Nghiên cứu xây dựng mô hình sàng lọc ảo các chất ức chế bơm ngược MRP4 được mã hóa bởi gen ABCC4

Nghiên cứu mô hình sàng lọc ảo chất ức chế bơm ngược MRP4 (ABCC4). Phân tích và tìm kiếm các hợp chất tiềm năng, ứng dụng trong y học.

• Tác giả: Nguyễn Vũ Thụy Vy
• Người hướng dẫn: Gs. Thái Khắc Minh
• Trường học: Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Dược Phẩm Và Bào Chế Thuốc
• Đề tài: Nghiên cứu xây dựng mô hình sàng lọc ảo các chất ức chế bơm ngược MRP4 được mã hoá bởi gen ABCC4
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1.1. Bơm đa kháng thuốc MRP4 được mã hoá bởi gen ABCC4
• 1.1.1.1. Họ bơm ngược ABC (ATP-Binding Cassette)
• 1.1.1.2. Cấu trúc và vị trí phân bố của bơm ngược MRP4
• 1.1.1.3. Cơ chế vận chuyển của bơm ngược MRP4
• 1.1.1.4. Cơ chất và tác động của bơm ngược MRP4 trên lâm sàng
• 1.1.1.5. Phương pháp xác định cơ chất và chất ức chế bơm ngược in vitro
• 1.1.2. Khám phá thuốc dưới sự hỗ trợ của máy tính
• 1.1.2.1. Khám phá thuốc dựa trên cấu trúc mục tiêu
• 1.1.2.2. Khám phá thuốc dựa trên phối tử
• 1.1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước các chất ức chế bơm MRP4
• 1.1.3.1. Các chất ức chế bơm ngược MRP4
• 1.1.3.2. Các nghiên cứu in silico tìm kiếm các chất ức chế bơm ngược MRP4
• 1.2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.2.1. Thiết kế nghiên cứu
• 1.2.2. Đối tượng nghiên cứu. Cơ sở dữ liệu xây dựng mô hình sàng lọc dựa trên phối tử
• 1.2.3. Cấu trúc bơm ngược MRP4
• 1.2.4. Ngân hàng dữ liệu sử dụng để sàng lọc
• 1.2.5. Các phần mềm máy tính sử dụng trong nghiên cứu
• 1.2.6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 1.2.7. Quy trình nghiên cứu
• 1.2.8. Phương pháp nghiên cứu, công cụ đo lường và thu thập số liệu
• 1.2.9. Chuẩn bị cơ sở dữ liệu
• 1.2.10. Xây dựng mô hình pharmacophore
• 1.2.11. Quy trình xây dựng mô hình 2D – QSAR
• 1.2.12. Phương pháp xây dựng mô hình docking phân tử
• 1.2.13. Ứng dụng sàng lọc ảo và mô phỏng động lực học phân tử
• 1.2.13.1. Mô phỏng động lực học phân tử (MD)
• 1.3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 1.3.1. Kết quả mô hình 3D – pharmacophore
• 1.3.2. Kết quả mô hình 2D – QSAR
• 1.3.3. Kết quả mô hình 2D – QSAR dự đoán hoạt tính ức chế bơm ngược MRP4 trên cơ chất ngoại sinh
• 1.3.4. Kết quả mô hình 2D – QSAR dự đoán hoạt tính ức chế bơm ngược MRP4 trên cơ chất nội sinh
• 1.3.5. Kết quả mô hình docking phân tử
• 1.3.5.1. Đánh giá cấu trúc bơm ngược MRP4. Kết quả re – docking và chọn khoang gắn kết
• 1.3.5.2. Kết quả mô hình docking phân tử
• 1.3.5.3. Đánh giá mô hình docking
• 1.3.6. Kết quả sàng lọc qua mô hình pharmacophore, 2D – QSAR và docking phân tử các chất ức chế bơm ngược MRP4
• 1.3.7. Kết quả mô phỏng động lực học phân tử và dự đoán ADMET các chất ức chế bơm ngược MRP4 tiềm năng
• 1.3.7.1. Kết quả mô phỏng động lực học phân tử các chất ức chế bơm ngược MRP4 tiềm năng
• 1.3.7.2. Dự đoán ADMET các chất ức chế bơm MRP4 tiềm năng sau sàng lọc ảo
• 1.3.8. Các mô hình sàng lọc ảo tìm kiếm các chất ức chế trên bơm ngược MRP4
• 1.3.9. Sàng lọc ảo các chất ức chế bơm MRP4 tiềm năng
• 2. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Sàng Lọc Ảo Chất Ức Chế MRP4

Nghiên cứu tập trung vào bơm ngược MRP4, một protein đa kháng thuốc thuộc họ ABC, được mã hóa bởi gen ABCC4. Protein này biểu hiện cao ở tiểu cầu và một số tế bào ung thư, có khả năng vận chuyển nhiều cơ chất nội sinh và ngoại sinh. Điều này ảnh hưởng đến hiệu quả của thuốc điều trị và liên quan đến tương tác thuốc trên lâm sàng. Mục tiêu chính là xây dựng mô hình sàng lọc ảo có khả năng dự đoán các chất ức chế bơm ngược MRP4 từ đó tiến hành sàng lọc trên các ngân hàng dữ liệu DrugBank và ngân hàng dữ liệu các bài thuốc cổ truyền Trung Hoa (TCM). Phương pháp nghiên cứu dựa trên cơ sở dữ liệu gồm 206 chất, thu thập từ 18 bài báo khoa học. Mô hình sàng lọc được xây dựng là 3D – pharmacophore và hai mô hình 2D – QSAR dự đoán hoạt tính ức chế bơm ngược MRP4 trên cơ chất nội sinh và ngoại sinh. Nghiên cứu này đóng vai trò quan trọng trong việc khám phá các chất ức chế tiềm năng, góp phần vào việc cải thiện hiệu quả điều trị và giảm thiểu tình trạng kháng thuốc.

