Luận văn thạc sĩ về khả năng kháng MRSA của cây bản địa Bình Dương

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật hóa học nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn MRSA từ cây bản địa Bình Dương, cung cấp thông tin hữu ích cho y học.

• Tác giả: Trần Thị Yến Nhi
• Người hướng dẫn: PGS.TS Trương Vũ Thanh
• Trường học: Đại học Quốc gia TP. HCM
• Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Khả Năng Kháng Lại Vi Khuẩn Staphylococcus Aureus Kháng Methicillin (MRSA) Của Một Số Cây Bản Địa Bình Dương
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: TP.Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tổng quan về MRSA

MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) là một chủng vi khuẩn có khả năng kháng lại nhiều loại kháng sinh, bao gồm cả methicillin, một loại kháng sinh phổ biến được sử dụng để điều trị nhiễm trùng do Staphylococcus aureus gây ra. Sự xuất hiện của MRSA đã trở thành một vấn đề nghiêm trọng trong y tế, đặc biệt là trong các cơ sở y tế, nơi mà các ca nhiễm trùng có thể dẫn đến hậu quả nghiêm trọng cho bệnh nhân. Theo thống kê, MRSA là nguyên nhân chính gây ra các ca nhiễm trùng huyết và viêm phổi, ảnh hưởng đến hàng triệu người mỗi năm. Việc kháng thuốc của MRSA không chỉ gây khó khăn trong điều trị mà còn làm tăng chi phí chăm sóc sức khỏe. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp điều trị mới, bao gồm việc sử dụng các chiết xuất từ thực vật, là rất cần thiết.

1.1. Lịch sử và phân loại học

MRSA lần đầu tiên được phát hiện vào những năm 1960, và kể từ đó, các chủng vi khuẩn này đã phát triển mạnh mẽ, gây ra nhiều ca nhiễm trùng kháng thuốc. S. aureus là một loại vi khuẩn Gram dương, có khả năng gây bệnh cho con người thông qua nhiều cơ chế khác nhau. Vi khuẩn này có thể tồn tại trong môi trường và lây lan từ người này sang người khác, đặc biệt là trong các cơ sở y tế. Sự phân loại MRSA dựa trên khả năng kháng thuốc của nó đối với các loại kháng sinh khác nhau, trong đó có methicillin và các kháng sinh thuộc nhóm β-lactam. Việc hiểu rõ về lịch sử và sự phát triển của MRSA là rất quan trọng để có thể tìm ra các biện pháp phòng ngừa và điều trị hiệu quả.

1.2. Các yếu tố độc lực

MRSA có nhiều yếu tố độc lực giúp nó tồn tại và phát triển trong cơ thể người. Các yếu tố này bao gồm khả năng bám dính vào tế bào chủ, sản xuất độc tố và khả năng kháng lại hệ miễn dịch. Vi khuẩn này có thể tiết ra các enzyme như coagulase, giúp tạo ra các cục máu đông, ngăn chặn sự thực bào của các tế bào miễn dịch. Bên cạnh đó, MRSA cũng có khả năng sản xuất các protein liên kết với penicillin (PBP2a), giúp nó kháng lại tác động của các loại kháng sinh. Sự hiểu biết về các yếu tố độc lực này sẽ hỗ trợ trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới nhằm chống lại MRSA.

II. Tổng quan về cây bản địa Bình Dương

Cây bản địa Bình Dương, như lá Thành Ngạnh Nam (Cratoxylum cochinchinense) và lá Xăng Mã (Carallia brachiata), đã được nghiên cứu về khả năng kháng vi khuẩn, đặc biệt là MRSA. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các chiết xuất từ những cây này có hoạt tính kháng khuẩn đáng kể, nhờ vào sự hiện diện của các hợp chất sinh học như flavonoid và polyphenol. Những hợp chất này không chỉ giúp cây chống lại các tác nhân gây bệnh mà còn có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm kháng khuẩn tự nhiên. Việc khai thác và nghiên cứu các cây thuốc cổ truyền này có thể cung cấp những giải pháp mới trong điều trị các bệnh nhiễm trùng kháng thuốc.

