Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây Keo tai tượng (Acacia mangium Willd.) là loài cây gỗ lớn nhập nội vào Việt Nam từ những năm đầu thập niên 1980 và 1990. Nhờ đặc tính sinh trưởng nhanh, khả năng cố định đạm cải tạo đất và chất lượng gỗ phù hợp cho sản xuất ván dăm, bột giấy, gỗ xẻ gia dụng, diện tích rừng trồng Keo tai tượng đã mở rộng nhanh chóng tại các vùng Tây Bắc, Đông Bắc, Bắc Trung Bộ, Tây Nguyên và Duyên hải miền Trung, đạt trên 600.000 ha vào năm 2006 (theo số liệu từ Cục Lâm nghiệp). Tuy nhiên, việc gia tăng quy mô diện tích thuần loài dẫn đến sự bùng phát của nhiều loại dịch bệnh nguy hiểm. Điển hình như bệnh phấn hồng (Pink disease) gây hại tại Bầu Bàng (Bình Dương), Đạ Tẻh (Lâm Đồng) với tỷ lệ nhiễm từ 7% đến 59%, và tại Ngọc Hồi (Kon Tum) với tỷ lệ chết ngọn lên đến 90%.

Gần đây, tại nhiều vùng rừng trồng keo trọng điểm xuất hiện bệnh chết héo ngọn (chết ngược) do nấm Ceratocystis sp. gây ra. Bệnh tiến triển ngầm trong hệ mạch và rất khó phát hiện ở giai đoạn đầu. Việc áp dụng các biện pháp hóa học trên diện tích rừng rộng lớn không mang lại tính khả thi cao, chi phí tốn kém và gây ô nhiễm môi trường sinh thái nghiêm trọng. Xu hướng quản lý dịch hại bền vững hiện nay là ứng dụng công nghệ sinh học, tuyển chọn các chủng vi sinh vật nội sinh có khả năng đối kháng mầm bệnh hoặc kích kháng cho cây chủ.

Tại tỉnh Thái Nguyên, nơi có diện tích đất đồi núi chiếm 48,4% diện tích tự nhiên và Keo tai tượng được gây trồng phổ biến tại các huyện Định Hóa, Đồng Hỷ, Đại Từ, Phú Lương, việc tìm kiếm giải pháp sinh học ngăn chặn nấm Ceratocystis sp. là yêu cầu cấp thiết. Đề tài khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Minh Hải tập trung giải quyết vấn đề này với các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể:

  1. Phân lập được các chủng nấm nội sinh trên cây Keo tai tượng ở các độ tuổi khác nhau và trên các bộ phận khác nhau của cây (rễ, thân/cành, lá).
  2. Đánh giá được khả năng ức chế nấm gây bệnh Ceratocystis sp. của các chủng nấm nội sinh đã phân lập.
  3. Tuyển chọn được các chủng nấm nội sinh có khả năng kháng bệnh chết héo do nấm Ceratocystis sp. gây ra.
  4. Mô tả được đặc điểm hình thái khuẩn lạc và cấu trúc vi học của các chủng nấm nội sinh có hiệu lực ức chế nấm gây bệnh mạnh.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài gồm:

