Phân Lập Vi Khuẩn Có Khả Năng Sinh Tổng Hợp Gamma Polyglutamic Acid Từ Đồ Uống Boza

Nghiên cứu phân lập vi khuẩn sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid từ đồ uống boza, mở ra tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.

• Tác giả: Nguyễn Thị Phương
• Người hướng dẫn: ThS. Bùi Tuấn Hà
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Phân Lập Vi Khuẩn Sinh Tổng Hợp Gamma Polyglutamic Acid Từ Đồ Uống Boza
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục đích nghiên cứu
• 1.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.2.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.2.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN
• 2.1. Gamma-Polyglutamic acid
• 2.2. Công thức phân tử
• 2.3. Tính chất vật lý
• 2.4. Ứng dụng của gamma-polyglutamic acid
• 2.4.1. Ứng dụng trong y học
• 2.4.1.1. Chất vận chuyển thuốc
• 2.4.1.2. Chất kết dính sinh học
• 2.4.1.3. Chất mang gen chuyển
• 2.4.1.4. Chất phụ tá vaccine
• 2.4.2. Ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm
• 2.4.3. Ứng dụng trong công nghệ mỹ phẩm
• 2.4.4. Ứng dụng trong xử lí môi trường
• 2.4.5. Ứng dụng trong ngành chăn nuôi
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
• 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng
• 3.3.1. Thiết bị sử dụng
• 3.3.2. Các môi trường sử dụng
• 3.4. Nội dung nghiên cứu
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Phương pháp phân lập
• 3.5.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của vi khuẩn
• 3.5.2.1. Hình thái khuẩn lạc
• 3.5.2.2. Hình thái tế bào
• 3.5.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn
• 3.5.3.1. Thử nghiệm khả năng sinh Catalase
• 3.5.3.2. Thử nghiệm khả năng sinh oxydase
• 3.5.3.3. Thử nghiệm khả năng lên men đường glucose
• 3.5.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới khả năng sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid của vi khuẩn
• 3.5.5. Phương pháp xác định hàm lượng gamma polyglutamic acid trong dịch nuôi cấy
• 3.5.6. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng tổng hợp gamma polyglutamic acid của vi khuẩn
• 3.5.7. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường tới khả năng tổng hợp γ-PGA của vi khuẩn
• 3.5.8. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng tổng hợp gamma polyglutamic acid
• 3.5.9. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
• 3.5.10. Phương pháp nhân giống vi khuẩn
• 3.5.11. Phương pháp sử lý số liệu
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn có hoạt tính sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid từ mẫu đồ uống lên men Boza
• 4.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn sinh tổng hợp gammma polyglutamic acid từ mẫu đồ uống lên men Boza
• 4.3. Kết quả nghiên cứu hình thái của vi khuẩn BL4
• 4.4. Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh hóa của vi khuẩn BL4
• 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố lên quá trình tổng hợp gamma polyglutamic acid
• 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới quá trình sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid của chủng BL4
• 4.7. Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường tới khả năng tổng hợp gamma polyglutamic acid của vi khuẩn BL4
• 4.8. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid của vi khuẩn BL4
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu và mục đích nghiên cứu

Gamma Polyglutamic Acid (γ-PGA) là một polymer tự nhiên có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực như công nghệ thực phẩm, dược phẩm, và y tế. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA từ đồ uống Boza, một loại đồ uống lên men truyền thống. Mục đích chính là tìm ra các chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA hiệu quả, đồng thời nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy tối ưu để tăng năng suất tổng hợp.

1.1. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu này có ý nghĩa khoa học lớn khi giúp phân lập và đánh giá các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA. Đây là bước tiến quan trọng trong việc tìm kiếm nguồn vi khuẩn tự nhiên có tiềm năng ứng dụng cao trong công nghệ sinh học.

1.2. Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu không chỉ giúp sinh viên rèn luyện kỹ năng phân lập vi khuẩn mà còn mở ra hướng ứng dụng thực tế trong sản xuất γ-PGA, đặc biệt trong ngành thực phẩm và dược phẩm.