2.1. Thành phần hóa học

Thành phần hóa học của lá Thành Ngạnh Nam và lá Xăng Mã bao gồm nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt là flavonoid. Các nghiên cứu cho thấy lá Thành Ngạnh Nam có hàm lượng flavonoid cao, lên đến 604 mg QUE/g nguyên liệu khô, trong khi lá Xăng Mã có hàm lượng 186,8 mg QUE/g. Những hợp chất này không chỉ có tác dụng kháng khuẩn mà còn có khả năng chống oxy hóa, hỗ trợ trong việc bảo vệ tế bào khỏi tổn thương. Sự phong phú về thành phần hóa học của các cây thuốc này mở ra nhiều cơ hội trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới và hiệu quả hơn đối với các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn kháng thuốc.

2.2. Hoạt tính sinh học

Hoạt tính sinh học của các chiết xuất từ lá Thành Ngạnh Nam và lá Xăng Mã đã được nghiên cứu kỹ lưỡng. Kết quả cho thấy các chiết xuất này có khả năng ức chế sự phát triển của MRSA với giá trị MIC lần lượt là 1,25 mg/mL cho lá Thành Ngạnh Nam và 5 mg/mL cho lá Xăng Mã. Điều này chứng tỏ rằng các chiết xuất từ cây bản địa Bình Dương có tiềm năng lớn trong việc phát triển các liệu pháp kháng khuẩn tự nhiên. Việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của các hợp chất này có thể giúp tìm ra các phương pháp điều trị hiệu quả hơn cho các bệnh nhiễm trùng kháng thuốc.

III. Phương pháp nghiên cứu

Để nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn MRSA từ cây bản địa Bình Dương, các phương pháp chiết xuất và phân tích hóa học đã được áp dụng. Phương pháp chiết Soxhlet với dung môi ethanol 70% được xác định là hiệu quả nhất trong việc chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học từ lá Thành Ngạnh Nam và lá Xăng Mã. Sau khi chiết xuất, các mẫu được tiến hành phân tích hàm lượng flavonoid và hoạt tính kháng MRSA bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch và phương pháp vi pha loãng. Kết quả thu được sẽ cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng cho việc đánh giá khả năng kháng vi khuẩn của các cây thuốc cổ truyền này.

3.1. Điều kiện chiết xuất

Nghiên cứu đã khảo sát các điều kiện chiết xuất khác nhau, bao gồm phương pháp chiết (ngâm dầm và Soxhlet) và nồng độ dung môi ethanol. Kết quả cho thấy phương pháp chiết Soxhlet và dung môi ethanol 70% mang lại hiệu quả chiết xuất tốt nhất, với hàm lượng flavonoid cao nhất và hoạt tính kháng MRSA mạnh mẽ. Việc tối ưu hóa điều kiện chiết xuất không chỉ giúp nâng cao hiệu quả thu nhận các hợp chất có lợi mà còn giảm thiểu thời gian và chi phí trong quá trình nghiên cứu.

3.2. Phân tích hoạt tính kháng MRSA

Hoạt tính kháng MRSA của các chiết xuất đã được xác định thông qua các phương pháp tiêu chuẩn như khuếch tán đĩa thạch và vi pha loãng. Kết quả cho thấy cả hai loại chiết xuất từ lá Thành Ngạnh Nam và lá Xăng Mã đều có khả năng ức chế sự phát triển của MRSA, với các giá trị MIC khác nhau. Việc đánh giá hoạt tính kháng khuẩn không chỉ giúp xác định tiềm năng của các chiết xuất mà còn cung cấp thông tin quý giá cho việc phát triển các sản phẩm kháng khuẩn từ thiên nhiên.