1.1. Vai Trò Của Bơm Ngược MRP4 Trong Kháng Thuốc

Bơm ngược MRP4 (Multi-drug Resistance-associated Protein 4), là một thành viên của họ protein vận chuyển ABC. Bơm này đóng vai trò quan trọng trong việc vận chuyển các chất nội sinh và ngoại sinh ra khỏi tế bào. Sự biểu hiện quá mức của MRP4 trong một số tế bào ung thư dẫn đến tình trạng kháng thuốc, làm giảm hiệu quả điều trị ung thư. Ức chế MRP4 có thể làm tăng nồng độ thuốc trong tế bào, khôi phục hiệu lực của thuốc và giảm tình trạng kháng thuốc. Nghiên cứu này nhằm xác định các chất ức chế MRP4 tiềm năng thông qua sàng lọc ảo, có thể mở ra hướng đi mới trong điều trị ung thư.

1.2. Ứng Dụng Sàng Lọc Ảo Trong Thiết Kế Thuốc Mới

Sàng lọc ảo (virtual screening) là một phương pháp in silico được sử dụng rộng rãi trong thiết kế thuốc. Phương pháp này cho phép các nhà nghiên cứu sàng lọc hàng triệu hợp chất tiềm năng một cách nhanh chóng và hiệu quả, tiết kiệm thời gian và chi phí so với các phương pháp sàng lọc truyền thống. Sàng lọc ảo dựa trên các mô hình máy tính để dự đoán khả năng liên kết của các hợp chất với mục tiêu protein, trong trường hợp này là MRP4. Các hợp chất có điểm số liên kết cao sẽ được chọn lọc để nghiên cứu sâu hơn.

II. Thách Thức Nghiên Cứu Tìm Chất Ức Chế Bơm Ngược MRP4

Việc phát hiện các chất ức chế hiệu quả cho bơm ngược MRP4 đối mặt với nhiều thách thức. Cấu trúc của MRP4, mặc dù đã được công bố vào tháng 6 năm 2023, vẫn chưa hoàn toàn rõ ràng, đặc biệt là ở các vùng linh động. Các nghiên cứu trước đây thường dựa vào mô hình tương đồng hoặc đột biến điểm để xác định các acid amin quan trọng. Thêm vào đó, MRP4 được cho là có nhiều vị trí gắn kết cơ chất, và cơ chế vận chuyển cơ chất vẫn chưa được hiểu đầy đủ. Việc xây dựng các mô hình pharmacophore, QSAR và docking là cần thiết để bổ sung thông tin về cấu trúc, tương tác và khả năng gắn kết của chất ức chế. Đồng thời, việc dự đoán khả năng ức chế và tương tác thuốc tiềm năng cũng là một thách thức quan trọng.

2.1. Vấn Đề Cấu Trúc Chưa Rõ Ràng Của MRP4

Cấu trúc protein MRP4, mặc dù đã được xác định bằng kính hiển vi điện tử nghiệm lạnh (Cryo-EM), vẫn còn một số vùng chưa được giải quyết hoàn toàn, đặc biệt là các vùng linh động. Điều này gây khó khăn trong việc xây dựng các mô hình docking phân tử chính xác và dự đoán tương tác giữa các chất ức chế và MRP4. Các nghiên cứu trước đây thường sử dụng mô hình tương đồng hoặc đột biến điểm định hướng để xác định các acid amin quan trọng trong quá trình gắn kết và vận chuyển cơ chất.

2.2. Cơ Chế Vận Chuyển Phức Tạp Của Bơm Ngược MRP4

Cơ chế vận chuyển cơ chất của bơm ngược MRP4 vẫn chưa được hiểu đầy đủ. MRP4 được cho là có nhiều vị trí gắn kết cơ chất và có thể vận chuyển nhiều loại cơ chất khác nhau, bao gồm cả các chất nội sinh và ngoại sinh. Điều này gây khó khăn trong việc thiết kế các chất ức chế có tính chọn lọc cao cho MRP4. Các nghiên cứu in silico, bao gồm molecular dynamics simulation, đang được sử dụng để khám phá cơ chế vận chuyển của MRP4 và xác định các vị trí gắn kết tiềm năng cho các chất ức chế.

III. Phương Pháp Xây Dựng Mô Hình Sàng Lọc Ảo Ức Chế MRP4

Nghiên cứu sử dụng kết hợp các phương pháp in silico để xây dựng mô hình sàng lọc ảo. Đầu tiên, mô hình 3D-pharmacophore được xây dựng dựa trên các chất đã biết có khả năng ức chế bơm ngược MRP4. Tiếp theo, mô hình 2D-QSAR được phát triển để dự đoán hoạt tính của các hợp chất mới. Sau đó, docking phân tử được sử dụng để đánh giá khả năng gắn kết của các hợp chất vào vị trí hoạt động của protein MRP4. Cuối cùng, các hợp chất tiềm năng được sàng lọc qua các mô hình ADMET để đánh giá tính chất dược động học và độc tính. Quy trình này giúp chọn lọc các chất có khả năng ức chế MRP4 một cách hiệu quả.