II. Tổng quan về Gamma Polyglutamic Acid

Gamma Polyglutamic Acid (γ-PGA) là một polymer sinh học được tổng hợp từ các chủng vi khuẩn Bacillus. Nó có cấu trúc hóa học đặc biệt với liên kết γ-peptide giữa các phân tử glutamic acid. γ-PGA có tính chất vật lý và hóa học nổi bật như khả năng hòa tan trong nước, phân hủy sinh học, và không độc hại.

2.1. Công thức và tính chất hóa học

Công thức phân tử của γ-PGA là (C5H7NO3)n, với trọng lượng phân tử dao động từ 50 kDa đến 2000 kDa. Tính chất hóa học của γ-PGA bao gồm khả năng tạo liên kết với kim loại và không bị phân hủy bởi enzyme protease.

2.2. Ứng dụng của γ PGA

γ-PGA được ứng dụng rộng rãi trong y học, công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm, và xử lý môi trường. Trong y học, nó được sử dụng như chất vận chuyển thuốc và chất kết dính sinh học. Trong thực phẩm, γ-PGA giúp cải thiện hương vị và tăng cường hấp thụ khoáng chất.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp phân lập vi khuẩn từ đồ uống Boza, sau đó đánh giá khả năng sinh tổng hợp γ-PGA thông qua các thử nghiệm hình thái và sinh hóa. Các yếu tố như pH, thời gian nuôi cấy, và nguồn cacbon được nghiên cứu để tối ưu hóa quá trình tổng hợp.

3.1. Phân lập vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn Bacillus được phân lập từ đồ uống Boza bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường chọn lọc. Sau đó, các chủng này được đánh giá về khả năng sinh tổng hợp γ-PGA.

3.2. Đánh giá điều kiện nuôi cấy

Nghiên cứu ảnh hưởng của pH, thời gian nuôi cấy, và nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp γ-PGA của vi khuẩn. Kết quả cho thấy pH tối ưu là 7.0 và thời gian nuôi cấy 48 giờ.

IV. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng vi khuẩn BL4 có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA cao nhất. Các yếu tố như pH và nguồn cacbon có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình tổng hợp. Nghiên cứu này mở ra tiềm năng ứng dụng γ-PGA trong các ngành công nghiệp khác nhau.

4.1. Kết quả phân lập

Chủng BL4 được phân lập từ đồ uống Boza cho thấy khả năng sinh tổng hợp γ-PGA vượt trội so với các chủng khác. Điều này khẳng định tiềm năng của Boza như một nguồn vi khuẩn có giá trị.

4.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

Nghiên cứu cho thấy pH 7.0 và thời gian nuôi cấy 48 giờ là điều kiện tối ưu để chủng BL4 sinh tổng hợp γ-PGA hiệu quả nhất. Nguồn cacbon cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình này.

V. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập chủng vi khuẩn BL4 có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA từ đồ uống Boza. Kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các ứng dụng thực tế của γ-PGA trong các ngành công nghiệp. Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình sản xuất và mở rộng ứng dụng của γ-PGA.

5.1. Kết luận

Chủng BL4 là một ứng cử viên tiềm năng cho việc sản xuất γ-PGA trên quy mô công nghiệp. Nghiên cứu này đã cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các ứng dụng thực tế của γ-PGA.

5.2. Kiến nghị

Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình sản xuất γ-PGA từ chủng BL4, đồng thời mở rộng ứng dụng của γ-PGA trong các lĩnh vực như y học, thực phẩm, và mỹ phẩm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Acid gamma polyglutamic (γ-PGA) là một polyme tự nhiên có tính chất sinh học nổi bật như hòa tan trong nước, phân hủy sinh học, không độc hại và có thể ăn được. Với các ứng dụng đa dạng trong công nghệ thực phẩm, y học, mỹ phẩm, xử lý môi trường và nông nghiệp, γ-PGA ngày càng thu hút sự quan tâm của ngành công nghệ sinh học. Nguồn tổng hợp γ-PGA chủ yếu là các chủng vi khuẩn Bacillus, đặc biệt được phân lập từ các sản phẩm lên men truyền thống như natto (Nhật Bản), thua-nao (Thái Lan), chungkookjang (Hàn Quốc) và Boza – một đồ uống lên men truyền thống có nguồn gốc từ lúa mì hoặc kê, chứa hỗn hợp vi khuẩn lactic và nấm men có lợi.

