt Nam 44 Guinea 2.