3.1. Xây Dựng Mô Hình 3D Pharmacophore Để Sàng Lọc Nhanh

Mô hình 3D-pharmacophore là một biểu diễn ba chiều của các đặc điểm cấu trúc cần thiết cho sự tương tác của một chất với mục tiêu protein. Trong nghiên cứu này, mô hình 3D-pharmacophore được xây dựng dựa trên các chất đã biết có khả năng ức chế bơm ngược MRP4. Mô hình này được sử dụng để sàng lọc nhanh các hợp chất từ các thư viện hợp chất lớn, loại bỏ các hợp chất không có khả năng tương tác với MRP4. Các hợp chất phù hợp với mô hình pharmacophore sẽ được chọn lọc để nghiên cứu sâu hơn bằng các phương pháp khác.

3.2. Phát Triển Mô Hình 2D QSAR Dự Đoán Hoạt Tính

Mô hình 2D-QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship) là một mô hình toán học liên hệ giữa cấu trúc hóa học của một chất và hoạt tính sinh học của nó. Trong nghiên cứu này, mô hình 2D-QSAR được phát triển để dự đoán hoạt tính ức chế MRP4 của các hợp chất mới. Mô hình được xây dựng dựa trên một tập hợp các chất đã biết với hoạt tính ức chế MRP4 đã được đo lường. Các mô tả cấu trúc của các chất này được sử dụng để xây dựng mô hình, sau đó mô hình được sử dụng để dự đoán hoạt tính của các hợp chất mới.

3.3. Đánh Giá Khả Năng Gắn Kết Bằng Docking Phân Tử

Docking phân tử là một phương pháp tính toán được sử dụng để dự đoán cách một phân tử nhỏ (ví dụ như chất ức chế) gắn kết với một protein (ví dụ như MRP4). Trong nghiên cứu này, docking phân tử được sử dụng để đánh giá khả năng gắn kết của các hợp chất vào vị trí hoạt động của protein MRP4. Kết quả docking cung cấp thông tin về năng lượng liên kết, vị trí gắn kết và các tương tác quan trọng giữa hợp chất và MRP4.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Sàng Lọc Ảo Trên Dữ Liệu DrugBank TCM

Các mô hình in silico đã được ứng dụng để sàng lọc ảo trên hai ngân hàng dữ liệu: DrugBank và ngân hàng dữ liệu các bài thuốc cổ truyền Trung Hoa (TCM). Mục tiêu là tìm ra các hợp chất có khả năng ức chế bơm ngược MRP4. Sau quá trình sàng lọc và mô phỏng động lực học phân tử (MD), hai chất DB12204 và DB02651 đã được xác định là những chất ức chế tiềm năng, với năng lượng liên kết tự do (∆Gbind) lần lượt là -22.28 kcal/mol và -31.48 kcal/mol. Kết quả này mở ra tiềm năng cho việc phát triển các thuốc mới dựa trên các hợp chất tự nhiên.

4.1. Tìm Kiếm Chất Ức Chế Tiềm Năng Từ DrugBank

DrugBank là một cơ sở dữ liệu trực tuyến chứa thông tin về các thuốc và mục tiêu của chúng. Việc sàng lọc cơ sở dữ liệu DrugBank cho phép xác định các thuốc hiện có hoặc các hợp chất tương tự có khả năng ức chế MRP4. Các hợp chất này có thể được sử dụng như một điểm khởi đầu để phát triển các thuốc ức chế MRP4 hiệu quả hơn.

4.2. Khám Phá Các Bài Thuốc Cổ Truyền Trung Hoa TCM

Ngân hàng dữ liệu các bài thuốc cổ truyền Trung Hoa (TCM) chứa thông tin về các hợp chất tự nhiên được sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc. Việc sàng lọc cơ sở dữ liệu TCM có thể dẫn đến việc phát hiện các hợp chất tự nhiên có khả năng ức chế MRP4. Các hợp chất này có thể có tiềm năng phát triển thành các thuốc mới với ít tác dụng phụ hơn so với các thuốc tổng hợp.

4.3. Đánh Giá Các Hợp Chất DB12204 DB02651 Bằng MD Simulation

Mô phỏng động lực học phân tử (MD) là một phương pháp tính toán được sử dụng để mô phỏng chuyển động của các nguyên tử và phân tử theo thời gian. Trong nghiên cứu này, mô phỏng MD được sử dụng để đánh giá tính ổn định của phức hợp giữa MRP4 và các chất ức chế tiềm năng DB12204 và DB02651. Kết quả mô phỏng MD cung cấp thông tin về cấu trúc, động lực học và năng lượng của phức hợp, giúp xác định xem các hợp chất này có thực sự là các chất ức chế tiềm năng hay không.

V. Kết Luận Tiềm Năng Phát Triển Chất Ức Chế MRP4 Mới

Nghiên cứu này đã thành công trong việc xây dựng các mô hình in silico có khả năng dự đoán các chất ức chế bơm ngược MRP4. Kết quả sàng lọc từ DrugBank và TCM đã xác định được hai chất tiềm năng, DB12204 và DB02651. Tuy nhiên, cần có các nghiên cứu in vitro để đánh giá khả năng ức chế bơm ngược của các hợp chất này. Nghiên cứu này cung cấp một nền tảng vững chắc cho việc phát triển các thuốc mới nhắm vào MRP4, có tiềm năng cải thiện hiệu quả điều trị ung thư, HIV và các bệnh khác liên quan đến kháng thuốc.