Nghiên cứu tập trung phân lập và đánh giá khả năng sinh tổng hợp γ-PGA của vi khuẩn Bacillus từ Boza nhằm tìm ra chủng vi khuẩn có hiệu suất cao, đồng thời khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu như pH, thời gian và nguồn cacbon để nâng cao sản lượng γ-PGA. Thời gian nghiên cứu từ tháng 12/2013 đến tháng 6/2014 tại phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa khoa học trong việc mở rộng nguồn vi khuẩn sinh γ-PGA và thực tiễn trong ứng dụng sản xuất γ-PGA phục vụ các ngành công nghiệp sinh học.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cấu trúc và tính chất của γ-PGA: γ-PGA là polymer gồm các đồng phân D-glutamic và L-glutamic liên kết qua liên kết γ-peptide, trọng lượng phân tử dao động từ 50 kDa đến 2000 kDa, có khả năng phân hủy sinh học và không bị enzyme protease phân hủy.
• Sinh tổng hợp γ-PGA ở vi khuẩn Bacillus: Quá trình tổng hợp γ-PGA được điều khiển bởi các gen pgsB, pgsC, pgsAA hoặc capB, capC, capA, capE tùy thuộc vào dạng γ-PGA (tự do hoặc liên kết bề mặt). Con đường sinh hóa tổng hợp γ-PGA bắt đầu từ acid L-glutamic, acid citric và ammonium sulfate qua chu trình TCA.
• Ảnh hưởng của điều kiện môi trường: pH, thời gian nuôi cấy và nguồn cacbon ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt động enzyme và sự phát triển của vi khuẩn, từ đó ảnh hưởng đến năng suất γ-PGA.

Các khái niệm chính bao gồm: vi khuẩn Bacillus, γ-PGA, pH môi trường, nguồn cacbon, thời gian nuôi cấy, phương pháp kết tủa và tinh sạch γ-PGA.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Vi khuẩn được phân lập từ mẫu đồ uống lên men Boza của công ty Harmonica, Bulgaria.
• Phương pháp phân lập: Pha loãng mẫu Boza đến 10^-6, cấy lên môi trường LBA, ủ ở 37°C trong 24h, thuần khiết các chủng dựa trên hình thái khuẩn lạc và tế bào.
• Nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn: Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào nhuộm Gram, thử nghiệm sinh hóa gồm catalase, oxidase, lên men glucose, lactose, sucrose.
• Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy: Thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian (12-72h), pH (5-8), nguồn cacbon (glucose, lactose, glycerol, sucrose) trên môi trường PGM đến khả năng sinh tổng hợp γ-PGA.
• Xác định hàm lượng γ-PGA: Kết tủa bằng ethanol, ly tâm, sấy khô và cân khối lượng γ-PGA.
• Phân tích số liệu: Sử dụng Microsoft Excel để tính toán và vẽ đồ thị.

