Luận văn bước đầu xác định sáu hợp chất isoflavone có trong hạt đậu nành bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao hplc

Isoflavone là hợp chất polyphenolic có nguồn gốc từ phytoestrogen thực vật, hoạt động tương tự estrogen ở người. 74 trang · Đại học Đà Nẵng · 2018.

• Tác giả: Võ Văn Hùng
• Người hướng dẫn: TS. Bùi Xuân Vững
• Trường học: Đại học Đà Nẵng
• Chuyên ngành: Hóa phân tích – Môi trường
• Đề tài: Bước đầu xác định sáu hợp chất isoflavone có trong hạt đậu nành bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Đà Nẵng

Mục lục chi tiết

• LỜI MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ĐẬU NÀNH
• 1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm
• 1.1.2. Thành phần hóa học trong đậu nành
• 1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ISOFLAVONE
• 1.2.1. Nguồn gốc Isoflavone
• 1.2.2. Thành phần hóa học, tính chất, cấu trúc của isoflavone
• 1.2.3. Tác dụng của isoflavone trong phòng và điều trị bệnh
• 1.2.3.1. Tác dụng trên chuyển hóa của xương
• 1.2.3.2. Tác dụng trên tim mạch
• 1.2.3.3. Nâng cao chất lượng cuộc sống của phụ nữ
• 1.2.3.4. Tác dụng phụ có thể gặp với isoflavone đậu nành
• 1.2.3.5. Ứng dụng của isoflavone
• 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
• 1.3.1. Các nghiên cứu ngoài nước
• 1.3.1.1. Tại Hàn Quốc
• 1.3.2. Các nghiên cứu trong nước
• 1.4. CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC
• 1.4.1. Nguyên tắc của các quá trình sắc ký
• 1.4.2. Phân loại sắc ký hấp phụ
• 1.4.3. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ
• 1.4.3.1. Thời gian lưu thực t’R
• 1.4.3.2. Hệ số dung lượng K’
• 1.4.3.3. Hệ số không đối xứng
• 1.4.4. Hệ thống HPLC
• 1.4.4.1. Bình đựng dung môi
• 1.4.4.2. Bộ phận khử khí
• 1.4.4.3. Bộ phận tiêm mẫu
• 1.4.4.4. Bộ phận ghi tín hiệu
• 1.4.4.5. Thiết bị in dữ liệu
• 1.4.5. Phương pháp chọn điều kiện sắc ký
• 1.4.5.1. Lựa chọn pha tĩnh
• 1.4.5.2. Lựa chọn pha động
• 1.4.6. Các bước tiến hành sắc ký
• 1.4.6.1. Chuẩn bị dụng cụ và máy móc
• 1.4.6.2. Chuẩn bị dung môi pha động
• 1.4.6.3. Chuẩn bị mẫu đo HPLC
• 1.4.6.4. Cách vận hành thiết bị
• 1.5. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.5.1. Nguyên liệu hạt đậu nành
• 1.5.2. Hóa chất và dụng cụ, thiết bị
• 1.5.3. Dụng cụ và thiết bị
• 1.5.4. Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích
• 1.5.5. Nội dung nghiên cứu
• 1.5.6. Khảo sát phương pháp trích ly isoflavone
• 1.5.6.1. Quy trình công nghệ chiết isoflavone trong phòng thí nghiệm bằng phương pháp chiết lắc thông thường
• 1.5.6.2. Phương pháp trích ly isoflavone bằng phương pháp lắc có hỗ trợ siêu âm
• 1.5.7. Phương pháp định tính, định lượng isoflavone bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC
• 1.5.7.1. Khảo sát các điều kiện tối ưu cho hệ thống HPLC để phân tích isoflavone
• 1.5.7.2. Khảo sát tỷ lệ thành phần pha động
• 1.5.7.3. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính
• 1.5.7.4. Phân tích định tính isoflavone
• 1.5.7.5. Phân tích định lượng isoflavone
• 1.5.8. Khảo sát độ lặp lại của phép đo
• 1.6. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 1.6.1. Kết quả khảo sát tỷ lệ thành phần pha động
• 1.6.2. Kết quả khảo sát các mẫu hạt đậu nành có isoflavone theo thành phần pha động của hệ
• 1.6.3. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính
• 1.6.4. Kết quả đo dãy dung dịch chuẩn STD1- STD5
• 1.6.5. Xây dựng đường chuẩn
• 1.6.6. Khảo sát độ lặp lại của phép đo
• 1.6.7. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
• 1.6.8. Kết quả định tính isoflavone trong mẫu dịch bã
• 1.6.9. Kết quả đo mẫu thực
• 1.6.9.1. Kết quả đo dịch hạt chiết bằng cồn 80%
• 1.6.9.2. Kết quả đo mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp siêu âm
• 1.6.9.3. Kết quả đo mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp lắc
• 1.6.9.4. Kết quả đo mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp lắc kết hợp siêu âm
• 1.6.10. Tính toán hàm lượng isoflavone có trong mẫu hạt đậu nành bằng phương pháp đường chuẩn
• 1.6.10.1. Mẫu dịch hạt chiết bằng cồn 80%
• 1.6.10.2. Mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp siêu âm
• 1.6.10.3. Mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp lắc
• 1.6.10.4. Mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp lắc kết hợp siêu âm
• 2. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH ẢNH
• DANH MỤC BẢNG BIỂU
• LỜI CẢM ƠN

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Isoflavone Trong Đậu Nành HPLC Phân Tích

Isoflavone là hợp chất polyphenolic có nguồn gốc từ phytoestrogen thực vật, hoạt động tương tự estrogen ở người. Chúng có nhiều trong các loại đậu, đặc biệt là đậu nành. Hạt đậu nành chứa hàm lượng isoflavone cao, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe như duy trì tuổi thanh xuân, giảm nguy cơ ung thư, bệnh tim mạch và loãng xương. HPLC (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) là phương pháp hiệu quả để phân tích và xác định các hợp chất này. Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định sáu hợp chất isoflavone trong hạt đậu nành bằng phương pháp HPLC, góp phần vào việc đánh giá chất lượng và ứng dụng của đậu nành.

1.1. Nguồn Gốc và Đặc Điểm Của Isoflavone Trong Tự Nhiên

Isoflavone có nguồn gốc từ phytoestrogen thực vật, thuộc nhóm flavonoid. Chúng có cấu trúc và hoạt động tương tự estrogen ở người, được gọi là estrogen thảo mộc. Isoflavone có nhiều trong các loại đậu, cỏ ba lá đỏ, cỏ linh lăng, củ sắn dây, đặc biệt là đậu nành. Trong cây đậu nành, isoflavone có trong hạt, lá, cuống, mầm và rễ, với hàm lượng cao nhất ở phôi.

1.2. Cấu Trúc Hóa Học và Tính Chất Của Isoflavone

Isoflavone là các chất hữu cơ thuộc nhóm polyphenolic, liên quan đến flavonoid. Cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng benzen (A và B) nối với dị vòng pyron C. Trong hạt đậu nành, isoflavone tồn tại ở dạng tự do (aglucon) và dạng liên kết (glucosid), bao gồm daidzin, genistin, glycitin, và các malonyl, axetyl tương ứng. Daidzein và genistein là hai isoflavone quan trọng, có cấu trúc gần giống estrogen, được gọi là estrogen thực vật.