  • Đối tượng nghiên cứu: Các bộ phận rễ, cành, lá thu thập từ các cây Keo tai tượng khỏe mạnh ở nhiều độ tuổi; nấm gây bệnh chết héo Ceratocystis sp. (chủng VH11, chủng độc lực mạnh nhất được Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng phân lập tại Thái Nguyên); các chủng nấm nội sinh phân lập được từ mô cây Keo tai tượng.
  • Phạm vi không gian: Mẫu thực vật được thu thập tại rừng trồng Keo tai tượng thuộc địa bàn huyện Đồng Hỷ, tỉnh Thái Nguyên. Quá trình xử lý, phân lập, nuôi cấy và thử nghiệm hiệu lực sinh học được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng – Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.
  • Phạm vi thời gian: Đề tài được thực hiện trong thời gian từ ngày 07/01/2016 đến ngày 30/03/2016.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu dựa trên cơ sở khoa học về vi sinh vật nội sinh thực vật (endophytes). Đây là những vi sinh vật cư trú bên trong các mô tế bào của cây chủ nhưng không gây ra bất kỳ triệu chứng bệnh nào, đồng thời thiết lập mối quan hệ cộng sinh tương hỗ. Vi sinh vật nội sinh nhận nguồn dinh dưỡng và môi trường cư trú ổn định từ cây chủ, ngược lại chúng tổng hợp các hoạt chất trao đổi chất thứ cấp, chất kháng sinh giúp cây chống lại sâu bệnh, tăng khả năng chịu hạn và kích thích sinh trưởng. Tác giả tổng hợp cơ sở dữ liệu từ các công trình nghiên cứu đi trước về vi sinh vật nội sinh trên cây lâm nghiệp tại Việt Nam như nghiên cứu của Nguyễn Lân Dũng, Vũ Văn Định, Phạm Quang Thu, Nguyễn Hoàng Nghĩa, cũng như các nghiên cứu quốc tế của Caroline Mohammed, Jinwi Kim, Kile và Roux về bệnh chết héo cây thân gỗ do Ceratocystis spp.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm trong phòng thí nghiệm được tiến hành theo các quy trình chuẩn hóa:

Thu thập và xử lý mẫu thực vật

Mẫu rễ, cành, lá được thu thập từ 12 cây Keo tai tượng khỏe mạnh, sinh trưởng bình thường ở các cấp tuổi khác nhau tại huyện Đồng Hỷ, tỉnh Thái Nguyên. Mẫu được rửa sạch dưới vòi nước cất vô trùng, đóng gói riêng biệt vào túi chuyên dụng, ghi rõ ký hiệu tuổi cây và vị trí lấy mẫu trước khi chuyển về phòng thí nghiệm.

Quy trình phân lập nấm nội sinh

  • Khử trùng bề mặt mô thực vật: Mẫu rễ, cành, lá khỏe mạnh được rửa sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm khử trùng bề mặt bằng cồn 70° trong thời gian thích hợp, sau đó rửa lại 2 đến 3 lần bằng nước cất vô trùng để loại bỏ triệt để vi sinh vật hoại sinh bám ngoài bề mặt vỏ.
  • Phân lập và nuôi cấy thuần khiết: Mô cây sau khi khử trùng được cắt thành từng đoạn nhỏ có kích thước 5–7 mm bằng dao vô trùng, đặt vào đĩa petri chứa môi trường thạch 1/2 PDA. Các đĩa mẫu được ủ trong tủ định ôn ở nhiệt độ 28°C trong 2–3 ngày cho đến khi hệ sợi nấm phát triển ra môi trường. Tiến hành tách đỉnh sợi nấm và cấy chuyền nhiều lần sang môi trường PDA tiêu chuẩn cho đến khi thu được dòng nấm nội sinh thuần khiết.
  • Thành phần môi trường nuôi cấy:
    • Môi trường 1/2 PDA: 100 g khoai tây, 10 g dextrose, 18 g agar, 1.000 ml nước cất.
    • Môi trường PDA: 200 g khoai tây, 20 g dextrose, 18 g agar, 1.000 ml nước cất.
    • Môi trường và dụng cụ được khử trùng bằng nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121°C (áp suất 1 atm) trong 30 phút.

Phương pháp đánh giá hiệu lực đối kháng

Hiệu lực ức chế nấm gây bệnh Ceratocystis sp. (chủng VH11) được xác định bằng phương pháp nuôi cấy kép (dual culture) đồng thời trên đĩa thạch theo phương pháp của Singh và Tripathi (1999).

Dịch huyền phù bào tử nấm bệnh Ceratocystis sp. được pha loãng ở nồng độ chuẩn. Dùng pipet hút 30 µl dịch bào tử nấm bệnh phân tán đều trên bề mặt đĩa thạch PDA. Cấy một miếng thạch chứa sợi nấm nội sinh cần thử nghiệm vào chính giữa đĩa petri, quấn kín miệng đĩa bằng màng paraffin. Mỗi chủng nấm nội sinh được bố trí thử nghiệm trên 6 đĩa lặp lại 3 lần, nuôi trong tủ định ôn ở nhiệt độ 25°C.