Cỡ mẫu gồm 5 chủng vi khuẩn thuần khiết được phân lập từ Boza, trong đó chủng BL4 được chọn nghiên cứu chi tiết do có khả năng sinh γ-PGA cao nhất.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập vi khuẩn sinh γ-PGA: Từ mẫu Boza phân lập được 5 chủng vi khuẩn, trong đó chủng BL4 có khả năng sinh γ-PGA cao nhất với nồng độ 17,4 g/l sau 48h nuôi cấy, vượt trội hơn hẳn các chủng còn lại (BL1: 6,6 g/l; BL2: 4,3 g/l; BL3: 4,5 g/l; BL5 không thu được γ-PGA).
2. Đặc điểm vi khuẩn BL4: BL4 là vi khuẩn gram dương, hình que, kích thước 0,8 x 1,5 µm, có khả năng sinh bào tử, sinh catalase và oxidase, chuyển hóa glucose và sinh khí H2S, phù hợp với đặc điểm của Bacillus subtilis.
3. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy: Nồng độ γ-PGA tăng dần theo thời gian, đạt tối đa 21,3 g/l sau 60h, sau đó ổn định (72h: 21,2 g/l). Mật độ tế bào (OD610nm) cũng tăng từ 0,2 (12h) lên 1,3 (60-72h).
4. Ảnh hưởng pH môi trường: pH 7 là điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp γ-PGA với nồng độ 21,4 g/l. pH thấp (5) hoặc cao (8) làm giảm đáng kể sản lượng (7,2 g/l và 8,7 g/l tương ứng).
5. Ảnh hưởng nguồn cacbon: Glycerol là nguồn cacbon thích hợp nhất, cho sản lượng γ-PGA 23,1 g/l, cao hơn 8% so với glucose (21,4 g/l). Lactose và sucrose cho kết quả thấp hơn, đặc biệt sucrose thấp nhất (15,2 g/l), giảm khoảng 34% so với glycerol.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy vi khuẩn Bacillus phân lập từ Boza có tiềm năng sinh tổng hợp γ-PGA cao, đặc biệt chủng BL4 với sản lượng đạt trên 20 g/l trong điều kiện tối ưu. Thời gian nuôi cấy 60h phù hợp với pha cân bằng của vi khuẩn, khi enzyme tổng hợp γ-PGA hoạt động mạnh nhất. pH trung tính tạo môi trường thuận lợi cho hoạt động enzyme và vận chuyển chất, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về Bacillus subtilis. Nguồn cacbon glycerol thúc đẩy hiệu quả tổng hợp γ-PGA hơn glucose có thể do sự chuyển hóa hiệu quả hơn hoặc kích thích biểu hiện gen liên quan.

So sánh với các nghiên cứu trong nước và quốc tế, sản lượng γ-PGA của chủng BL4 tương đương hoặc cao hơn nhiều chủng Bacillus được báo cáo, cho thấy Boza là nguồn phân lập vi khuẩn tiềm năng. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ thể hiện sự thay đổi nồng độ γ-PGA theo thời gian, pH và nguồn cacbon để minh họa rõ ràng xu hướng và điều kiện tối ưu.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy: Thực hiện nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của nhiệt độ, nguồn nitơ và khoáng chất nhằm nâng cao sản lượng γ-PGA, hướng tới mục tiêu tăng sản lượng trên 25 g/l trong vòng 60h. Chủ thể thực hiện: nhóm nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, thời gian 6-12 tháng.
2. Định danh chính xác chủng BL4: Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử như giải trình tự rDNA 16S để xác định loài và đánh giá tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp. Chủ thể: phòng thí nghiệm phân tử, thời gian 3-6 tháng.
3. Ứng dụng sản xuất γ-PGA quy mô pilot: Sử dụng chủng BL4 trong quy trình lên men bán công nghiệp để đánh giá khả năng sản xuất ổn định và hiệu quả kinh tế. Chủ thể: doanh nghiệp công nghệ sinh học, thời gian 12 tháng.
4. Phát triển chế phẩm sinh học chứa γ-PGA: Nghiên cứu phối hợp chủng BL4 với các vi sinh vật khác để tạo chế phẩm ứng dụng trong nông nghiệp, y học hoặc xử lý môi trường, nhằm cải thiện hiệu quả sử dụng γ-PGA. Chủ thể: viện nghiên cứu và doanh nghiệp, thời gian 12-18 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học: Tìm hiểu quy trình phân lập và tối ưu hóa sản xuất γ-PGA từ vi khuẩn tự nhiên, áp dụng trong nghiên cứu phát triển sản phẩm sinh học.
2. Doanh nghiệp sản xuất γ-PGA và chế phẩm sinh học: Áp dụng kết quả nghiên cứu để lựa chọn chủng vi khuẩn hiệu quả, tối ưu điều kiện lên men nhằm nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.
3. Chuyên gia trong ngành công nghệ thực phẩm và mỹ phẩm: Nghiên cứu ứng dụng γ-PGA làm chất bảo quản, chất làm ẩm, hoặc thành phần chức năng trong sản phẩm, dựa trên đặc tính sinh học và an toàn của γ-PGA.
4. Người làm trong lĩnh vực xử lý môi trường và nông nghiệp: Tham khảo khả năng ứng dụng γ-PGA trong xử lý nước thải, cải tạo đất, phân bón sinh học nhằm nâng cao hiệu quả và thân thiện môi trường.