1.3. Tác Dụng Của Isoflavone Đối Với Sức Khỏe Con Người

Isoflavone có nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe, bao gồm giảm các triệu chứng mãn kinh, cải thiện chuyển hóa xương, giảm nguy cơ loãng xương, và có thể giảm nguy cơ ung thư. Nghiên cứu cho thấy isoflavone có thể làm giảm cường độ bốc hỏa và đổ mồ hôi ở phụ nữ mãn kinh, đồng thời cải thiện mật độ khoáng ở xương. Nhiều nghiên cứu cho thấy đậu nành chứa nhiều isoflavone và được coi là thực phẩm gia tăng nữ tính và bảo vệ phụ nữ giảm chứng bệnh như: tim mạch, rối loạn tiền mãn kinh, ung thư và loãng xương.

II. Thách Thức Trong Phân Tích Isoflavone Bằng Phương Pháp HPLC

Phân tích isoflavone trong hạt đậu nành bằng HPLC đối mặt với nhiều thách thức. Việc chiết xuất isoflavone hiệu quả, lựa chọn pha động và pha tĩnh phù hợp, và tối ưu hóa các điều kiện sắc ký là rất quan trọng. Sự phức tạp của thành phần mẫu đậu nành, sự hiện diện của nhiều hợp chất tương tự, và yêu cầu về độ nhạy và độ chính xác cao đòi hỏi quy trình phân tích phải được chuẩn hóa và kiểm soát chặt chẽ. Validation phương pháp HPLC là cần thiết để đảm bảo độ tin cậy của kết quả.

2.1. Chuẩn Bị Mẫu Đậu Nành Cho Phân Tích HPLC

Việc chuẩn bị mẫu đậu nành là bước quan trọng trong phân tích HPLC. Quá trình này bao gồm nghiền hạt đậu nành, chiết xuất isoflavone bằng dung môi thích hợp (ví dụ: cồn 80%), lọc để loại bỏ tạp chất, và cô đặc dịch chiết. Phương pháp chiết xuất có thể là chiết lắc thông thường hoặc chiết có hỗ trợ siêu âm. Mục tiêu là thu được dịch chiết chứa isoflavone với độ tinh khiết cao, sẵn sàng cho phân tích HPLC.

2.2. Lựa Chọn Pha Động và Pha Tĩnh Trong HPLC Phân Tích

Lựa chọn pha động và pha tĩnh phù hợp là yếu tố then chốt để đạt được sự tách biệt tốt các isoflavone trong HPLC. Pha tĩnh thường là cột C18, trong khi pha động là hỗn hợp dung môi như acetonitrile và nước, có thể chứa thêm acid acetic hoặc formic để điều chỉnh pH. Tỷ lệ pha động, tốc độ dòng, và nhiệt độ cột cần được tối ưu hóa để đạt được độ phân giải cao và thời gian phân tích hợp lý. Sắc ký đồ cần được đánh giá để đảm bảo các peak isoflavone được tách biệt rõ ràng.

2.3. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Sắc Ký Để Phân Tích Isoflavone

Tối ưu hóa các điều kiện sắc ký là cần thiết để đạt được kết quả phân tích isoflavone chính xác và tin cậy. Các yếu tố cần xem xét bao gồm: tỷ lệ thành phần pha động, tốc độ dòng, nhiệt độ cột, bước sóng phát hiện (sử dụng detector UV-Vis), và thời gian chạy chương trình. Việc khảo sát các điều kiện khác nhau và đánh giá sắc ký đồ giúp xác định điều kiện tối ưu cho việc tách và định lượng isoflavone.

III. Phương Pháp HPLC Xác Định Isoflavone Trong Hạt Đậu Nành

Phương pháp HPLC là công cụ mạnh mẽ để xác định và định lượng isoflavone trong hạt đậu nành. Quy trình bao gồm chuẩn bị mẫu đậu nành, chiết xuất isoflavone, phân tích HPLC với detector UV-Vis, và xử lý dữ liệu để xác định nồng độ isoflavone. Đường chuẩn được xây dựng bằng cách sử dụng các chất chuẩn isoflavone (daidzin, genistin, glycitin, daidzein, genistein, glycitein). Độ lặp lại và độ chính xác của phương pháp cần được đánh giá để đảm bảo tính tin cậy.

3.1. Quy Trình Chiết Xuất Isoflavone Từ Hạt Đậu Nành

Quy trình chiết xuất isoflavone từ hạt đậu nành bao gồm các bước: nghiền hạt đậu nành, chiết xuất bằng dung môi (ví dụ: cồn 80%), lọc để loại bỏ tạp chất, và cô đặc dịch chiết. Có thể sử dụng phương pháp chiết lắc thông thường hoặc chiết có hỗ trợ siêu âm để tăng hiệu quả chiết xuất. Dịch chiết thu được chứa isoflavone và các hợp chất khác, cần được phân tích bằng HPLC.

3.2. Phân Tích Định Tính Isoflavone Bằng HPLC UV Vis

Phân tích định tính isoflavone bằng HPLC-UV Vis dựa trên việc so sánh thời gian lưu của các peak trong sắc ký đồ với thời gian lưu của các chất chuẩn isoflavone. Detector UV-Vis được sử dụng để phát hiện các isoflavone dựa trên khả năng hấp thụ ánh sáng UV ở bước sóng đặc trưng. Việc xác định các isoflavone được thực hiện bằng cách so sánh sắc ký đồ của mẫu với sắc ký đồ của các chất chuẩn.

3.3. Phân Tích Định Lượng Isoflavone Bằng Phương Pháp Đường Chuẩn

Phân tích định lượng isoflavone bằng phương pháp đường chuẩn bao gồm việc xây dựng đường chuẩn bằng cách đo diện tích peak của các chất chuẩn isoflavone ở các nồng độ khác nhau. Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích peak và nồng độ. Nồng độ isoflavone trong mẫu được xác định bằng cách đo diện tích peak của mẫu và sử dụng đường chuẩn để tính toán nồng độ tương ứng.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Định Lượng Isoflavone Trong Mẫu Đậu Nành

Nghiên cứu đã thành công trong việc xác định và định lượng sáu hợp chất isoflavone (daidzin, genistin, glycitin, daidzein, genistein, glycitein) trong hạt đậu nành bằng phương pháp HPLC. Kết quả cho thấy hàm lượng isoflavone khác nhau tùy thuộc vào giống đậu nành và phương pháp chiết xuất. Độ lặp lại và độ chính xác của phương pháp được đánh giá là tốt, đảm bảo tính tin cậy của kết quả. Các kết quả này cung cấp thông tin quan trọng về thành phần isoflavone của đậu nành và có thể được sử dụng để đánh giá chất lượng và ứng dụng của đậu nành.

4.1. Đánh Giá Độ Lặp Lại Của Phép Đo HPLC Isoflavone

Độ lặp lại của phép đo HPLC được đánh giá bằng cách thực hiện nhiều lần đo trên cùng một mẫu và tính toán độ lệch chuẩn tương đối (RSD). RSD thấp cho thấy phép đo có độ lặp lại tốt, đảm bảo tính tin cậy của kết quả. Nghiên cứu đã đánh giá độ lặp lại của phép đo đối với từng isoflavone và kết quả cho thấy RSD nằm trong khoảng chấp nhận được.