Sau 10 ngày nuôi cấy, tiến hành đo đạc bán kính khuẩn lạc và xác định kích thước vòng ức chế theo công thức:

$$V = D - d$$

Trong đó:

  • $V$: Đường kính trung bình của vòng ức chế (mm).
  • $D$: Khoảng cách trung bình tính từ tâm của khuẩn lạc nấm nội sinh đến mép trong của hệ sợi nấm gây bệnh (mm).
  • $d$: Bán kính trung bình của hệ sợi nấm nội sinh (mm).

Hiệu lực đối kháng được phân chia thành 5 cấp theo thang đánh giá của Phạm Quang Thu (2010):

Cấp hiệu lực Giá trị vòng ức chế ($V$) Mức độ ức chế Ký hiệu
Cấp 1 $V > 20\text{ mm}$ Rất mạnh Rm
Cấp 2 $20\text{ mm} \ge V > 10\text{ mm}$ Mạnh M
Cấp 3 $10\text{ mm} \ge V > 5\text{ mm}$ Trung bình Tb
Cấp 4 $5\text{ mm} \ge V > 1\text{ mm}$ Yếu Y
Cấp 5 $V \le 1\text{ mm}$ Không có hiệu lực O

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Tác giả trình bày tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ sự phát triển nhanh chóng của diện tích rừng trồng Keo tai tượng trên phạm vi toàn quốc và những tổn thất do bệnh hại gây ra, đặc biệt là bệnh chết héo do nấm Ceratocystis sp. Tác giả nhấn mạnh việc sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật là không khả thi trên diện tích quy mô lâm nghiệp và gây hại hệ sinh thái. Khóa luận xác lập mục tiêu phân lập, tuyển chọn các chủng nấm nội sinh có hoạt tính đối kháng cao tại Thái Nguyên, cung cấp cơ sở khoa học cho công tác phòng trừ sinh học và định hướng chọn tạo giống keo kháng bệnh.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết toàn diện ba nhóm nội dung chính:

  • Tình hình nghiên cứu cây Keo tai tượng: Tổng hợp các đặc tính lâm sinh, phân bố, giá trị kinh tế của Acacia mangium, quá trình nhập nội từ Australia, Papua New Guinea, Indonesia và kết quả khảo nghiệm xuất xứ tại các vùng sinh thái ở Việt Nam.
  • Tình hình nghiên cứu bệnh hại keo và vi sinh vật nội sinh: Phân tích các công trình nghiên cứu bệnh chết héo do nấm Ceratocystis fimbriata và các loài liên quan trên thế giới (Brazil, Congo, Colombia, Indonesia) và tại Việt Nam. Điểm lại các nghiên cứu ứng dụng xạ khuẩn Streptomyces, nấm Trichoderma, vi khuẩn nội sinh trong phòng trừ bệnh thối cổ rễ, đốm lá khô ngọn trên cây thông và keo lai.
  • Điều kiện tự nhiên và kinh tế - xã hội khu vực nghiên cứu: Mô tả chi tiết vị trí địa lý, địa hình đồi núi chiếm 48,4%, mạng lưới thủy văn sông Cầu, sông Công, các nhóm đất chính (đất đỏ vàng trên phiến thạch sét chiếm 38,65%, đất dốc tụ, đất phù sa) cùng đặc điểm khí hậu nhiệt đới gió mùa tại tỉnh Thái Nguyên.

Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết địa điểm thu mẫu tại huyện Đồng Hỷ, thời gian thực nghiệm từ tháng 1 đến tháng 3 năm 2016 tại Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng. Mô tả cụ thể các hóa chất, dụng cụ khử trùng, công thức pha chế môi trường 1/2 PDA và PDA, quy trình cấy chuyền đỉnh sợi nấm và kỹ thuật đánh giá đối kháng bằng phương pháp nuôi cấy kép đồng thời trên đĩa thạch theo Singh và Tripathi (1999). Thiết lập công thức tính toán độ rộng vòng kháng $V = D - d$ và tiêu chuẩn phân cấp 5 mức độ hiệu lực của Phạm Quang Thu (2010). Đồng thời, đề xuất các biện pháp phòng trừ bệnh tích hợp cho vườn giống, vườn ươm và rừng trồng.