Câu hỏi thường gặp

1. γ-PGA là gì và có nguồn gốc từ đâu?
   γ-PGA là polymer tự nhiên được tổng hợp chủ yếu bởi vi khuẩn Bacillus, có tính chất hòa tan trong nước, phân hủy sinh học và không độc hại. Nguồn phân lập phổ biến là các sản phẩm lên men truyền thống như Boza, natto.

2. Tại sao chọn Boza làm nguồn phân lập vi khuẩn sinh γ-PGA?
   Boza chứa hỗn hợp vi khuẩn lactic và Bacillus có lợi, là môi trường tự nhiên giàu dinh dưỡng và vi sinh vật đa dạng, thuận lợi cho việc phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh γ-PGA cao.

3. Điều kiện nuôi cấy nào tối ưu cho sinh tổng hợp γ-PGA?
   Nghiên cứu cho thấy pH môi trường 7, thời gian nuôi cấy 60h và nguồn cacbon glycerol 2,5% là điều kiện tối ưu để đạt sản lượng γ-PGA cao nhất (23,1 g/l).

4. γ-PGA có ứng dụng gì trong thực tế?
   γ-PGA được ứng dụng rộng rãi trong y học (vận chuyển thuốc, chất kết dính sinh học), công nghệ thực phẩm (chất bảo quản, làm tăng hấp thu khoáng chất), mỹ phẩm (kem dưỡng ẩm, chống lão hóa), xử lý môi trường (kết tủa kim loại nặng), nông nghiệp và chăn nuôi.

5. Làm thế nào để xác định chính xác chủng vi khuẩn phân lập?
   Ngoài đặc điểm hình thái và sinh hóa, phương pháp sinh học phân tử như giải trình tự rDNA 16S được sử dụng để định danh chính xác loài vi khuẩn, giúp đánh giá tiềm năng ứng dụng và tối ưu hóa quy trình sản xuất.

Kết luận

• Đã phân lập thành công 4 chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA từ đồ uống lên men Boza, trong đó chủng BL4 có hiệu suất cao nhất với sản lượng đạt 23,1 g/l.
• Chủng BL4 có đặc điểm hình thái và sinh hóa phù hợp với Bacillus subtilis, là nguồn vi khuẩn tiềm năng cho sản xuất γ-PGA.
• Điều kiện nuôi cấy tối ưu gồm pH 7, thời gian 60h và nguồn cacbon glycerol 2,5% giúp nâng cao hiệu quả sinh tổng hợp γ-PGA.
• Kết quả nghiên cứu mở ra hướng phát triển ứng dụng γ-PGA trong công nghiệp sinh học, mỹ phẩm, y học và môi trường.
• Đề xuất nghiên cứu tiếp theo bao gồm định danh chủng vi khuẩn, tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và phát triển quy trình sản xuất quy mô lớn.