4.2. Xác Định Giới Hạn Phát Hiện LOD và Giới Hạn Định Lượng LOQ

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) là các thông số quan trọng để đánh giá độ nhạy của phương pháp HPLC. LOD là nồng độ thấp nhất mà chất phân tích có thể được phát hiện, trong khi LOQ là nồng độ thấp nhất mà chất phân tích có thể được định lượng với độ chính xác chấp nhận được. Nghiên cứu đã xác định LOD và LOQ cho từng isoflavone.

4.3. So Sánh Hàm Lượng Isoflavone Giữa Các Phương Pháp Chiết Xuất

Nghiên cứu đã so sánh hàm lượng isoflavone thu được từ các phương pháp chiết xuất khác nhau (chiết lắc thông thường, chiết có hỗ trợ siêu âm). Kết quả cho thấy phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm cho hiệu quả chiết xuất cao hơn so với phương pháp chiết lắc thông thường. Điều này có thể là do siêu âm giúp phá vỡ tế bào đậu nành và tăng cường sự hòa tan của isoflavone vào dung môi.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu Isoflavone Trong Đậu Nành

Nghiên cứu này có nhiều ứng dụng thực tiễn trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm và sức khỏe. Kết quả có thể được sử dụng để đánh giá chất lượng đậu nành, lựa chọn giống đậu nành giàu isoflavone, và phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng và dược phẩm chứa isoflavone. Thông tin về hàm lượng isoflavone trong đậu nành cũng có thể giúp người tiêu dùng lựa chọn thực phẩm phù hợp để cải thiện sức khỏe.

5.1. Đánh Giá Chất Lượng Đậu Nành Dựa Trên Hàm Lượng Isoflavone

Hàm lượng isoflavone có thể được sử dụng như một chỉ số để đánh giá chất lượng đậu nành. Các giống đậu nành có hàm lượng isoflavone cao được coi là có giá trị dinh dưỡng và sức khỏe cao hơn. Kết quả nghiên cứu có thể giúp các nhà sản xuất và người tiêu dùng lựa chọn đậu nành có chất lượng tốt.

5.2. Phát Triển Thực Phẩm Chức Năng Chứa Isoflavone Từ Đậu Nành

Isoflavone từ đậu nành có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng có lợi cho sức khỏe, đặc biệt là cho phụ nữ. Các sản phẩm này có thể giúp giảm các triệu chứng mãn kinh, cải thiện sức khỏe tim mạch, và giảm nguy cơ loãng xương. Nghiên cứu này cung cấp thông tin quan trọng để phát triển các sản phẩm này.

5.3. Nghiên Cứu Tác Dụng Của Isoflavone Đối Với Sức Khỏe Phụ Nữ

Nghiên cứu về isoflavone trong đậu nành có thể giúp hiểu rõ hơn về tác dụng của isoflavone đối với sức khỏe phụ nữ, đặc biệt là trong giai đoạn mãn kinh. Các nghiên cứu lâm sàng có thể được thực hiện để đánh giá hiệu quả của isoflavone trong việc giảm các triệu chứng mãn kinh và cải thiện chất lượng cuộc sống của phụ nữ.

VI. Kết Luận Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Isoflavone HPLC

Nghiên cứu đã thành công trong việc xác định và định lượng isoflavone trong hạt đậu nành bằng phương pháp HPLC. Kết quả cung cấp thông tin quan trọng về thành phần isoflavone của đậu nành và có thể được sử dụng để đánh giá chất lượng và ứng dụng của đậu nành. Hướng nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng isoflavone trong đậu nành (ví dụ: giống, điều kiện trồng trọt, phương pháp chế biến) và đánh giá tác dụng của isoflavone đối với sức khỏe.

6.1. Tối Ưu Hóa Quy Trình HPLC Để Phân Tích Isoflavone Hiệu Quả Hơn

Nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình HPLC để phân tích isoflavone hiệu quả hơn, ví dụ như sử dụng các cột sắc ký mới, pha động cải tiến, hoặc kỹ thuật phát hiện tiên tiến hơn. Mục tiêu là tăng độ nhạy, độ phân giải, và tốc độ phân tích.

6.2. Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Của Điều Kiện Trồng Trọt Đến Isoflavone

Nghiên cứu có thể khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện trồng trọt (ví dụ: loại đất, phân bón, ánh sáng, nhiệt độ) đến hàm lượng isoflavone trong đậu nành. Kết quả có thể giúp các nhà nông lựa chọn điều kiện trồng trọt phù hợp để sản xuất đậu nành giàu isoflavone.

6.3. Đánh Giá Tác Dụng Của Isoflavone Đối Với Các Bệnh Lý Khác Nhau

Nghiên cứu có thể đánh giá tác dụng của isoflavone đối với các bệnh lý khác nhau, ví dụ như bệnh tim mạch, ung thư, loãng xương, và các bệnh liên quan đến tuổi tác. Các nghiên cứu lâm sàng có thể được thực hiện để đánh giá hiệu quả của isoflavone trong việc phòng ngừa và điều trị các bệnh này.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Đậu nành (tên khoa học: Glycine max (L.) Merrill) thuộc họ Đậu (Fabaceae) là cây trồng có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao, chứa hàm lượng protein vượt trội (chiếm 35–45% khối lượng khô với đầy đủ các amino acid thiết yếu), chất béo (15–20%), carbohydrate (15–25%), các khoáng chất (Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S) cùng nhiều nhóm vitamin nhóm B, A, D, E. Bên cạnh giá trị dinh dưỡng, hạt đậu nành còn chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng, tiêu biểu là nhóm isoflavone. Isoflavone là các hợp chất polyphenolic thuộc phân nhóm flavonoid, có cấu trúc và chức năng tương tự nội tiết tố nữ estrogen ở người (thường được gọi là phytoestrogen hay estrogen thực vật). Các nghiên cứu y học cho thấy isoflavone mang lại nhiều tác động tích cực đối với sức khỏe con người, bao gồm: hỗ trợ chuyển hóa xương (ức chế hoạt tính hủy cốt bào, giảm nguy cơ loãng xương), giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch và động mạch vành (hạ huyết áp tâm trương, giảm cholesterol toàn phần, giảm cholesterol xấu LDL, cải thiện độ đàn hồi thành mạch và chống oxy hóa), hỗ trợ làm giảm các triệu chứng vận mạch ở phụ nữ tiền mãn kinh (bốc hỏa, đổ mồ hôi đêm, mất ngủ, trầm cảm), đồng thời góp phần ức chế sự phát triển của một số khối u ung thư (ung thư vú, ung thư ruột).