Phần 4: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương thực nghiệm tập trung vào hai nội dung cốt lõi:

  • Kết quả phân lập nấm nội sinh: Từ 12 cây Keo tai tượng lấy mẫu tại Đồng Hỷ, tác giả phân lập được tổng cộng 45 chủng nấm nội sinh trên cả 3 bộ phận:
    • Bộ phận lá: Phân lập được 26 chủng (chiếm tỷ lệ cao nhất). Đa số khuẩn lạc có màu trắng, một số chủng có màu sắc đặc trưng như N5L8 (màu xanh đen), N15L3 (màu xám đen). Một số chủng tiết sắc tố làm biến đổi màu thạch nuôi cấy như N12L7 và N5L8 làm đổi màu thạch thành xanh đen, N9L10 và N22L3 làm đổi màu xám đen, N11L4 làm đổi màu nâu đen.
    • Bộ phận cành: Phân lập được 15 chủng. Có 8 chủng màu trắng, 3 chủng màu trắng xám, 1 chủng màu xám đen. Đáng chú ý, có 2 chủng cấy chuyền không phát triển sợi nấm là N23C2 và N23C3.
    • Bộ phận rễ: Phân lập được 4 chủng gồm N17R8 (màu trắng), N19R12 (màu vàng), N20R8 (màu xám) và N31R8 (sợi vàng nhạt, làm mặt thạch chuyển màu hồng).
  • Kết quả đánh giá hiệu lực đối kháng: Trong 31 chủng đại diện được đưa vào thử nghiệm khả năng ức chế nấm bệnh Ceratocystis sp. (chủng VH11), có 28 chủng không thể hiện hoạt tính kháng bệnh ($V = 0\text{ mm}$, chiếm tỷ lệ 90,32%). Chỉ có 3 chủng thể hiện khả năng ức chế:
    • Chủng N28C8 (phân lập từ cành): Đạt hiệu lực ức chế rất mạnh với đường kính vòng kháng trung bình $V = 36,5\text{ mm}$.
    • Chủng N31R8 (phân lập từ rễ): Đạt hiệu lực ức chế mạnh với đường kính vòng kháng trung bình $V = 12,0\text{ mm}$.
    • Chủng N25L2 (phân lập từ lá): Đạt hiệu lực ức chế trung bình với đường kính vòng kháng trung bình $V = 9,0\text{ mm}$.
  • Mô tả đặc điểm hình thái của 3 chủng nấm nội sinh ưu tú:
    • Cả 3 chủng đều có quy luật phát triển chung: Trong 24 giờ đầu sau khi cấy kép, nấm bệnh vẫn phát triển bình thường; sau 24 giờ, hệ sợi nấm nội sinh tăng sinh nhanh chóng, lan rộng phủ kín và ức chế hoàn toàn sự phát triển của hệ sợi nấm bệnh Ceratocystis sp.
    • Chủng N25L2: Khuẩn lạc màu trắng đục, hệ sợi mọc xốp như bông. Dưới kính hiển vi quang học, sợi nấm ngắn, đan xen nhau, phát triển dọc theo trục chính tạo sợi lớn và phân nhánh nhỏ.
    • Chủng N28C8: Khuẩn lạc màu trắng đục, mọc dày như bông. Dưới kính hiển vi, các sợi nấm mảnh đan xen chặt chẽ và có xu hướng cuộn lại tạo thành các búi sợi hình bầu dục.
    • Chủng N31R8: Khuẩn lạc màu trắng vàng, mọc dạng xòe như hoa, làm môi trường thạch chuyển sang màu hồng. Dưới kính hiển vi, hệ sợi nấm dài, đan xen và phân nhánh nhiều.