Luận văn cung cấp cơ sở khoa học vững chắc cho việc khai thác nguồn vi khuẩn tự nhiên từ Boza nhằm sản xuất γ-PGA chất lượng cao, góp phần thúc đẩy ứng dụng công nghệ sinh học trong nhiều lĩnh vực. Để tiếp tục phát triển, các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp nên phối hợp triển khai các nghiên cứu mở rộng và ứng dụng thực tiễn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Acid gamma polyglutamic (γ-PGA) là một polyme tự nhiên có các tính chất sinh hóa học quan trọng như có khả năng hòa tan trong nước, phân hủy sinh học, không độc và ăn được. γ-PGA được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghệ thực phẩm, dược phẩm sinh học, y tế, mỹ phẩm, xử lý môi trường và các lĩnh vực khác (Shih et al. γ-PGA được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn (tất cả vi khuẩn gram dương), trong đó chủ yếu là chủng vi khuẩn Bacillus được phân lập từ sản phẩm lên men truyền thống như: vi khuẩn Bacillus subtilis (Bacillus subtilis Natto) được phân lập từ natto ở Nhật Bản (Shih et al. 2001), Thua-nao từ Thái Lan, chungkookjang từ Hàn Quốc.

Bên cạnh các sản phẩm lên men kể trên, một loại sản phẩm lên men truyền thống đang được quan tâm tới khả năng có thể phân lập được các chủng Bacillus có hoạt lực sinh γ-PGA cao đó là Boza. Boza được biết đến là một loại đồ uống lên men truyền thống được làm từ lúa mì hoặc kê, có độ nhớt và nồng độ cồn thấp, thường là từ 0,5% – 1 %, có vị ngọt và chua, đây là một sản phẩm lành tính và giàu dinh dưỡng. Trong boza có chứa hỗn hợp vi khuẩn lactic và nấm men có lợi cho sức khỏe như: Lactobacillus brevis subsp. lactis, Leuconostoc citreum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Enterococcus faecium, Lactobacillus graminis, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus rhamnosus, Pediococcus sp.

và Lactobacillus paracasei, Bacillus subtilis (Kivanc et al. Hệ vi sinh vật trong Boza lên n 2 men tạo các sản phẩm giàu dinh dưỡng, trong đó chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng tổng hợp γ-PGA. Với nhu cầu ngày càng cao về γ-PGA, các nhà nghiên cứu không ngừng tìm kiếm và chọn lọc ra các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA với hiệu suất cao từ tự nhiên. Xuất phát từ vấn đề trên, để phân lập và đánh giá khả năng sinh tổng hợp γ-PGA của vi khuẩn Bacillus trong đồ uống Boza, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp gamma-polyglutamic acid từ đồ uống Boza’’.

Mục đích nghiên cứu - Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA từ Boza. - Nghiên cứu điều kiện: pH, thời gian, môi trường nuôi cấy thích hợp để vi khuẩn tổng hợp γ-PGA cao nhất. Yêu cầu - Phân lập được các chủng vi khuẩn Bacillus từ Boza - Đánh giá được ảnh hưởng của pH, thời gian, môi trường nuôi cấy tới khả năng sinh tổng hợp γ-PGA của vi khuẩn. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.

Ý nghĩa khoa học Phân lập được các chủng vi khuẩn có khả năng sinh γ-PGA từ Boza, đánh giá được các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp γ-PGA của vi khuẩn. Ý nghĩa thực tiễn - Giúp sinh viên rèn luyện thành thạo các kỹ thuật vi sinh như: phân lập, nghiên cứu hình thái và động thái sinh tổng hợp γ-PGA của vi sinh vật. - Kết quả phân lập và nghiên cứu điều kiện lên men có thể ứng dụng trong sản xuất γ-PGA sử dụng trong thực tế. n 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN 2.

Gamma-Polyglutamic acid 2. Công thức phân tử Acid gamma-polyglutamic (γ-PGA) còn được gọi là gamma polyglutamate. γ-PGA được tạo thành bởi đồng phân D-glutamic, L- glutamic hoặc cả hai đồng phân nối với nhau bởi liên kết amin giữa nhóm α- amino và γ-carboxyl tạo thành liên kết γ-peptide (Ho et al.1: Công thức cấu tạo của gamma-polyglutamic acid Tỷ lệ L-D-glutamate phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loài, điều kiện nuôi cấy. γ-PGA của chủng Bacillus subtilis (Natto) có tỷ lệ 50-80% là dạng D- glutamate và 20-50% là L-glutamate (Kubota et al.