IV. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn MRSA từ cây bản địa Bình Dương đã chỉ ra rằng các chiết xuất từ lá Thành Ngạnh Nam và lá Xăng Mã có hoạt tính kháng khuẩn đáng kể. Kết quả này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các liệu pháp điều trị các bệnh nhiễm trùng kháng thuốc. Để tiếp tục nghiên cứu, cần có thêm các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của các hợp chất trong các chiết xuất này cũng như khả năng kết hợp với các loại kháng sinh khác. Việc bảo tồn và phát triển các cây thuốc cổ truyền cũng cần được chú trọng để đảm bảo nguồn tài nguyên quý giá này không bị mai một.

4.1. Đề xuất nghiên cứu tiếp theo

Đề xuất nghiên cứu tiếp theo bao gồm việc khảo sát thêm về các cây thuốc khác có khả năng kháng MRSA, nhằm mở rộng nguồn tài nguyên cho việc phát triển các sản phẩm kháng khuẩn. Ngoài ra, cần thực hiện các nghiên cứu lâm sàng để đánh giá hiệu quả của các chiết xuất này trong điều trị thực tế. Việc kết hợp giữa các chiết xuất thực vật và kháng sinh cũng nên được nghiên cứu để tìm ra các công thức tối ưu nhất, nhằm nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu tình trạng kháng thuốc.

4.2. Bảo tồn nguồn tài nguyên thực vật

Bảo tồn các cây thuốc cổ truyền như Thành Ngạnh Nam và Xăng Mã là rất quan trọng không chỉ cho nghiên cứu y học mà còn cho sự phát triển bền vững của hệ sinh thái. Cần có các chính sách hỗ trợ và khuyến khích việc trồng và bảo tồn các cây thuốc này, đồng thời nâng cao nhận thức cộng đồng về giá trị của chúng trong việc chăm sóc sức khỏe. Việc bảo tồn không chỉ giúp duy trì nguồn tài nguyên quý giá mà còn góp phần vào việc phát triển nền y học cổ truyền và hiện đại.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ MRSA Năm 1880, từ mủ của áp xe phẫu thuật khớp gối, Sir Alexander Ogston - bác sĩ phẫu thuật người Scotland – đã mô tả “micrococci” như là một nguyên nhân gây ra “sự suy giảm cấp tính”. Ogston đã đặt tên cho các “micrococci” này là Staphylococcus, bắt nguồn từ các tiếng Hy Lạp: “staphyle” nghĩa là chùm nho và “kokkos” nghĩa là quả mọng [6]. Đến năm 1884, bác sĩ người Đức, Friedrich Julius Rosenbach, đã phân biệt Staphylococcus bằng màu sắc của các khuẩn lạc, chia Staphylococcus thành hai loài là S. Năm 1920, Staphylococcus được Winslow và các cộng sự phân vào họ Micrococcaceae [8].

Sau đó, ba nhóm loài Staph. epidermidis và Staph. Saprophyticus được Baird-Parker (1974) công nhận vào chi Staphylococcus trong ấn bản Baird-Parker của Bergey’s Manual [9]. Cho đến nay, có ít nhất 25 loài khác đã được mô tả trên cơ sở nghiên cứu tương đồng DNA và các đặc điểm hóa miễn dịch và sinh hóa của chi này [10].

Sự kháng thuốc của S.aureus xuất hiện trong vòng 2 năm sau khi penicillin ra đời (năm 1941). Sau đó, kháng sinh bán tổng hợp methicillin - có khả năng chống lại S.aureus kháng penicillin - đã được phát hiện vào cuối năm 1950 và S.aureus kháng methicillin (MRSA) được xác định trên lâm sàng vào năm 1960 [11]. Kể từ đó, mặc dù methicillin không còn được sản xuất nhưng các chủng S.aureus đã phát triển khả năng đề kháng với các loại kháng sinh (kể cả nhóm penicillin và cephalosporin) đều được gọi chung là S.aureus kháng methicillin (MRSA) [12]. 6 Staphylococcus aureus là cầu khuẩn Gram dương, có đường kính từ 0,5–1,5 μm và có xu hướng sắp xếp thành từng cụm giống như “chùm nho” (Hình 1.1), không có lông, không có nha bào, thường không có vỏ [6].

Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi. Nguồn: [13] Staphylococcus aureus thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, một số có khả năng làm tan huyết trên thạch máu ngựa nhưng vùng tan huyết tương đối nhỏ so với đường kính khuẩn lạc (Hình 1. Hầu hết các dòng S.aureus đều tạo sắc tố vàng (Hình 1.2b), nhưng các sắc tố này ít thấy khi quá trình nuôi cấy còn non mà thường thấy rõ sau 1-2 ngày nuôi ở nhiệt độ phòng. Sắc tố được tạo nhiều hơn trong môi trường hiện diện lactose hay các nguồn hydrocacbon khác mà sinh vật này có thể bẽ gãy và sử dụng [14].

Các thử nghiệm sinh hóa điển hình của S.aureus bao gồm: dương tính với catalase, dương tính với coagulase, nhạy cảm với novobiocin và có khả năng lên men mannitol [15]. 7 Môi trường thạch máu cừu Môi trường thạch MSA Hình 1. Khuẩn lạc của S.aureus tồn tại và phát triển phụ thuộc vào một số yếu tố môi trường như: nhiệt độ, độ ẩm, hoạt độ nước (aw), sự hiện diện của oxy và thành phần nuôi cấy. Các thông số tăng trưởng vật lý này thay đổi tùy thuộc vào từng chủng.

Theo ICMSF 1996 thì giới hạn phát triển của đa số S.aureus được tóm tắt như trong Bảng 1. Giới hạn phát triển của S. Nguồn: ICMSF 1996 [16] Khoảng Tối ưu Nhiệt độ (oC) 7 đến 48 37 pH 4 đến 10 6 đến 7 Hoạt độ (aw) 0,83 đến > 0,99 0,9 Staphylococcus aureus là loại ký sinh trên bề mặt của động vật máu nóng.aureus gây ra có thể được chia thành hai loại lớn: (1) nhiễm trùng cấp tính, có thể khu trú (mụn mủ) hay lan rộng (tím tái hoặc nhiễm trùng huyết); (2) nhiễm độc huyết cấp tính (bệnh tróc vảy, viêm biểu bì tiết dịch, hội chứng sốc nhiễm độc và ngộ độc thực phẩm do tụ cầu) [17]. Khả năng gây bệnh của S.aureus phụ thuộc vào sức đề kháng của vật chủ và một loạt các yếu tố độc lực cũng như các cơ chế trốn tránh sự phòng thủ của hệ miễn dịch người.

Thành tế bào của S.aureus được cấu trúc bởi các protein liên kết bề mặt như: 8 protein A – ngăn cản quá trình quang hóa hệ thống bổ thể và fibrinogen – tạo ra sự bám dính [18]. Ngoài ra, thành tế bào của vi khuẩn này cũng được bao quanh bởi các polysaccharide dạng viên nang, giúp làm suy yếu bổ thể và quá trình opso hóa qua trung gian kháng thể, từ đó, ức chế quá trình thực bào [19]. Khi bám vào mô vật chủ, S.aureus tiết ra các độc tố hemolysin (alpha, beta, gamma và delta) gây hoại tử tuyến vú; độc tố ruột (enterotoxin loại A, B, C, D và E) gây ngộ độc thực phẩm và đặc biệt là Panton-Valentine leukocidin gây phá hủy màng sinh chất của các tế bào đa hình [20].aureus cũng có khả năng giải phóng các enzym ngoại bào là coagulase – gây đông máu huyết tương và protease – đóng vai trò quan trọng trong việc giúp vi khuẩn lây lan sang tế bào khác [20]. Chất kháng khuẩn thường tác động đa dạng vào các quá trình sinh tổng hợp của vi khuẩn, bao gồm ức chế tổng hợp thành tế bào (β-lactam, glycopeptide), khử cực màng tế bào (lipopeptide), ức chế tổng hợp protein (aminoglycoside, tetracyline), ức chế tổng hợp acid nucleic (quinolone, fluoroquinolone) và ức chế các con đường trao đổi chất (sulfonamide, trimethoprim) [21].