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tóm tắt các phát hiện chính về số lượng chủng phân lập, mức độ phân bố nấm nội sinh theo cơ quan cây chủ và danh tính 3 chủng có khả năng kháng bệnh (N28C8, N31R8, N25L2). Tác giả thẳng thắn chỉ ra các giới hạn của nghiên cứu và đưa ra các đề xuất tiếp theo cho công tác hoàn thiện định loại và ứng dụng thực tế.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu mang lại những kết quả định lượng cụ thể về tập đoàn nấm nội sinh trên cây Keo tai tượng tại Thái Nguyên và tiềm năng ứng dụng đối kháng sinh học:

Chỉ tiêu theo dõi Kết quả định lượng trong nghiên cứu
Tổng số cây điều tra lấy mẫu 12 cây Keo tai tượng ở các cấp tuổi khác nhau tại huyện Đồng Hỷ
Tổng số chủng nấm nội sinh phân lập 45 chủng thuần khiết
Phân bố chủng nấm theo bộ phận lá 26 chủng (chiếm 57,78% tổng số chủng)
Phân bố chủng nấm theo bộ phận cành 15 chủng (chiếm 33,33% tổng số chủng, có 2 chủng thoái hóa không mọc)
Phân bố chủng nấm theo bộ phận rễ 4 chủng (chiếm 8,89% tổng số chủng)
Tỷ lệ chủng không kháng bệnh 28 / 31 chủng thử nghiệm (chiếm 90,32%)
Số lượng chủng có khả năng kháng nấm bệnh 3 chủng (N28C8, N31R8, N25L2)

Bảng tổng hợp đặc tính sinh học và hiệu lực đối kháng của các chủng nấm nội sinh ưu tú:

Ký hiệu chủng Bộ phận phân lập Đặc điểm hệ sợi đại thể Đặc điểm vi học (soi hiển vi) Vòng ức chế trung bình ($V$) Phân cấp hiệu lực
N28C8 Cành cây Màu trắng đục, mọc dày như bông Sợi đan xen, cuộn lại thành hình bầu dục 36,5 mm Rất mạnh (Rm)
N31R8 Rễ cây Màu trắng vàng, mọc như hoa, làm thạch hồng Sợi dài, phân nhánh, đan xen nhau 12,0 mm Mạnh (M)
N25L2 Lá cây Màu trắng đục, sợi mọc như bông Sợi ngắn, trục sợi lớn phân nhánh nhỏ 9,0 mm Trung bình (Tb)

Từ các kết quả thực nghiệm, tác giả đã đóng góp hệ thống giải pháp kỹ thuật phòng trừ bệnh chết héo do nấm Ceratocystis sp.:

  • Đối với vườn giống lấy hom: Khi xuất hiện bệnh, tạm ngừng thu hái cành hom. Tiêu hủy toàn bộ thân, cành, rễ cây bị nhiễm bệnh bằng cách đào hố đốt; rải vôi bột khử trùng với liều lượng 0,5 kg/hố, xới đều và phơi ải từ 15 đến 20 ngày trước khi trồng dặm. Định kỳ tưới chế phẩm Trichoderma quanh gốc cho toàn bộ vườn cây đầu dòng.
  • Đối với vườn ươm cây con: Xử lý ruột bầu và cây giống bằng phân vi sinh đa chủng (chứa vi khuẩn cố định đạm, phân giải lân và vi sinh vật đối kháng nấm). Khi phát hiện cây con nhiễm bệnh, lập tức gom đốt tiêu hủy.
  • Đối với rừng trồng: Áp dụng các biện pháp lâm sinh phòng ngừa cơ giới: tránh gây xây xát thân cây, tuyệt đối không tỉa cành vào mùa mưa. Khi tỉa cành phải dùng cưa chuyên dụng và bôi thuốc chống nấm vào vết cắt. Phòng trừ côn trùng đục thân và bón phân cân đối; khi phát hiện cây bệnh phải đào toàn bộ gốc rễ đem đốt trong hố sâu.