5.1. Đề Xuất Thử Nghiệm In Vitro Đánh Giá Khả Năng Ức Chế

Kết quả sàng lọc ảo cần được xác nhận bằng các thử nghiệm in vitro. Các thử nghiệm này sẽ đo lường trực tiếp khả năng ức chế MRP4 của các hợp chất tiềm năng trong môi trường phòng thí nghiệm. Các thử nghiệm in vitro cũng có thể cung cấp thông tin về cơ chế tác động của các hợp chất và tính chọn lọc của chúng đối với MRP4.

5.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai Về Tương Tác Protein Ligand

Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc khám phá chi tiết tương tác protein-ligand giữa MRP4 và các chất ức chế. Điều này có thể đạt được thông qua các phương pháp như tinh thể học tia X và cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). Thông tin về tương tác protein-ligand sẽ giúp thiết kế các chất ức chế MRP4 mạnh mẽ và chọn lọc hơn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bơm ngược MRP4, được mã hoá bởi gen ABCC4, là một protein đa kháng thuốc thuộc họ ATP-Binding Cassette (ABC), có vai trò quan trọng trong việc vận chuyển các cơ chất nội sinh và ngoại sinh, ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị và tương tác thuốc trên lâm sàng. MRP4 biểu hiện cao ở tiểu cầu và một số tế bào ung thư, góp phần vào tình trạng đa kháng thuốc trong điều trị HIV, ung thư và bệnh tim mạch. Theo ước tính, có khoảng 206 chất được nghiên cứu liên quan đến hoạt tính ức chế bơm MRP4, thu thập từ 18 bài báo khoa học. Mục tiêu của nghiên cứu là xây dựng mô hình sàng lọc ảo dự đoán các chất ức chế bơm ngược MRP4, từ đó sàng lọc trên các ngân hàng dữ liệu DrugBank và các bài thuốc cổ truyền Trung Hoa (TCM). Nghiên cứu được thực hiện trong giai đoạn 2021-2023 tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, nhằm cung cấp công cụ hỗ trợ phát hiện các chất ức chế tiềm năng, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu đa kháng thuốc. Các chỉ số đánh giá mô hình và kết quả sàng lọc có thể được trình bày qua biểu đồ ROC và bảng thống kê tương tác phân tử, giúp minh chứng độ chính xác và tính ứng dụng của mô hình.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Họ bơm ABC (ATP-Binding Cassette transporter): Là họ protein xuyên màng lớn, sử dụng năng lượng ATP để vận chuyển cơ chất ra khỏi tế bào, trong đó MRP4 thuộc phân họ ABCC, có cấu trúc gồm hai vùng liên kết nucleotide (NBD) và hai vùng xuyên màng (TMD).
• Mô hình vận chuyển cơ chất của bơm MRP4: Bao gồm mô hình công tắc (Switch model), mô hình tiếp xúc liên tục (Constant contact model) và mô hình trao đổi (Reciprocating model), giải thích cơ chế vận chuyển dựa trên sự thuỷ phân ATP và chuyển vị của TMD.
• Khám phá thuốc dưới sự hỗ trợ của máy tính (CADD): Phân thành hai phương pháp chính là khám phá thuốc dựa trên cấu trúc mục tiêu (docking, mô phỏng động lực học phân tử) và dựa trên phối tử (pharmacophore, QSAR).
• Các khái niệm chính: Pharmacophore (mô hình đặc trưng không gian của các nhóm chức quan trọng), QSAR (mối quan hệ định lượng giữa cấu trúc và hoạt tính), docking phân tử (dự đoán vị trí và ái lực gắn kết phối tử với protein), mô phỏng động lực học phân tử (MD) và dự đoán ADMET (hấp thu, phân bố, chuyển hoá, thải trừ và độc tính).

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Cơ sở dữ liệu gồm 206 chất ức chế bơm MRP4 thu thập từ 18 bài báo khoa học, cùng với ngân hàng dữ liệu DrugBank (11.000 hợp chất) và TCM (57.435 hợp chất).
• Phương pháp phân tích:
  • Xây dựng mô hình 3D-pharmacophore dựa trên phối tử có hoạt tính mạnh (IC50 ≤ 5 µM).
  • Xây dựng hai mô hình 2D-QSAR dự đoán hoạt tính ức chế trên cơ chất nội sinh và ngoại sinh, sử dụng phương pháp bình phương tối thiểu từng phần (PLS).
  • Đánh giá và lựa chọn cấu trúc bơm MRP4 từ CryO-EM (PDB: 8I4A) và các mô hình tương đồng (AlphaFold, I-TASSER) để xây dựng mô hình docking phân tử.
  • Sàng lọc ảo các hợp chất qua mô hình pharmacophore, QSAR và docking.
  • Mô phỏng động lực học phân tử (MD) 100 ns để đánh giá tính ổn định và tương tác của các chất ức chế tiềm năng.
  • Dự đoán ADMET bằng công cụ ADMETlab 2.0.
• Timeline nghiên cứu: Thực hiện từ tháng 10/2021 đến 10/2023 tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Mô hình 3D-pharmacophore:

   • Được xây dựng từ 142 chất có hoạt tính IC50, mô hình đạt điểm GH > 0,7, thể hiện độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong phân loại chất ức chế.
   • Mô hình cho phép sàng lọc nhanh các hợp chất tiềm năng từ ngân hàng dữ liệu lớn.