Tuy nhiên, với một loạt các cơ chế như trên nhưng kháng sinh vẫn chưa thể kiểm soát tốt được các vi sinh vật kháng thuốc. Nguyên nhân là do vi khuẩn rất linh hoạt và thích nghi, có khả năng tự bảo vệ chống lại sự tấn công của các chất kháng khuẩn. Hơn nữa, sự gia tăng tiêu thụ (ở cả người và động vật) và lạm dụng quá mức kháng sinh đã góp phần tạo điều kiện cho vi khuẩn có thời gian cũng như không gian để phát triển các cơ chế kháng thuốc. Hậu quả là vi khuẩn có thể tạo nên tính kháng mức độ cao ở các thế hệ kế tiếp ngay cả khi kháng sinh được sử dụng ở nồng độ rất thấp.

Trong đó, chỉ riêng trường hợp của MRSA đã có 4 cơ chế kháng thuốc chính: (1) sửa đổi phân tử đích, (2) sản xuất enzym β-lactamase, (3) khả năng thấm màng ngoài và (4) hình thành màng sinh học. PBP2a có 9 đặc điểm cấu trúc giống với những PBP khác nhưng lại có ái lực thấp với kháng sinh thuộc nhóm β-lactam [22]. Nghĩa là, ở mức điều trị mà kháng sinh có thể ức chế hoạt động dịch chuyển đối với PBP của S.aureus nhạy methicillin thì PBP2a của MRSA vẫn thực hiện được các phản ứng tổng hợp peptidoglycan. Cơ chế trên giúp S.aureus đề kháng với methicillin và tất cả các kháng sinh nhóm β-lactam, steptomycin và tetracylin [23].

(2) Sản xuất enzym β-lactamase: MRSA tiết ra enzym β-lactamase để làm giảm tác dụng của kháng sinh thông qua 2 cơ chế chính. Đầu tiên là cơ chế thủy phân, β- lactamase hydrol hóa và làm bất hoạt các kháng sinh, ví dụ, penicillin, cephalosporin, monobactam và carbapenem [24, 25]. Thứ hai là cơ chế chèn ép, một lượng lớn β- lactamase liên kết nhanh chóng và chắc chắn với kháng sinh ngoại bào, ngăn cản kháng sinh đến không gian nội bào và do đó, kháng sinh không thể đến được vị trí đích [25]. Hori và Hiramatsu (1994) và Andrade (2014) đã phát hiện ra S.aureus đề kháng với aminoglycoside là do cơ chế này [26].

(4) Hình thành màng sinh học: Màng sinh học vi khuẩn là một cấu trúc phức hợp ngoại bào, bao gồm một quần thể vi sinh vật gắn liền với bề mặt của chất nền. Các sinh vật bên trong màng sinh học được bao quanh bởi một chất nền polyme ngoại bào ngậm nước cao, bảo vệ vi khuẩn thích nghi với môi tường xung quanh. Đặc điểm nổi bật nhất của màng sinh học là khả năng bám dính và kháng thuốc mạnh, cho phép vi khuẩn chống lại các phản ứng miễn dịch của vật chủ và tránh bị tiêu diệt bởi kháng sinh [25].2 TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH CEFOXITIN Cefoxitin là một loại kháng sinh bán tổng hợp, thuộc nhóm cephalosporin thế hệ thứ hai, được Karady và cộng sự (1972) tổng hợp thành công từ cephamycin C. Cấu trúc của cefoxitin được tạo ra bằng cách thay nhóm thienyl acetamido cho chuỗi bên α-aminoadipoyl của cấu trúc tự nhiên ban đầu, có một vòng β-lactam bốn cạnh kết hợp với một dị vòng sáu cạnh (Hình 1.