Tại Việt Nam, nguồn nguyên liệu đậu nành rất dồi dào, nhiều địa phương có diện tích canh tác lớn với các giống có phẩm chất tốt như giống Đ2101 tại huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam (thời gian sinh trưởng 90–100 ngày, số quả đạt 38–42 quả/cây, khối lượng 170–185 g/1000 hạt, hàm lượng protein 41,0% và lipid 19,9%). Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu trong nước về quy trình chiết tách và định lượng hoàn chỉnh các cấu tử isoflavone từ hạt đậu nành bằng các kỹ thuật phân tích hiện đại vẫn còn hạn chế so với thế giới. Xuất phát từ thực tế đó, đề tài "Bước đầu xác định sáu hợp chất isoflavone có trong hạt đậu nành bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC" được thực hiện.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài gồm 3 nội dung chính:

1. Khảo sát các điều kiện tối ưu để xác định sáu hợp chất isoflavone từ dịch chiết bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
2. Khảo sát các quy trình xử lý mẫu để xác định isoflavone bằng phương pháp HPLC.
3. Xác định sáu hợp chất isoflavone trong hạt đậu nành bằng phương pháp HPLC.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Mẫu hạt đậu nành giống Đ2101 thu mua tại địa bàn huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam và sáu hợp chất isoflavone chuẩn bao gồm 3 dạng aglucon (Daidzein, Glycitein, Genistein) cùng 3 dạng glucosid (Daidzin, Glycitin, Genistin).
• Phạm vi không gian: Thực nghiệm được tiến hành tại hệ thống phòng thí nghiệm Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng (địa chỉ: số 459 Tôn Đức Thắng, phường Hòa Khánh Nam, quận Liên Chiểu, thành phố Đà Nẵng).
• Phạm vi thời gian: Đề tài được tiếp nhận từ ngày 01 tháng 01 năm 2018 và hoàn thành bảo vệ vào ngày 27 tháng 04 năm 2018.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

• Cấu trúc và hóa học của isoflavone: Isoflavone có khung cấu trúc cơ bản gồm hai vòng benzen A và B liên kết với dị vòng pyron C. Trong hạt đậu nành, isoflavone tồn tại ở 4 dạng hóa học gồm: dạng tự do (aglucon: daidzein, glycitein, genistein), dạng liên kết glucoside (daidzin, glycitin, genistin), dạng acetyl-glucoside (acetyl-daidzin, acetyl-glycitin, acetyl-genistin) và dạng malonyl-glucoside (malonyl-daidzin, malonyl-glycitin, malonyl-genistin), tạo nên tổng cộng 12 đồng phân. Các dạng glucoside có phân tử lượng lớn, tính phân cực cao, khó hấp thu trực tiếp qua niêm mạc ruột non; khi vào đường tiêu hóa, chúng cần được thủy phân bởi enzyme glycosidase (do hệ vi khuẩn đường ruột như Lactobacillus sporogenes tiết ra) để chuyển thành dạng aglycon có hoạt tính sinh học cao.
• Lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC): Phân tích dựa trên cơ chế phân bố và tương tác giữa pha tĩnh không phân cực (cột octadecyl silane C18/ODS) và pha động phân cực (nước cất khử ion chứa chất điều chỉnh pH và dung môi hữu cơ phân cực acetonitrile). Các đại lượng sắc ký học được tác giả áp dụng để đánh giá hệ thống gồm: thời gian lưu thực ($t'_R$), hệ số dung lượng ($k'$, khoảng tối ưu 1–5), độ chọn lọc ($\alpha$), số đĩa lý thuyết ($N$, thực tế từ 2500–5500 đĩa), độ phân giải giữa hai peak cạnh nhau ($R \ge 1{,}5$ đối với phép định lượng) và hệ số không đối xứng của peak sắc ký ($T \le 2{,}5$).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Phương pháp chuẩn bị và trích ly mẫu:
  • Xử lý sơ bộ nguyên liệu: Hạt đậu nành được làm sạch, sấy ở nhiệt độ 55–60°C trong tủ sấy để hạ độ ẩm, chống nấm mốc, sau đó xay mịn, rây lấy bột đồng nhất và bảo quản ở nhiệt độ lạnh sâu -20°C trong lọ thủy tinh kín.
  • Phương pháp chiết lắc thông thường dạng cao chiết: Trộn bột mẫu với dung môi chiết, lắc với vận tốc 140 vòng/phút, ly tâm tách bã ở 5000 vòng/phút trong 5 phút, lọc chân không, sấy dịch chiết ở 60°C đến khối lượng không đổi để thu cao chiết, sau đó hòa tan lại bằng dung môi để đo HPLC.
  • Phương pháp chiết lắc có hỗ trợ siêu âm: Cắm ngập đầu dò siêu âm vào hỗn dịch bột mẫu và dung môi, kết hợp khuấy gia nhiệt, sau đó ly tâm và lọc chân không.
  • Quy trình xử lý mẫu thử theo tiêu chuẩn AOAC 2008:83: Khảo sát và so sánh 3 quy trình trên mẫu hạt khô gồm: (1) Chiết lắc 60 phút ở 140 vòng/phút; (2) Chiết siêu âm 30 phút; (3) Chiết siêu âm 10 phút kết hợp lắc 60 phút; cùng quy trình xử lý mẫu dịch chiết bằng cồn 80°. Toàn bộ dịch đo trước khi bơm vào hệ thống HPLC đều được lọc qua màng lọc màng PTFE kích thước lỗ 0,2–0,45 µm.
• Phương pháp phân tích công cụ HPLC:
  • Thiết bị: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200 trang bị bơm cao áp, bộ khử khí chân không, buồng điều nhiệt cột và đầu dò quang phổ tử ngoại (UV Detector).
  • Pha tĩnh: Cột sắc ký pha đảo Octadecyl silane (ODS / C18) kích thước 250 mm × 4,6 mm, kích thước hạt nhồi 5 µm.
  • Pha động: Rửa giải theo chương trình gradient nồng độ giữa Kênh B (nước cất khử ion chứa 0,05% acid phosphoric $\text{H}_3\text{PO}_4$) và Kênh C (Acetonitrile HPLC độ tinh khiết 99,8%).
  • Điều kiện vận hành: Tốc độ dòng pha động 1,5 ml/phút, bước sóng phát hiện 260 nm, nhiệt độ buồng cột 40°C, thể tích tiêm mẫu 10 µl.
• Phương pháp thẩm định và xử lý số liệu:
  • Xây dựng đường chuẩn từ dãy 5 dung dịch chuẩn làm việc (STD1 đến STD5) của 6 chất isoflavone để thiết lập phương trình hồi quy tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ chất phân tích.
  • Đánh giá độ lặp lại của hệ thống sắc ký thông qua 5 lần tiêm lặp lại cùng một mẫu chuẩn hỗn hợp, tính toán giá trị trung bình ($\bar{X}$), độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu.
  • Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp đối với từng cấu tử isoflavone.

Nguồn dữ liệu và hóa chất

• Mẫu hạt đậu nành giống Đ2101 thu thập thực tế tại huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam.
• Các chất chuẩn tinh khiết daidzin, glycitin, genistin, daidzein, glycitein, genistein từ hãng Sigma (Hoa Kỳ) được cung cấp thông qua sự hỗ trợ của Công ty Sữa đậu nành Việt Nam Vinasoy (chuẩn gốc Stock pha trong DMSO, chuẩn làm việc pha trong dung môi Acetonitrile 40%).
• Hóa chất phân tích gồm Acetonitrile tinh khiết HPLC 99,8%, Cồn tuyệt đối $\ge 99{,}7%$ (Đức Giang Lào Cai), acid phosphoric $\text{H}_3\text{PO}_4$, nước cất 2 lần và nước cất đề ion.

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Tổng quan tài liệu

Chương I hệ thống hóa toàn bộ cơ sở lý luận liên quan đến đối tượng nghiên cứu và phương pháp phân tích. Tác giả trình bày vị trí phân loại học thực vật của đậu nành (Glycine max), đặc điểm hình thái và giải phẫu hạt gồm 3 phần: vỏ hạt (chiếm 8% khối lượng, chứa sắc tố anthocyanin), phôi hạt (chiếm 2% khối lượng, là bộ phận có nồng độ isoflavone cao nhất) và tử diệp/nhân hạt (chiếm 90% khối lượng, chứa phần lớn hàm lượng protein và dầu). Thành phần hóa học tổng quát của hạt đậu nành gồm 35–45% protein, 15–20% chất béo, 15–25% carbohydrate, 5% tro và 8% nước.