2. Mô hình 2D-QSAR:

   • Hai mô hình QSAR dự đoán hoạt tính ức chế trên cơ chất ngoại sinh và nội sinh đạt hệ số Q² > 0,5 và R²_pred > 0,5, chứng tỏ khả năng dự đoán tốt.
   • Các thông số mô tả phân tử quan trọng được xác định, giúp hiểu rõ mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính.

3. Docking phân tử và mô phỏng MD:

   • Cấu trúc MRP4 (PDB: 8I4A) được sử dụng để docking, xác định khoang gắn kết gồm các acid amin thân nước và kỵ nước như Phe 211, Arg 375, Trp 995, Arg 998.
   • Qua sàng lọc ảo và mô phỏng MD 100 ns, hai chất DB12204 và DB02651 được xác định là chất ức chế tiềm năng với năng lượng liên kết tự do ∆G_bind lần lượt là -22,28 kcal/mol và -31,48 kcal/mol.
   • Các chỉ số RMSD, RMSF, SASA và Rg cho thấy phức hợp phối tử – MRP4 ổn định trong suốt quá trình mô phỏng.
   • Tương tác hydro và ion giữa phối tử và các acid amin quan trọng được thống kê, minh chứng cho sự gắn kết bền vững.

4. Dự đoán ADMET:

   • Hai chất ức chế tiềm năng có các chỉ số hấp thu, phân bố, chuyển hoá và thải trừ phù hợp, đồng thời cảnh báo độc tính thấp, phù hợp cho các bước thử nghiệm tiếp theo.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy mô hình sàng lọc ảo kết hợp pharmacophore, QSAR và docking là công cụ hiệu quả trong việc dự đoán và lựa chọn các chất ức chế bơm MRP4. Việc sử dụng cấu trúc MRP4 có độ phân giải cao (PDB: 8I4A) giúp nâng cao độ chính xác của mô hình docking so với các mô hình homology trước đây. So sánh với các nghiên cứu trước, kết quả tương đồng với các chất ức chế đã biết như dipyridamol và indomethacin, đồng thời mở rộng phạm vi tìm kiếm các hợp chất mới từ ngân hàng dữ liệu TCM phong phú. Các chỉ số mô phỏng động lực học phân tử và dự đoán ADMET cung cấp bằng chứng hỗ trợ cho tính khả thi của các chất ức chế tiềm năng trong nghiên cứu tiền lâm sàng. Kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển thuốc ức chế MRP4, góp phần giảm đa kháng thuốc và cải thiện hiệu quả điều trị các bệnh lý liên quan.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tiến hành thử nghiệm in vitro:

   • Đánh giá hoạt tính ức chế bơm MRP4 của các chất DB12204 và DB02651 trên các dòng tế bào biểu hiện MRP4, nhằm xác nhận kết quả in silico.
   • Thời gian: 6-12 tháng. Chủ thể thực hiện: các phòng thí nghiệm dược lý và sinh học phân tử.

2. Mở rộng sàng lọc hợp chất:

   • Áp dụng mô hình pharmacophore và QSAR đã xây dựng để sàng lọc thêm các ngân hàng dữ liệu hợp chất tự nhiên và tổng hợp khác.
   • Mục tiêu: tăng số lượng ứng viên tiềm năng, đa dạng hóa cấu trúc hóa học. Thời gian: 12 tháng.

3. Phát triển mô hình docking nâng cao:

   • Cập nhật và hoàn thiện cấu trúc MRP4 với các vùng acid amin linh động chưa rõ, sử dụng kỹ thuật mô phỏng nâng cao để cải thiện độ chính xác mô hình docking.
   • Chủ thể: nhóm nghiên cứu công nghệ tính toán phân tử.

4. Nghiên cứu tương tác thuốc trên lâm sàng:

   • Khảo sát ảnh hưởng của các chất ức chế MRP4 đến dược động học và tương tác thuốc trong các mô hình động vật và thử nghiệm lâm sàng giai đoạn đầu.
   • Mục tiêu: đánh giá an toàn và hiệu quả, giảm thiểu tác dụng phụ. Thời gian: 2-3 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu dược học và công nghệ sinh học:

   • Lợi ích: Áp dụng mô hình sàng lọc ảo để phát triển thuốc mới, nghiên cứu cơ chế đa kháng thuốc.
   • Use case: Thiết kế các hợp chất ức chế bơm MRP4 có hiệu quả cao.

2. Bác sĩ lâm sàng và chuyên gia dược lâm sàng:

   • Lợi ích: Hiểu rõ vai trò của MRP4 trong tương tác thuốc và đa kháng thuốc, hỗ trợ lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp.
   • Use case: Quản lý bệnh nhân ung thư, HIV có nguy cơ đa kháng thuốc.

3. Cơ sở đào tạo và sinh viên ngành dược:

   • Lợi ích: Tài liệu tham khảo về ứng dụng công nghệ tính toán trong nghiên cứu dược học hiện đại.
   • Use case: Học tập, nghiên cứu luận văn, đề tài khoa học.