Nhiều yếu tố cũng ảnh hưởng đến mức độ trùng hợp của phân tử γ-PGA. Nồng độ của Mn2+ có thể ảnh hưởng đến cấu hình của axit glutamic trong γ-PGA được tổng hợp bởi Bacillus subtilis. Khi môi trường có nồng độ Mn2+ cao thì trong γ-PGA có đồng phân dạng D-glutamate >80%, môi trường có nồng độ Mn2+ thấp thì γ- PGA có đồng phân dạng D-glutamate 40% (Thorne et al. Tính chất vật lý Bảng 2.

Tính chất vật lý, hóa học của gamma-polyglutamic acid Công thức phân tử (C5 H7 NO3) n Công thức cấu tạo 50 kDa - 2000 kDa tùy mức độ trùng hợp Trọng lượng phân tử khác nhau - Gamma-polyglutamic acid (γ-PGA) Tên gọi khác nhau - Poly [imino [1-carboxy-4-oxo-1, 4-butanediyl]] - Là một polymer tự nhiên - Tinh thể màu trắng, không màu, không mùi, không vị Tính chất vật lí - có khả năng phân hủy sinh học - Hòa tan trong nước - Không độc và có thể ăn được - Có khả năng dẫn diện - Nhận biết γ-PGA bằng xanh methylene Tính chất hóa học - không bị enzyme protease phân hủy - Có phản ứng được với kim loại để tạo muối n 5 2. Ứng dụng của gamma-polyglutamic acid Ngày nay con người có nhu cầu hướng tới sử dụng các hợp chất có nguồn gốc từ tự nhiên do nó có ưu điểm là an toàn với sức khỏe và thân thiện với môi trường và γ-PGA là một trong số đó. γ-PGA đã được nghiên cứu nhắm tối ưu hóa các phương pháp sản xuất với quy trình ít tốn kém, nâng cao năng suất, hạ giá thành sản phẩm và sử dụng nguồn cơ chất đơn giản, dễ kiếm để có thể sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm, hóa mỹ phẩm, y học, xử lý nước thải, sản phẩm vệ sinh, nông nghiệp, chăn nuôi và các lĩnh vực khác. Ứng dụng trong y học γ-PGA được sử dụng trong liệu pháp gen, thuốc điều trị ung thư và các sản phẩm da nhân tạo để chữa bỏng, γ-PGA còn được dùng tạo ra các màng tổng hợp để chống lại sự bám hút chặt giữa tế bào bình thường với lớp mô bị tổn thương do tai nạn hay quá trình phẫu thuật.( Furuta et al.

a) Chất vận chuyển thuốc γ-PGA được quan tâm về khả năng vận chuyển thuốc do có tính tương thích sinh học và phân hủy sinh học. Trong chuỗi peptide của γ-PGA có nhóm carboxyl tạo điểm gắn cho hóa trị liệu, do đó khiến thuốc hòa tan nhiều hơn và dễ dàng kiểm soát hơn. Liên kết γ-PGA và thuốc có thể xâm nhập vào vị trí khối u và giải phóng thuốc, sau đó γ-PGA bị phân hủy thành acid glutamic có thể thâm nhập vào quá trình trao đổi chất của tế bào và được bài tiết qua thận (Li et al, 1998). Enzym là chất xúc tác sinh học thường dễ bị ảnh hưởng bởi các tác nhân môi trường trong đó có các tia phóng xạ (Dengyi et al.,1993; Saha et al.

Để giảm thiểu các tác nhân và nâng cao hiệu quả sử dụng enzym. Enzym thường được kết hợp với các chất gắn, hay các hợp chất bảo vệ khác nhau để tránh khỏi các tác nhân gây ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme. Mỗi loại n 6 hợp chất dùng để gắn enzym đều có những ưu và nhược điểm riêng (Dengyi et al.,1993; Saha et al. Hiện nay γ-PGA đang được nghiên cứu để gắn vào enzym do chúng có ưu điểm là có thể phân hủy sinh học, không ảnh hưởng tới môi trường)(Miyachi et al.,1996; Sakamoto et al.