Chương này đi sâu phân loại chi tiết 12 dạng đồng phân isoflavone trong đậu nành thuộc 3 nhóm chính: Aglucon (Daidzein, Glycitein, Genistein), Glucoside (Daidzin, Glycitin, Genistin) và các dẫn xuất Acetyl/Malonyl tương ứng; làm rõ cơ chế chuyển hóa sinh học nhờ vi khuẩn đường ruột tiết glycosidase để tạo thành aglycon hấp thu tại ruột non. Tác giả tổng hợp các bằng chứng dược lý về tác dụng của isoflavone đối với chuyển hóa mô xương, cải thiện chỉ số mỡ máu, giảm nguy cơ xơ vữa động mạch, cải thiện triệu chứng mãn kinh và giới thiệu các sản phẩm thương mại chứa isoflavone (No-GMO Soy Isoflavone, Calcium 600+ with Soy Isoflavone, Doppelherz Aktiv-Meno).

Về tình hình nghiên cứu, tác giả tổng thuật các nghiên cứu quốc tế về dung môi trích ly (nghiên cứu của Eldrige 1982, Murphy 1981 chỉ ra hỗn hợp acetonitrile/nước và methanol cho hiệu suất trích ly cao), công trình của Viện Ung thư Quốc gia Mỹ (1990) về vai trò của genistein, các quy trình HPLC phân tích isoflavone tại Hàn Quốc (dùng hệ Shimadzu DAD, cột C18, dung môi $0{,}1%$ acetic acid/ACN) và Australia. Tại Việt Nam, tác giả điểm lại nghiên cứu của Đỗ Thị Hoa Viên (2004) về chiết tách và định lượng genistein, daidzein từ đậu tương và sắn dây, từ đó chỉ ra sự cần thiết của việc xây dựng quy trình phân tích đồng thời 6 cấu tử isoflavone trên mẫu đậu nành địa phương. Phần cuối chương trình bày chi tiết nguyên lý hoạt động của hệ thống HPLC, chức năng các bộ phận cấu thành (bình dung môi, bộ khử khí, bơm cao áp, bộ tiêm mẫu, cột sắc ký, detector UV/Vis, DAD, ELSD, huỳnh quang), các thông số đặc trưng của sắc ký đồ ($t_R, k', \alpha, N, R, T$) và nguyên tắc lựa chọn pha tĩnh, pha động trong sắc ký pha đảo RP-HPLC.

Chương 2: Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm, hóa chất, thiết bị và phương pháp phân tích:

• Trình bày nguồn gốc nguyên liệu hạt đậu nành giống Đ2101 tại Đại Lộc, Quảng Nam; các bước tiền xử lý gồm rửa sạch, sấy ở 55–60°C, nghiền mịn, rây và bảo quản ở -20°C.
• Liệt kê thông số kỹ thuật của hệ thống HPLC Agilent 1200 cùng các thiết bị phụ trợ (máy ly tâm, thiết bị siêu âm đầu dò, thiết bị cô quay chân không, máy lắc ngang, tủ sấy, cân phân tích).
• Thiết lập quy trình công nghệ chiết isoflavone dạng cao chiết bằng phương pháp chiết lắc (140 vòng/phút, ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút, lọc chân không, sấy 60°C) và quy trình chiết lắc có hỗ trợ siêu âm đầu dò.
• Khảo sát các điều kiện sắc ký tối ưu: Chọn bước sóng đo quang phổ 260 nm (dựa trên vùng hấp thụ cực đại 250–265 nm của 6 chất), chọn tốc độ dòng pha động 1,5 ml/phút, thể tích tiêm 10 µl, nhiệt độ cột 40°C trên cột pha đảo C18. Thiết lập 3 hệ chương trình rửa giải gradient dung môi giữa Kênh B (nước cất khử ion chứa 0,05% $\text{H}_3\text{PO}_4$) và Kênh C (Acetonitrile).
• Chuẩn bị dãy 5 nồng độ chuẩn làm việc (STD1–STD5) từ dung dịch chuẩn gốc do Công ty Vinasoy cung cấp; xây dựng chi tiết 4 quy trình xử lý mẫu phân tích gồm: quy trình xử lý mẫu dịch chiết bằng cồn 80° và 3 quy trình xử lý mẫu hạt khô theo tiêu chuẩn AOAC (phương pháp lắc, phương pháp siêu âm 30 phút, phương pháp siêu âm 10 phút kết hợp lắc 60 phút).
• Trình bày công thức toán học tính toán hàm lượng isoflavone tổng số ($X$) trên khối lượng chất khô và các công thức tính giá trị trung bình $\bar{X}$, độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD) để đánh giá độ lặp lại của hệ thống sắc ký.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm và thảo luận kết quả phân tích:

• Kết quả khảo sát 3 hệ tỷ lệ pha động gradient: Đánh giá sắc ký đồ thu được từ các hệ dung môi, từ đó lựa chọn Hệ 1 là hệ pha động tối ưu mang lại khả năng phân tách hoàn toàn 6 peak isoflavone với đường nền ổn định, độ phân giải sắc ký $R$ đạt yêu cầu và thời gian phân tích hợp lý.
• Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính: Tiến hành đo dãy dung dịch chuẩn STD1 đến STD5, thu thập diện tích peak tương ứng của từng chất (Daidzin, Glycitin, Genistin, Daidzein, Glycitein, Genistein), thiết lập đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak, xác định phương trình đường chuẩn cho từng chất.
• Kết quả đánh giá độ lặp lại của hệ thống HPLC: Dựa trên kết quả tiêm lặp lại 5 lần mẫu chuẩn hỗn hợp, tính toán độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD của thời gian lưu ($t_R$) cho từng chất trong số 6 hợp chất isoflavone.
• Kết quả xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) cho 6 hợp chất.
• Kết quả định tính và định lượng trên các mẫu thực:
  • So sánh sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu dịch thử để định danh sự có mặt của 6 hợp chất isoflavone trong mẫu cao hạt đậu nành, dịch hạt chiết bằng cồn 80%, mẫu hạt khô và mẫu dịch bã đậu nành.
  • Định lượng hàm lượng từng cấu tử isoflavone trong mẫu dịch hạt chiết bằng cồn 80°.
  • Định lượng và so sánh hàm lượng isoflavone thu được trong 1 g mẫu hạt khô được xử lý theo 3 quy trình AOAC: phương pháp siêu âm, phương pháp lắc đơn thuần và phương pháp lắc kết hợp siêu âm.