Cefoxitin được đặc trưng bởi nhóm 7-α-metoxyl 10 và 3-cacbamoyl (thay cho nhóm 7-α-hydro và 3-acetoxy của các cephalosporin thế hệ đầu tiên). Đây cũng là nguyên nhân giúp cefoxitin không chỉ giữ được các đặc tính mong muốn của cephamycin C mà còn có được một phổ kháng khuẩn rộng hơn [27]. Công thức cấu tạo của các kháng sinh Cefoxitin là kháng sinh tác động vào quá trình tổng hợp vách tế bào (cell wall) của vi khuẩn. Cefoxitin ức chế tổng hợp lớp peptidoglycan thông qua ức chế enzym transpeptidase (còn gọi là PBP) – chịu trách nhiệm hình thành liên kết chéo giữa các monomer.

Cụ thể, cefoxitin, với cấu trúc hóa học tương đồng với đầu D-Ala-D-Ala của chuỗi peptide, hoạt động như “cơ chất thứ hai” cạnh tranh với D-Ala-D-Ala là cơ chất thứ nhất, làm bất hoạt enzym, dẫn đến các liên kết chéo không được hình thành, vách tế bào vi khuẩn trở nên yếu ớt và dễ dàng bị phá hủy từ chính áp suất thẩm thấu bên trong [28]. Cefoxitin có một phổ kháng khuẩn khá rộng, bao gồm cả vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí, Gram âm và Gram dương. Cefoxitin chống lại S.aureus, Steptococcus pneumoniae và các liên cầu khuẩn tan huyết trong các thử nghiệm in vitro, thể hiện hoạt tính giống nhau ở tụ cầu sinh penicillinase và tụ cầu không sinh penicillinase. Hoạt tính đối với các vi sinh vật Gram dương của cefoxitin kém hơn so với cephalothin và cephloridine.

Tuy nhiên, cefoxitin lại có khả năng chống lại một loạt các vi khuẩn Gram âm, bao gồm Escherichia coli, Klebsiella sp., Proteus mirabilis và các loài dương tính với 11 indole như Pr.rettgeri, Haemophilus influenzae, Salmonella sp. Cũng như các cephalosporin khác, cefoxitin không có hoạt tính chống lại Str.faecalis và các chủng S.aureus kháng methicillin (MRSA). Mặc dù có nhóm 7-α- metoxyl giúp tăng độ ổn định của thuốc trước sự thủy phân của β-lactamase nhưng cefoxitin vẫn bị MRSA đề kháng một cách hiệu quả nhờ vào cơ chế biến đổi protein PBP. Tiêu chuẩn vàng để xác định MRSA là phát hiện gen mecA (phương pháp PCR) hoặc phát hiện PBP2a bằng cách ngưng kết latex [30, 31].

Tuy nhiên, những xét nghiệm này không nằm trong phạm vi của nhiều phòng thí nghiệm và tương đối đắt tiền. Do đó, vẫn cần có một phương pháp phát hiện MRSA đáng tin cậy và có thể được thực hiện dễ dàng trong các tình huống thông thường. Trước đây, thử nghiệm khuếch tán đĩa methicillin thường được sử dụng để phát hiện MRSA, sau đó được thay thế bằng oxacillin. Hiện nay, NCCLS (Ủy ban Quốc gia về Tiêu chuẩn Phòng thí nghiệm Lâm sàng) đã ghi nhận xét nghiệm sàng lọc đĩa cefoxitin là một trong những phương pháp hiệu quả [31], cho kết quả chính xác và lặp lại nhiều hơn so với khi sử dụng oxacillin.