Về mặt đóng góp khoa học, nghiên cứu đã chứng minh bằng số liệu thực nghiệm rằng nấm nội sinh trong mô cây Keo tai tượng có sự phân hóa mạnh mẽ theo bộ phận cơ quan, trong đó lá là nơi tập trung đa dạng chủng nhất nhưng chủng có hoạt tính đối kháng Ceratocystis sp. mạnh nhất lại cư trú ở cành (N28C8) và rễ (N31R8). Đây là dẫn liệu mới tại địa bàn Thái Nguyên, bổ sung cho hướng nghiên cứu kiểm soát sinh học bệnh cây rừng thay thế biện pháp hóa học.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo

Tác giả đã chỉ ra 4 hạn chế chính chưa thể giải quyết trong phạm vi khóa luận đại học:

  • Chưa định loại học phân loại: Do hạn chế về thời gian và điều kiện kỹ thuật, nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc mô tả hình thái đại thể và vi học sợi nấm, chưa tiến hành định danh chính xác tên loài khoa học của 3 chủng nấm nội sinh ưu tú (N28C8, N31R8, N25L2) bằng các phương pháp phân loại chuyên sâu hoặc chỉ thị sinh học phân tử (giải trình tự DNA vùng gen ITS).
  • Chưa nghiên cứu sâu các đặc tính sinh học: Đề tài chưa khảo sát được các yếu tố sinh thái ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của các chủng nấm có hiệu lực cao như ngưỡng nhiệt độ thích hợp, dải pH tối ưu, tốc độ phát triển hệ sợi theo thời gian và mật độ bào tử.
  • Chưa thử nghiệm thực tế ngoài hiện trường: Do hạn chế về thời gian thực tập và nguồn kinh phí nghiên cứu, đề tài chưa thể đưa 3 chủng nấm đối kháng mạnh vào thử nghiệm lây nhiễm thực tế trong điều kiện nhà kính, vườn ươm hoặc rừng trồng bị nhiễm bệnh.
  • Quy mô khảo sát giới hạn: Mẫu nghiên cứu mới chỉ thu thập trên 12 cá thể cây Keo tai tượng tại huyện Đồng Hỷ, tỉnh Thái Nguyên, chưa đại diện cho các vùng lập địa và các dòng vô tính khác nhau của loài cây này.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu hữu ích cho:

  • Sinh viên và học viên chuyên ngành Lâm nghiệp, Bảo vệ thực vật, Công nghệ sinh học: Cung cấp quy trình chi tiết, từng bước từ khâu xử lý mẫu tươi, khử trùng mô thực vật bằng cồn 70°, kỹ thuật phân lập nấm nội sinh thuần khiết trên môi trường 1/2 PDA và PDA, đến phương pháp nuôi cấy kép đồng thời để đo đường kính vòng kháng nấm.
  • Các nhà nghiên cứu bệnh học lâm nghiệp: Cung cấp dẫn liệu thực nghiệm về mối quan hệ giữa vi sinh vật nội sinh và nấm bệnh Ceratocystis sp. Chủng N28C8 với vòng kháng lên tới 36,5 mm là vật liệu sinh học giá trị để tiếp tục nghiên cứu chiết tách các hoạt chất kháng sinh tự nhiên hoặc phối chế thành chế phẩm sinh học bảo vệ rừng.
  • Cán bộ kỹ thuật lâm nghiệp tại các vườn ươm và ban quản lý rừng: Tham khảo trực tiếp quy trình xử lý hố tiêu hủy cây chết héo bằng vôi bột (0,5 kg/hố), kỹ thuật bôi vết cắt tỉa cành và biện pháp sử dụng chế phẩm sinh học nhằm quản lý dịch bệnh bền vững.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nấm nội sinh lại tập trung nhiều nhất ở bộ phận lá của cây Keo tai tượng?

Trong tổng số 45 chủng phân lập được, có tới 26 chủng xuất hiện ở lá (chiếm 57,78%), trong khi cành có 15 chủng và rễ chỉ có 4 chủng. Nguyên nhân do lá cây là cơ quan có diện tích tiếp xúc rộng lớn với môi trường khí quyển, có hệ thống khí khổng phong phú tạo điều kiện cho các bào tử nấm xâm nhập và định cư trong mô thịt lá. Đồng thời, lá là trung tâm quang hợp tổng hợp nhiều chất hữu cơ hòa tan, cung cấp nguồn dinh dưỡng dồi dào cho nấm nội sinh phát triển.