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng và thông số thực nghiệm chính

Đề tài đã xây dựng thành công bộ thông số vận hành trên hệ thống HPLC Agilent 1200 phục vụ phân tích đồng thời 6 cấu tử isoflavone:

Thông số sắc ký	Điều kiện thiết lập tối ưu
Cột sắc ký (Pha tĩnh)	Cột pha đảo Octadecyl silane (ODS / C18, kích thước 250 mm × 4,6 mm, cỡ hạt 5 µm)
Đầu dò phát hiện	UV Detector bước sóng cố định $\lambda = 260\text{ nm}$
Tốc độ dòng pha động	$1{,}5\text{ ml/phút}$
Nhiệt độ buồng cột	$40^\circ\text{C}$
Thể tích mẫu tiêm	$10\text{ }\mu\text{l}$
Thành phần pha động	Pha động B: Nước khử ion chứa $0{,}05%\text{ H}_3\text{PO}_4$; Pha động C: Acetonitrile ($99{,}8%$)
Chế độ rửa giải	Rửa giải theo chương trình gradient nồng độ

Khoảng nồng độ làm việc của dãy dung dịch chuẩn (STD1–STD5) được thiết lập phục vụ xây dựng đường chuẩn định lượng:

Mẫu chuẩn	Daidzin ($\mu\text{g/ml}$)	Glycitin ($\mu\text{g/ml}$)	Genistin ($\mu\text{g/ml}$)	Daidzein ($\mu\text{g/ml}$)	Glycitein ($\mu\text{g/ml}$)	Genistein ($\mu\text{g/ml}$)
STD1	17,18	6,10	16,91	2,48	1,92	1,68
STD2	25,77	9,15	25,36	3,71	2,88	2,52
STD3	51,55	18,31	50,72	7,43	5,76	5,03
STD4	100,12	35,56	98,51	14,43	11,18	9,77
STD5	150,03	53,28	147,61	21,63	16,75	14,64

Đóng góp của đề tài

• Khảo sát và thiết lập được điều kiện sắc ký pha đảo RP-HPLC phù hợp với trang thiết bị phòng thí nghiệm để tách và định danh đồng thời 6 hợp chất isoflavone chủ yếu (gồm 3 aglycon và 3 glucoside) trong hạt đậu nành.
• Khảo sát và so sánh hiệu quả của các kỹ thuật xử lý mẫu chiết xuất khác nhau (chiết cồn 80°, chiết lắc, chiết siêu âm và chiết lắc kết hợp siêu âm theo tiêu chuẩn AOAC), cung cấp dẫn liệu thực nghiệm phục vụ việc lựa chọn quy trình tách chiết tối ưu.
• Bổ sung dữ liệu phân tích thành phần hoạt chất isoflavone trên giống đậu nành địa phương Đ2101 trồng tại huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam vào nguồn tư liệu nghiên cứu hóa thực vật và kiểm nghiệm dược liệu trong nước.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Do điều kiện kinh phí phòng thí nghiệm và giá thành chất chuẩn gốc cao, tác giả không pha trực tiếp từ chất chuẩn gốc đơn lẻ mà sử dụng dãy dung dịch chuẩn làm việc pha sẵn từ dung dịch Stock (với sự hỗ trợ của Công ty Vinasoy).
• Đề tài mới dừng lại ở bước đầu khảo sát 6 hợp chất isoflavone chính (3 dạng aglucon và 3 dạng glucosid tự do), chưa tiến hành định lượng toàn diện cả 12 đồng phân (chưa phân tách riêng các dạng acetyl-glucosid và malonyl-glucosid).
• Đối tượng thực nghiệm mới chỉ tập trung trên mẫu hạt đậu nành của một giống cụ thể (Đ2101) thu thập tại một địa bàn (Đại Lộc, Quảng Nam), chưa mở rộng so sánh đối chứng giữa nhiều giống đậu nành và các vùng sinh thái trồng trọt khác nhau.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Mở rộng phạm vi nghiên cứu định lượng isoflavone trên các bộ phận phụ phẩm khác của cây đậu nành và quá trình chế biến (như mầm đậu nành, vỏ hạt, bã đậu phụ/okara) nhằm tối ưu hóa việc tận dụng phế phụ phẩm công nghiệp thực phẩm.
• Nghiên cứu sâu hơn về quy trình thủy phân bằng enzyme glycosidase chuyên biệt hoặc công nghệ lên men vi sinh để chuyển hóa triệt để dạng liên kết glucoside sang dạng tự do aglycon nhằm nâng cao khả năng hấp thu sinh học.
• Tối ưu hóa và nâng quy mô quy trình trích ly hoạt chất isoflavone định hướng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng và dược phẩm.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên và nghiên cứu viên ngành Hóa học, Hóa phân tích, Hóa dược, Công nghệ thực phẩm và Kiểm nghiệm chất lượng: Tham khảo chi tiết phương pháp xây dựng điều kiện sắc ký lỏng pha đảo RP-HPLC (lựa chọn bước sóng UV, cấu hình cột C18, thiết lập chương trình gradient dung môi acetonitrile/nước có acid) và các bước thẩm định phương pháp phân tích công cụ (khảo sát khoảng tuyến tính, đánh giá độ lặp lại SD/RSD, xác định LOD/LOQ).
• Cán bộ kỹ thuật phòng kiểm nghiệm và nghiên cứu phát triển (R&D) trong ngành chế biến đậu nành: Tham khảo các quy trình xử lý mẫu trích ly isoflavone theo chuẩn AOAC (so sánh giữa chiết lắc, chiết siêu âm và chiết kết hợp), hỗ trợ việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và kiểm soát hàm lượng hoạt chất trong nguyên liệu và sản phẩm đậu nành.

Câu hỏi thường gặp

1. Khóa luận xác định những hợp chất isoflavone cụ thể nào trong hạt đậu nành?
Khóa luận xác định 6 hợp chất isoflavone chia làm hai nhóm: nhóm aglucon (dạng tự do) gồm Daidzein, Glycitein, Genistein và nhóm glucosid (dạng liên kết) gồm Daidzin, Glycitin, Genistin.

2. Tại sao tác giả lựa chọn bước sóng phát hiện 260 nm trên đầu dò UV của máy HPLC?
Qua việc khảo sát phổ hấp thụ quang học của 6 hợp chất isoflavone chuẩn, tác giả nhận thấy các chất này đều có bước sóng hấp thu cực đại nằm trong khoảng từ 250 nm đến 265 nm. Do đó, bước sóng 260 nm được lựa chọn làm bước sóng đo chung tối ưu để phân tích đồng thời cả 6 chất trên đầu dò UV-Vis cố định bước sóng.

3. Mẫu nguyên liệu đậu nành sử dụng trong khóa luận có đặc tính và xuất xứ như thế nào?
Nguyên liệu sử dụng là hạt đậu nành giống Đ2101 thu mua tại huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam. Giống Đ2101 có thời gian sinh trưởng 90–100 ngày, số lượng 38–42 quả/cây, khối lượng 1000 hạt đạt 170–185 g, hạt màu vàng đẹp, tỷ lệ protein chiếm 41,0% và lipid chiếm 19,9%.

4. Khóa luận đã khảo sát và so sánh những quy trình xử lý mẫu hạt khô nào theo chuẩn AOAC?
Tác giả đã tiến hành khảo sát và so sánh 3 quy trình xử lý mẫu hạt khô theo AOAC: (1) Chiết bằng phương pháp lắc ở tốc độ 140 vòng/phút trong 60 phút; (2) Chiết bằng phương pháp siêu âm đơn thuần trong 30 phút; (3) Chiết bằng phương pháp siêu âm 10 phút kết hợp lắc ở tốc độ 140 vòng/phút trong 60 phút.