4. Công ty dược phẩm và phát triển thuốc:

   • Lợi ích: Tăng hiệu quả nghiên cứu phát triển thuốc, giảm chi phí thử nghiệm bằng mô hình in silico.
   • Use case: Sàng lọc hợp chất tiềm năng, đánh giá dược tính và độc tính ban đầu.

Câu hỏi thường gặp

1. Mô hình pharmacophore là gì và tại sao quan trọng trong nghiên cứu này?
   Mô hình pharmacophore là tập hợp các đặc trưng không gian của các nhóm chức quan trọng trong phân tử có liên quan đến hoạt tính sinh học. Nó giúp sàng lọc nhanh các hợp chất tiềm năng từ ngân hàng dữ liệu lớn, tiết kiệm thời gian và chi phí thử nghiệm thực nghiệm.

2. Tại sao cần kết hợp nhiều mô hình như pharmacophore, QSAR và docking?
   Mỗi mô hình có ưu điểm riêng: pharmacophore giúp nhận diện đặc trưng chung, QSAR dự đoán hoạt tính dựa trên cấu trúc, docking đánh giá tương tác phân tử cụ thể. Kết hợp giúp tăng độ chính xác và tin cậy của kết quả sàng lọc.

3. Mô phỏng động lực học phân tử (MD) đóng vai trò gì trong nghiên cứu?
   MD mô phỏng chuyển động và tương tác của phân tử trong thời gian thực tế, giúp đánh giá tính ổn định của phức hợp protein – phối tử và dự đoán năng lượng liên kết tự do, từ đó xác định chất ức chế tiềm năng có khả năng gắn kết bền vững.

4. Các chất DB12204 và DB02651 có thể được sử dụng ngay trong điều trị không?
   Hiện tại, hai chất này mới được xác định là chất ức chế tiềm năng qua mô hình in silico. Cần tiến hành thử nghiệm in vitro, in vivo và các nghiên cứu lâm sàng để đánh giá an toàn và hiệu quả trước khi ứng dụng điều trị.

5. Làm thế nào để mô hình này hỗ trợ giảm đa kháng thuốc trong điều trị ung thư và HIV?
   Ức chế bơm MRP4 giúp tăng nồng độ thuốc điều trị trong tế bào, khôi phục hiệu lực thuốc và giảm khả năng đào thải thuốc ra ngoài, từ đó làm giảm tình trạng đa kháng thuốc, nâng cao hiệu quả điều trị.

Kết luận

• Xây dựng thành công mô hình sàng lọc ảo kết hợp pharmacophore, 2D-QSAR và docking phân tử dựa trên cấu trúc MRP4 có độ phân giải cao.
• Sàng lọc từ ngân hàng dữ liệu DrugBank và TCM đã xác định hai chất ức chế bơm MRP4 tiềm năng là DB12204 và DB02651 với năng lượng liên kết tự do ∆G_bind lần lượt là -22,28 kcal/mol và -31,48 kcal/mol.
• Mô phỏng động lực học phân tử và dự đoán ADMET cho thấy các chất này có tính ổn định và tiềm năng dược lý phù hợp.
• Nghiên cứu đề xuất tiến hành thử nghiệm in vitro và mở rộng sàng lọc hợp chất để phát triển thuốc ức chế MRP4 hiệu quả.
• Kêu gọi các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp dược phẩm ứng dụng mô hình in silico trong phát triển thuốc nhằm giảm thiểu đa kháng thuốc và nâng cao hiệu quả điều trị.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Bơm ngược MRP4 được mã hoá bởi gen ABCC4 là protein đa kháng thuốc thuộc họ ABC được tìm thấy lần đầu tiên ở tế bào lympho T của người vào năm 1999. Bơm gồm 1325 acid amin, phân bố ở màng đỉnh của tế bào ống lượn gần, nội mô mao mạch não, màng đáy của tế bào tuyến tiền liệt, tế bào gan và đám rối màng mạch. MRP4 vận chuyển nhiều cơ chất nội sinh và ngoại sinh ra ngoài tế bào, đồng thởi đóng vai trò quan trọng trong việc cân bằng nội sinh của một số các phân tử tín hiệu.1 Các cơ chất nội sinh của bơm ngược MRP4 bao gồm các phân tử tín hiệu như prostaglandin E2, leukotrien B4, thromboxan B2 (TXB2), chất truyền tin thứ cấp như cAMP và cGMP, các acid mật, steroid liên hợp và acid folic. Ngoài ra, MRP4 cũng có khả năng vận chuyển một loạt các cơ chất ngoại sinh là thuốc như các thuốc chống ung thư, kháng sinh, thuốc kháng virus và thuốc tim mạch ra khỏi tế bào, gây ra tình trạng đa kháng thuốc thường gặp trong điều trị các bệnh HIV, ung thư và tim mạch.2 Một số nghiên cứu đã chứng minh bơm ngược MRP4 biểu hiện quá mức trong các tế bào ung thư tuyến tiền liệt,3 u nguyên bào thần kinh4 và dòng tế bào bệnh bạch cầu nguyên bào lympho T5 gây ảnh hưởng đến hiệu quả của thuốc điều trị.