Ở Việt Nam chưa có nhiều các nghiên cứu về ảnh hưởng của các tia bức xạ đến enzym, cũng như vai trò của γ-PGA trong việc bảo vệ hoạt tính enzym chống lại các tác nhân do các tia bức xạ gây nên. b) Chất kết dính sinh học Chất kết dính sinh học được sử dụng trong việc cầm máu, gắn kết các vết rò rỉ khí ở phổi, chống lại sự bám dính giữa tế bào bình thường với lớp mô bị tổn thương do tai nạn hay quá trình phẫu thuật. Các chất kết dính phẫu thuật hiện tại đang được sử dụng như fibrin nhưng có độ bám dính mô kém. Otani và cộng sự 1999 đã cho rằng liên kết giữa gelatin và γ-PGA có thể thay thế cho các chất kết dính có nguồn gốc fibrin và có hiệu quả hơn trong việc gắn kết vết rò rỉ trên phổi so với chất kết dính có nguồn ngốc từ fibrin (Otani et al.

c) Chất mang gen chuyển Dekie và cộng sự năm 2000 đã chỉ ra rằng liên kết giữa DNA và γ-PGA tương đối ổn định đối với albumin huyết thanh. γ-PGA dễ dàng tạo ra các liên kết với DNA, kết quả là điện tích bề mặt và kích thước của DNA giảm như vậy có thể bảo vệ DNA không bị phân hủy bởi enzyme Dnase. γ-PGA mang gen chuyển giúp cho DNA không bị phân hủy và tăng hiệu quả chuyển gene (Dekie et al. d) Chất phụ tá vaccine Năm 2006, Sung và cộng sự đã đánh giá rằng γ-PGA như một chất phụ tá cho vaccine, người ta đã phát hiện ra tổ hợp các thành phần gây miễn dịch chứa γ-PGA cho 1 đáp ứng miễn dịch chống lại S.

epiderrnidis, staphylococcus và các loài liên quan. γ-PGA được chỉ ra có khả năng kích n 7 thích cơ thể sinh kháng thể cao thậm trí khi được sử dụng với một kháng nguyên có tính gây miễn dịch yếu. Các phân tử γ-PGA có khả năng phân hủy sinh học là các thể mang vận chuyển rất tốt vaccine tới các khối u, chúng có thể phát tán các protein kháng nguyên tới các tế bào trình diện kháng nguyên (APCs) và đưa ra các đáp ứng miễn dịch hiệu lực dựa trên các kháng nguyên đặc hiệu của tế bào lympho T. Kháng nguyên được chấp nhận bởi các tế bào trình diện kháng nguyên còn được tăng cường bằng sự liên kết với các phân tử polyme (Sung et al.

Vaccine này có ưu điểm là khi tiêm dưới da không tạo vết sưng tại vị trí tiêm như các vaccine thông thường khác (Uto et al. Ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm Các nhà nghiên cứu đã chứng minh được γ-PGA có thể ứng dụng làm chất bảo quản đông lạnh mà không gây ảnh hưởng tới sức khỏe do đặc tính của γ-PGA là một polyme sinh học không gây độc cho người, γ- PGA còn sử dụng làm chất ổn định mà không làm ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩm cũng như tới sức khỏe con người. Năm 2000, Sakai và cộng sự cho rằng việc bổ sung PGA vào đồ uống để làm giảm vị đắng của một số đồ uống (chứa acid amin, peptide, quinine, cafeine…),và làm tăng vị ngon của đồ uống (Sakai et al. Ngoài ra, khi bổ sung γ-PGA còn có khả năng liên kết với một số ion hóa trị 2 như Mn2+ ( ổn định thần kinh), Cu2+ (thúc đẩy sự hấp thu và sử dụng sắt để tạo thành hemoglobin và hồng cầu), Mg2+ (tác dụng ức chế các phản ứng thần kinh và cơ)…tạo muối tan giúp cơ thể tăng tốc độ hấp thụ các chất và khoáng chất trong ruột non giúp cho cơ thể hấp thụ tối các chất dinh dưỡng cung cấp khoáng chất cho cơ thể (Tanimoto et al.