5. Hệ pha động và pha tĩnh được lựa chọn cho hệ thống sắc ký HPLC Agilent 1200 là gì?
Hệ thống sử dụng pha tĩnh là cột sắc ký pha đảo Octadecyl silane (ODS / C18, kích thước 250 mm × 4,6 mm, cỡ hạt 5 µm) và pha động gồm 2 kênh chạy theo chương trình gradient: Kênh B chứa nước cất khử ion có bổ sung $0{,}05%\text{ acid phosphoric } (\text{H}_3\text{PO}_4)$ và Kênh C chứa dung môi Acetonitrile (ACN).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Võ Văn Hùng đã hoàn thành đầy đủ các mục tiêu đề ra trong việc khảo sát và thiết lập quy trình phân tích đồng thời 6 hợp chất isoflavone (Daidzin, Glycitin, Genistin, Daidzein, Glycitein, Genistein) trong hạt đậu nành giống Đ2101 (Đại Lộc, Quảng Nam) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) trên hệ thống Agilent 1200. Nghiên cứu đã tối ưu hóa các điều kiện vận hành sắc ký (bước sóng UV 260 nm, tốc độ dòng 1,5 ml/phút, nhiệt độ buồng cột 40°C, cột C18), đồng thời so sánh thực nghiệm hiệu quả trích ly của các quy trình xử lý mẫu theo tiêu chuẩn AOAC. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học và dữ liệu thực nghiệm có giá trị phục vụ công tác kiểm nghiệm, nghiên cứu hóa thực vật và định hướng ứng dụng nguồn nguyên liệu đậu nành trong công nghệ thực phẩm và dược phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

LỜI MỞ ĐẦU Isoflavone là hợp chất polyphenolic, có nguồn gốc từ phytoestrogen thực vật. Isoflavone là hoạt chất có cơ chế hoạt động và chức năng gần giống như nội tiết tố nữ estrogen ở người, vì thế các nhà khoa học gọi là estrogen thảo mộc (plant estrogen). Isoflavone rất nhiều chức năng có lợi cho cơ thể con người, duy trì tuổi thanh xuân cho phụ nữ, giảm được ung thư vú, ung thư cổ tử cung, giảm được hàm lượng cholesterol, phòng tránh được các bệnh về tim mạch, loãng xương, giảm được các triệu chứng mãn kinh như bốc hỏa, đổ mồ hôi, trầm cảm.Cho nên isoflavone được bổ sung vào trong các thực phẩm chức năng để cải thiện sức khỏe của con người. Nguồn nguyên liệu để sản xuất isoflavone rất phong phú như hạt ngũ cốc, rau quả, nhưng đậu nành là nguồn nguyên liệu chủ yếu bởi vì hàm lượng isoflavone trong đậu nành khá cao đặc biệt trong đậu nành nảy mầm.

Cùng với hàng ngàn dược liệu quý có ở Việt Nam, đậu nành là một trong những dược liệu quý, đậu nành đã được biết đến là thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao vì chứa hàm lượng protein cao hơn bất kỳ loại nông sản nào. Trong đậu nành còn chứa rất nhiều khoáng chất, các sinh tố B đặc biệt là các hóa chất thảo mộc có khả năng ngăn ngừa trị liệu bệnh tật. Điều này làm các nhà khoa học say mê nghiên cứu là khám phá ra các hóa thảo mộc có trong đậu nành và những ứng dụng của chúng trong lĩnh vực y khoa trị liệu, trong đó các isoflavones là loại hóa chất thảo mộc mang lại nhiều ứng dụng. Đồng thời, với mong muốn đóng góp một phần vào kho tư liệu của nhà nước, chính vì vậy mà em tiến hành thực hiện đề tài: “Bước đầu xác định sáu hợp chất isoflavone có trong hạt đậu nành bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC” CHƢƠNG I.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ĐẬU NÀNH [3] 1. Nguồn gốc và đặc điểm a) Nguồn gốc  Giới : Plantae  Ngành: Magnoliophyta  Lớp: Magnoliopsida  Bộ: Fabales  Họ: Fabaceae  Phân họ: Faboideae  Chi: Glycine  Loại: G. Cây đậu nành (nguồn: tác giả) Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành (tên khoa học Glycine max (L) Merrill) là loại cây họ Đậu (Fabaceae) giàu hàm lượng protein, trên thế giới có 1000 loại đậu tương với nhiều đặc điểm khác nhau, hạt đậu nành có giá trị dinh dưỡng và kinh tế rất cao.

Quả đậu dài có nhiều lông vàng, mỗi quả có từ 1-4 hạt, thông thường có 2-3 hạt. Hạt hình cầu hay hình bầu dục, có màu sắc thay đổi tùy theo giống cây trồng (màu vàng, đen, nâu, xanh). Trọng lượng một hạt đậu tương thay đổi từ 20- 400mg/hạt. b) Đặc điểm  Hình dạng: hạt đậu nành có nhiều hình dạng khác nhau từ tròn tới thon và dẹt.

 Màu sắc: vàng xanh, xám, nâu hoặc đen và các màu trung gian. Phần lớn màu vàng, loại đậu nành màu vàng là loại tốt nên thường được ưa chuộng.  Kích thước: có 3 loại, to là loại 1000 hạt nặng 300g trở lên, trung bình là loại 1000 hạt nặng 100 - 300g, nhỏ là loại 1000 hạt nặng dưới 150g.  Cấu trúc hạt đậu nành gồm 3 thành phần: + Vỏ (chiếm 8%) là lớp ngoài cùng có chức năng bảo vệ phôi khỏi nấm và chống nhiễm vi khuẩn trong quá trình tồn trữ, có nhiều màu khác nhau nhưng đặc trưng cho từng loại giống thường có màu vàng hay màu trắng.

Màu sắc của hạt thay đổi tùy theo giống và là đặc điểm để phân biệt giống, vỏ hạt chứa sắc tố anthocyanin tùy theo hàm lượng sắc tố này mà hạt có 4 màu khác nhau: vàng, nâu, xanh, đen. 1 + Phôi ( chiếm 2%) là phần sinh trưởng của hạt khi lên mầm, chứa hai lá mầm và có chức năng dự trữ dinh dưỡng. Ngoài ra, phôi có 3 bộ phận khác: rễ mầm, trụ dưới lá mầm và trụ trên lá mầm. + Nhân (hay tử diệp chiếm 90%) gồm 2 lá mầm tích trữ lượng liệu của hạt, chiếm phần lớn khối lượng hạt, chứa lượng đạm và dầu cao nhất trong toàn hạt.

Hình ảnh hạt đậu nành (nguồn: tác giả)  Giống đậu nành Đ2101- tại địa bàn Quảng Nam, huyện Đại Lộc: + Thời gian gieo trồng trung bình (90-100 ngày), có khả năng sinh trưởng phát triển tốt, cứng, chống chịu sâu, bệnh tốt, thích hợp với gieo trồng cho vụ Xuân (gieo từ tháng 11 âm lịch đến tháng 2) và vụ Đông. + Có số quả/ cây nhiều từ 38-42 quả và có khối lượng hạt lớn (170-185 gam), hạt màu vàng đẹp, có chất lượng hạt khá (protein 41,0% và lipit 19,9%). Hình ảnh giống đậu nành Đ2101 (nguồn: tác giả) 1. Thành phần hóa học trong đậu nành 2  8% nước  35-45% chất đạm với đủ các loại amino acid cần thiết (isoleucin,  5% chất vô cơ lysin, methionin, pheny lalanin,  15-25% glucose tryptophan, valin)  15-20% chất béo  Các vitamin A, B1, B2, D, E, F,  Nhiều sinh tố, khoáng chất, Ca, các enzyme, sáp nhựa, cellulose.