Những dữ liệu lâm sàng còn cho biết bơm MRP4 có liên quan đến một số trường hợp tương tác thuốc trên lâm sàng. Nghiên cứu hồi cứu về tương tác giữa NSAID – các thuốc có khả năng ức chế bơm MRP4 với tenofovir trên bệnh nhân nhiễm HIV cho thấy các NSAID ảnh hưởng đến quá trình bài tiết tenofovir gây viêm kẽ thận cấp.6 Các NSAID còn ức chế quá trình vận chuyển methotrexat bởi bơm ngược MRP2 và MRP4 ở thận, gây ảnh hưởng đến sự đào thải của methotrexat ra khỏi cơ thể.7 Vì vậy, bơm MRP4 và các chất ức chế có tiềm năng trở thành một trong những mục tiêu nghiên cứu về tương tác thuốc trong tương lai. Tuy nhiên việc nghiên cứu về bơm ngược MRP4 vẫn gặp một số trở ngại, tháng 6 năm 2023, cấu trúc bơm được chụp bằng kính hiển vi nghiệm lạnh mới được công bố, nhưng một số acid amin ở vùng linh động của bơm vẫn chưa được làm rõ. Các nghiên cứu về cấu trúc MRP4 trước đó chủ yếu sử dụng các mô hình tương đồng hoặc phương pháp đột biến điểm định hướng nhằm xác định các acid amin quan trọng.

2 liên quan đến quá trình gắn kết và vận chuyển cơ chất.8, 9 Giống như các bơm ngược khác thuộc họ ABC, MRP4 được giả định có nhiều hơn một vị trí gắn kết với cơ chất và cơ chế vận chuyển cơ chất vẫn đang được dự đoán thông qua các mô hình in silico.10-12 Việc xây dựng các mô hình pharmacophore, QSAR, docking có thể giúp bổ sung một số thông tin về cấu trúc của bơm, mối liên hệ định lượng giữa cấu trúc – tác động ức chế, khảo sát khả năng gắn kết của chất ức chế vào mục tiêu tác động. Đồng thời, các mô hình in silico được ứng dụng để sàng lọc các chất ức chế bơm từ các ngân hàng dữ liệu sẵn có cũng như dự đoán khả năng ức chế và tương tác thuốc có thể xảy ra trong tương lai. Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu xây dựng mô hình in silico có khả năng dự đoán các chất ức chế bơm ngược MRP4 ở người. MRP4 có khả năng đào thải một loạt các thuốc điều trị ung thư, HIV, tim mạch và gây tương tác thuốc trên lâm sàng.

Ức chế MRP4 có thể làm tăng nồng độ thuốc điều trị trong nội bào, từ đó khôi phục hiệu lực và làm giảm tình đa kháng thuốc xảy ra ở một số bệnh nhân.13 Để đạt được mục tiêu chung đã đặt ra, cần thực hiện các mục tiêu cụ thể như sau: 1. Xây dựng mô hình 3D – pharmacophore dựa trên phối tử để sàng lọc nhanh các chất có khả năng ức chế bơm ngược MRP4. Xây dựng mô hình QSAR nhằm dự đoán hoạt tính các chất ức chế bơm MRP4. Thu thập và đánh giá cấu trúc bơm ngược MRP4, nghiên cứu mô hình docking phân tử nhằm nghiên cứu tương tác và khả năng gắn kết của các chất ức chế bơm ngược.

Ứng dụng sàng lọc trên các tập cơ sở dữ liệu DrugBank và ngân hàng dữ liệu các bài thuốc cổ truyền Trung Hoa (TCM) nhằm tìm ra các hợp chất có khả năng ức chế bơm ngược MRP4. Nghiên cứu mô phỏng động lực học phân tử (MD) dự đoán dược động học và độc tính (ADMET) của các chất có khả năng ức chế MRP4 tiềm năng. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Bơm đa kháng thuốc MRP4 được mã hoá bởi gen ABCC4 1.

Họ bơm ngược ABC (ATP-Binding Cassette) Họ bơm ABC được xem là một trong những họ protein xuyên màng lớn nhất bao gồm 49 protein vận chuyển được chia thành 7 phân họ khác nhau, ký hiệu từ A đến G, dựa trên sự tương đồng về trình tự. Họ bơm này được tìm thấy ở tất cả các sinh vật và ở tế bào người.1 Ở vi sinh vật, các bơm thuộc họ này có khả năng đẩy các kháng sinh ra khỏi tế bào vi khuẩn, góp phần gia tăng tình trạng đề kháng kháng sinh. Ở người, họ bơm ABC thường có mặt ở các tế bào ung thư, sử dụng năng lượng ATP đào thải một loạt các thuốc điều trị ung thư ngược với gradient nồng độ ra môi trường ngoài. Một số bơm ngược như P-glycoprotein (ABCB1/P-gp), protein đa kháng thuốc 1 (ABCC1/MRP1) và protein kháng ung thư vú (ABCG2/BCRP) đều cho thấy các bơm vận chuyển thuộc họ ABC đóng vai trò quan trọng trong việc đề kháng thuốc ở bệnh nhân ung thư.14 Phân họ ABCC gồm 12 protein vận chuyển, trong đó có 9 protein là các bơm ngược đa kháng thuốc.

Các nghiên cứu về đặc điểm, vị trí phân bố và khả năng sao chép cho thấy, 9 protein này là các bơm ngược phụ thuộc ATP vận chuyển các cơ chất nội sinh và ngoại sinh đa dạng về cấu trúc ra khỏi tế bào. Cấu trúc của họ bơm ABCC thường chứa bốn thành phần thiết yếu, gồm hai vùng liên kết nucleotid (Nucleotide binding domain – NBD) và hai vùng xuyên màng (Transmembrane domain – TMD). Phân họ ABCC được chia thành hai nhóm, nhóm protein đa kháng thuốc ngắn gồm các bơm MRP4, MRP5, MRP11, MRP3 và nhóm protein đa kháng thuốc dài, có thêm vùng xuyên màng bổ sung gồm MRP1, MRP2, MRP3, MRP6. Cấu trúc và vị trí phân bố của bơm ngược MRP4 Bơm ngược MRP4 được mã hoá bởi gen ABCC4 nằm trên nhiễm sắc thể 13q32.