2. Chủng nấm nội sinh nào có khả năng ức chế nấm Ceratocystis sp. mạnh nhất và hiệu lực đạt bao nhiêu?

Chủng nấm có khả năng ức chế mạnh nhất là N28C8, được phân lập từ cành cây Keo tai tượng. Trong thử nghiệm nuôi cấy kép trên môi trường PDA sau 10 ngày, chủng này tạo ra đường kính vòng ức chế trung bình đạt $36,5\text{ mm}$, thuộc cấp ức chế "Rất mạnh" ($V > 20\text{ mm}$) theo thang phân loại của Phạm Quang Thu (2010).

3. Có phải mọi chủng nấm nội sinh phân lập được đều có khả năng kháng bệnh không?

Không. Kết quả thử nghiệm trên 31 chủng đại diện cho thấy có tới 28 chủng hoàn toàn không thể hiện hoạt tính kháng nấm Ceratocystis sp. ($V = 0\text{ mm}$, chiếm tỷ lệ 90,32%). Chỉ có 3 chủng thể hiện tính đối kháng (chiếm 9,68%), gồm N28C8 ($36,5\text{ mm}$ - rất mạnh), N31R8 ($12,0\text{ mm}$ - mạnh) và N25L2 ($9,0\text{ mm}$ - trung bình). Điều này khẳng định hoạt tính sinh học của nấm nội sinh mang tính chuyên biệt rất cao theo từng chủng.

4. Trong 24 giờ đầu sau khi cấy chung trên đĩa thạch, hiện tượng gì đã diễn ra giữa nấm nội sinh và nấm bệnh?

Theo mô tả thực nghiệm của tác giả, trong 24 giờ đầu tiên sau khi cấy chuyền, nấm gây bệnh Ceratocystis sp. vẫn sinh trưởng và phát triển bình thường trên môi trường PDA cùng với nấm nội sinh. Sự ức chế chỉ diễn ra rõ rệt sau mốc 24 giờ, khi các chủng nấm nội sinh ưu tú tăng sinh mạnh mẽ, hệ sợi nấm phát triển vượt trội phủ kín và bắt đầu ngăn chặn sự phát triển của hệ sợi nấm bệnh.

5. Biện pháp xử lý cụ thể được tác giả đề xuất đối với cây Keo tai tượng bị bệnh chết héo trong vườn giống là gì?

Tác giả đề xuất phải lập tức tạm ngừng thu hái cành dâm hom; thu gom toàn bộ thân, cành, lá và đào sạch rễ của cây bị bệnh tập trung vào hố để đốt tiêu hủy hoàn toàn. Hố sau khi đốt phải được rắc vôi bột để khử trùng và tiêu diệt mầm bệnh với liều lượng 0,5 kg/hố, xới xáo đất đều và để ải trong khoảng 15–20 ngày trước khi trồng dặm. Đồng thời, phải tưới định kỳ chế phẩm Trichoderma quanh gốc cho toàn bộ các cây còn lại trong vườn giống.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Lê Minh Hải đã thực hiện phân lập thành công 45 chủng nấm nội sinh từ rễ, cành, lá của 12 cây Keo tai tượng tại huyện Đồng Hỷ, tỉnh Thái Nguyên. Qua thử nghiệm đối kháng nuôi cấy kép, đề tài đã tuyển chọn được 3 chủng có khả năng ức chế nấm gây bệnh chết héo Ceratocystis sp., đặc biệt phát hiện chủng N28C8 phân lập từ cành có hiệu lực kháng nấm rất mạnh với đường kính vòng ức chế đạt $36,5\text{ mm}$. Công trình cung cấp luận cứ thực nghiệm và quy trình phòng trừ sinh học có giá trị ứng dụng cao cho công tác quản lý bệnh cây rừng bền vững tại Việt Nam.