Fe, Mg, P, K, Na, S Hạt đậu nành là thành phần có giá trị sử dụng cao nhất vì nó không những chứa đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết mà còn tồn tại các hóa thảo mộc có tác dụng phòng ngừa và điều trị bệnh đặc biệt là các căn bệnh thời đại như: bệnh ung thư, các bệnh liên quan đến tim mạch. Thành phần và cấu trúc của từng thành phần trong hạt đậu tương phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm giống, mùa vụ, vùng địa lí, và môi trường. Thành phần tổng quát của đậu nành được trình bày trong bảng dưới đây. Thành phần hóa học của đậu nành Tỷ lệ khối Thành phần Tỷ lệ phần trăm (%) lượng Protein Lipit Cacbonhydate Tro Lá mầm 90 43 23 43 5 Vỏ 8 9 1 86 4.3 Trụ dưới lá mầm 2 41 11 43 4.

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ISOFLAVONE 1. Nguồn gốc Isoflavone Isoflavone có nguồn gốc phytoestrogen thực vật thuộc nhóm các hợp chất flavonoid. Chúng là các hợp chất phenolic, có cấu trúc và sự vận hành giống như estrogen ở người, vì thế còn được gọi là estrogen thảo mộc. Trong tự nhiên, các isoflavone được thấy có nhiều trong các loại thực vật như: các loại đậu khác nhau, 3 cỏ ba lá đỏ, cỏ linh lăng, củ sắn dây.

trong đó hàm lượng cao nhất là ở đậu nành và các thực phẩm có chứa đậu nành [10]. Ở cây đậu nành, isoflavone có trong toàn bộ các phần: hạt, lá, cuống, mầm và rễ. Trong hạt đậu nành thì phôi có hàm lượng isoflavone cao nhất. Thành phần hóa học, tính chất, cấu trúc của isoflavone Isoflavone là các chất hữu cơ thuộc nhóm polyphenolic (các chất có nhiều vòng phenyl) có liên quan với các flavonoid (isoflavone và flavonoid khác nhau ở vị trí gắn của vòng benzen) và nó có nhiều lợi ích cho sức khỏe [10], [3].

Cấu trúc cơ bản của isoflavone gồm 2 vòng benzen: A và B nối với dị vòng pyron C. Cấu trúc hóa học của isoflavones [1] Isoflavone trong hạt đậu nành tồn tại ở dạng tự do (aglucon) và dạng liên kết (glucosid), bao gồm: daidzin, genistin, glycitin, các malonyl và axetyl tương ứng của chúng, trong một số trường hợp chúng có mặt ở cả 4 dạng hóa học với mỗi dạng có chứa ba đồng phân và tạo nên 12 loại cụ thể: 1. Cấu trúc hóa học của các aglucon 2. 6 Cấu trúc hóa học của các - Glucozit 3.

Acetyl-glucosides (acetyl-daidzin, acetyl-genistin, và acetyl-glycitin) Cấu trúc hóa học của các isoflavone của 4 nhóm trên được cho ở bảng 1.2 bởi tác giả Mortensen cùng các cộng sự. Danh sách của các isoflavones [1],[3]. Tên R1 R2 R3 Daidzein H H H Glycitein H OCH3 H Genistein OH H H Daidzin H H Glucosyl Glycitin H OCH3 Glucosyl Genistin OH H Glucosyl Acetyl hoặc Glucosyl-COCH3 hoặc H H Manolyl daidzin Glucosyl-COCH2COOH Acetyl hoặc H OCH3 Glucosyl-COCH3 hoặc 5 Manolyl glycitin Glucosyl-COCH2COOH Acetyl hoặc Glucosyl-COCH3 hoặc OH H Manolyl genistin Glucosyl-COCH2COOH Có hai loại isoflavone quan trọng trong đậu nành là daidzein và genistein, hợp chất này có cấu trúc hóa học gần giống kích thích tố nữ estrogen. Còn được gọi là estrogen thực vật (phytoestrogen).

Estrogen thực vật có tác dụng tương tự như estrogen tự nhiên nhưng yếu hơn. Genistin và daidzin là những phân tử tương đối lớn, tan tốt trong nước, tính phân cực cao, nên khó hấp thu qua ống tiêu hóa. Muốn cho dễ hấp thu và trở nên có giá trị sinh học, phải thủy phân chúng thành các aglycon, tức làm mất thành phần glycozit trong phân tử. Muốn vậy, cần có xúc tác các enzym đặc hiệu là glycosidese.

Ống tiêu hóa của người không tạo được glycosidase, nên cơ thể không thể thủy phân được isoflavone và isoflavone chưa có giá trị sinh học. Ngược lại, một số tạp khuẩn định cư trong ruột sẽ tạo glycosidase cần cho quá trình thủy phân nêu trên, giúp cho sự hấp thụ các isoflavone.Các aglycon sẽ hấp thu ở ruột non. Nồng độ đỉnh của aglycon trong máu chỉ đạt được 4-6 giờ sau khi uống chất chiết xuất từ hạt đậu nành, tức là khi các glycozit đã được thủy phân qua xúc tác enzym của tạp khuẩn tại ruột. Lactobacillus sporogenes là vi khuẩn chính sản xuất glycosidase giúp cân bằng tạp khuẩn ruột, xúc tác cho thủy phân daidzin và genistin sang daidzein và genistein có hoạt tính “phytoestrogen”.

Cùng với tác dụng hiệu quả tổng hợp của các hợp chất trong đậu nành khi dùng làm thực phẩm, người ta cho rằng isoflavone giúp làm giảm nguy cơ ung thư ngực, ung thư ruột, các nghiên cứu trên động vật đã chứng minh sử dụng các sản phẩm đậu tương đã ức chế được ít nhất 5% khả năng ung thư. Nhiều nghiên cứu cho thấy đậu nành chứa nhiều isoflavone và được coi là thực phẩm gia tăng nữ tính và bảo vệ phụ nữ giảm chứng bệnh như: tim mạch, rối loạn tiền mãn kinh, ung thư và loãng xương. nên đậu nành còn được mệnh danh là “thần dược” của phụ nữ. Tác dụng của isoflavone trong phòng và điều trị bệnh [3], [5] Nghiên cứu cho thấy những tác dụng có lợi của isoflavone có trong hạt đậu nành trên các triệu chứng vận mạch ở tuổi mãn kinh: isoflavone trong đậu nành làm giảm cường độ bốc hóa, giảm số lần làm đổ mồ hôi đem, mang lại lợi ích hiển nhiên nâng cao chất lượng sống của phụ nữ mãn kinh.

Isoflavone đậu nành không gây thay đổi có ý nghĩa về FSH hoặc về độ dày của màng trong tử cung, không thấy tăng các tác dụng phụ estrogen không mong muốn. a) Tác dụng trên chuyển hóa của xương Nhiều nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ gãy xương do loãng xương ở phụ nữ châu Á thấp hơn hẳn so với ở các nước phương Tây. Sự khác biệt này có liên quan tới sử dụng nhiều thức ăn chế từ đậu nành.