Bơm gồm 1325 acid amin, là bơm ngược ngắn nhất trong phân họ ABCC. MRP4 được mô tả lần đầu vào năm 1999 trên tế bào lympho T ở người cho thấy khả năng làm giảm hiệu quả trị liệu của thuốc kháng virus có cấu trúc tương tự nucleosid. 4 MRP4 là bơm ngược duy nhất của phân họ bơm ABCC có vị trí nằm ở màng kép của tế bào phân cực. Bơm ngược này phân bố ở màng đáy của các tế bào biểu mô tuyến tiền liệt, tế bào gan và đám rối màng mạch.

Ở tế bào ống lượn gần và nội mô mao mạch não, MRP4 khu trú ở màng đỉnh. Ngoài ra, MRP4 còn được tìm thấy trong tế bào tinh hoàn, buồng trứng, tuyến thượng thận và tế bào máu.15 MRP4 có cấu trúc điển hình của các bơm ngược thuộc phân họ ABCC, gồm hai vùng xuyên màng (TMD1 và TMD2), mỗi vùng gồm sáu chuỗi protein xuyên màng (TMH1-12) và hai vùng liên kết nucleotid (NBD1 và NBD2) có chức năng thuỷ phân ATP để cung cấp năng lượng cho quá trình vận chuyển cơ chất.16 Chuỗi protein xuyên màng TMH4, TMH5 của TMD1 và TMH10, TMH11 của TMD2 được hoán đổi vị trí với nhau.17 So với các protein MRP5, MRP8, MRP9 cùng nhóm, đầu N của bơm MRP4 ngắn hơn 87 – 255 acid amin và chứa trình tự acid amin đặc trưng. Đầu C của MRP4 lại dài hơn 40 acid amin và chứa trình tự acid amin được bảo tồn.15 Trong nghiên cứu gần đây, trình tự acid amin bảo tồn ở đầu C được xác định là đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng đến chức năng truyền tín hiệu protein kinase A của MRP4 trong bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ.18 Ngoài ra, chuỗi TMH6 của bơm MRP4 chứa hai acid amin phenylalanin ở vị trí 368, 369 đặc trưng và không có ở protein đa kháng thuốc khác.15 Chuỗi TMH7 là một chuỗi xoắn dài hơn so với các chuỗi xoắn còn lại nên có một phần cấu trúc mở rộng đến vùng ngoại bào.19 Cấu trúc của bơm ngược MRP4 được mô tả ở Hình 1. Ngày 24/05/2023, một số cấu trúc của bơm ngược MRP4 được chụp bằng kính hiển vi nghiệm lạnh đã được công bố.19-21 Cấu trúc bơm ngược MRP4 (mã Protein Data Bank – PDB 8I4A) được chụp cùng với phối tử đồng kết tinh là dipyridamol, một chất ức chế bơm ngược có IC50 là 2,1 µM và hằng số phân ly Kd là 23 µM.20 Trong báo cáo này, phần lớn cấu trúc và khoang gắn kết của bơm MRP4 đã được xác định, ngoại trừ vùng acid amin linh động gồm 8 acid amin đầu N, 27 acid amin đầu C, 63 acid amin của dây nối hai nửa cấu trúc của protein và 9 acid amin thuộc chuỗi TMH7 ở vùng ngoại bào.20 Khoang gắn kết của bơm được tạo thành bởi các acid.

5 amin kỵ nước Phe 211 của chuỗi TMH3, Phe 324 của chuỗi TMH5, Leu 367, Phe 368, Arg 375 chuỗi TMH6 và Tryp 995, Arg 998 của chuỗi TMH12. Trong đó Arg 375, Arg 998 là hai acid amin thân nước có khả năng cho hai cặp liên kết hydro. Cấu trúc bơm ngược MRP419 ABCC4 là một gen có tính đa hình cao. Năm 2008, trong nghiên cứu của Nada Abla và cộng sự cho thấy một số kiểu đa hình của gen ABCC4 ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển cơ chất, đặc biệt là các thuốc điều trị ung thư và kháng virus bằng cách tác động đến vị trí và biểu hiện của MRP4, từ đó ảnh hưởng đến dược động học của các loại thuốc này.22 Để tìm hiểu về cách thức vận chuyển cơ chất ra khỏi tế bào, bằng phương pháp đột biến điểm định hướng (Site-Directed Mutagenesis), El-Sheikh và cộng sự đã xác định Phe 368, Phe 369, Glu 374, Arg 375, Glu 378 ở chuỗi TMH6 và Arg 998 ở chuỗi TMH12 ảnh hưởng đến chức năng vận chuyển cơ chất của bơm MRP4.

Ngoài ra, thay thế Arg 375 bằng serin không làm ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển cơ chất. 6 cGMP nhưng lại làm giảm đáng kể ái lực của bơm với cơ chất methotrexat, từ đó cho thấy Arg 375 tham gia vào quá trình vận chuyển của methotrexat.