MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra, là một trong những bệnh nhiệt đới điển hình gây hại đối với nhiều vùng trồng lúa khác nhau trên thế giới. Đối với miền Bắc nước ta, bệnh gây hại ở cả vụ xuân lẫn vụ mùa và hại trên nhiều giống khác nhau, đặc biệt đối với vụ mùa và trên các giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc.
Để phòng trừ, người ta sử dụng nhiều biện pháp khác nhau, như áp dụng các biện pháp kỹ thuật canh tác, bón phân sớm, cân đối, vệ sinh đồng ruộng, mật độ gieo trồng hợp lý và dùng giống kháng bệnh, trong đó chọn tạo giống kháng bệnh có ý nghĩa kinh tế nhiều mặt, không gây ô nhiễm môi trường và tạo được nông sản sạch. Để tạo giống kháng bệnh bạc lá bền vững thì trước hết phải có nguồn gen kháng bệnh, sau đó phải xác định chính xác được số và thành phần các chủng hiện có ở mỗi vùng, nghiên cứu xác định gen kháng bệnh hữu hiệu rồi quy tụ nhiều gen kháng vào một giống. Hiện người ta đã xác định được gần 40 gen kháng bệnh bạc lá khác nhau trên thế giới, tương ứng đã xác định được mỗi nước có một số chủng gây bệnh nhất định như ở Philippin có 6 chủng, Ấn độ 9 chủng, Nhật Bản có 12 chủng. Ở Việt Nam, theo Phan Hữu Tôn và cộng sự, 2002 trên cơ sở lây nhiễm các dòng đẳng gen, dựa vào phổ kháng nhiễm đã tạm thời phân ra ở miền Bắc tồn tại 10 chủng[6].
Đồng thời đã xác định được 4 gen kháng hữu hiệu là Xa4, xa5, Xa7 và Xa21, kháng mạnh và kháng được hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập. Tuy nhiên, do phương pháp lây nhiễm nhân tạo có một số nhược điểm như phụ thuộc vào môi trường, tốn thời gian, nhiều khi kết quả thu được chưa thật chính xác. Để khắc phục nhược điểm trên thì cần thiết phải xác định một cách chính xác sự đa dạng di truyền giữa các chủng ở mức phân tử DNA. Trên thế giới có khá nhiều công trình nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử DNA trong việc phân lập và xác định các chủng vi sinh vật gây bệnh.
Lee và cộng sự, 2005 đã lần đầu tiên 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com công bố đã xác định được trình tự DNA của genom vi khuẩn Xoo, vòng genom dài 4,9 triệu bp, trong đó đã xác định được một số vùng bảo thủ và những vùng dễ biến động, đây có thể là cơ sở phân tử để phân ra các chủng khác nhau[18]. Cùng với phân tích toàn bộ hệ gen (genome-wide scanning), candidate gene (CG) là một cách tiếp cận khác để phân tích tỉ mỉ các tính trạng phức tạp và tính trạng số lượng. Mỗi cách tiếp cận có những thuận lợi và bất lợi riêng. Phân tích toàn bộ gen thường tiến hành mà không có bất kỳ giả định liên quan đến tầm quan trọng của tính năng chức năng cụ thể của các đặc điểm điều tra, nhưng tốn kém và cần có nguồn nhân lực chuyên sâu.
Trong khi đó, cách tiếp cận bằng candidate gene đã được chứng minh là cực kỳ hiệu quả để nghiên cứu cấu trúc di truyền của các tính trạng phức tạp, phương pháp này hiệu quả và kinh tế hơn nhiều so với phương pháp phát hiện gen trực tiếp. Nghiên cứu candidate gene, các gen có vai trò trong con đường sinh tổng hợp của tính trạng, có thể phát hiện ra một sự liên kết cung cấp thông tin về chức năng của nó theo con đường đó. Tương tự, nếu thất bại trong việc tìm kiếm liên kết với tính trạng quan tâm cũng cung cấp bằng chứng chống lại biến thể về chức năng trong con đường đó. Cách tiếp cận bằng candidate gene đã được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu bệnh di truyền, nghiên cứu di truyền liên kết.
Xuất phát từ những lý do nêu trên chúng tôi chọn đề tài “Xác định cadidate gen kháng bệnh bạc lá trong các giống lúa bản địa của Việt Nam phục vụ công tác chọn tạo giống” nhằm sử dụng kỹ thuật toán tin, sinh tin và các marker phân tử để nhanh chóng tìm kiếm các gen kháng bạc lá có trong một số giống lúa bản địa của Việt Nam phục vụ cho các chương trình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá và trực tiếp phục vụ sản xuất. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Mục tiêu nghiên cứu 2. Mục tiêu tổng quát Sử dụng tin sinh học khai thác được dữ liệu genome lúa bản địa của Việt Nam, xác định được các gen ứng viên (candidate gen) kháng bạc lá phục vụ công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá 2.
Mục tiêu cụ thể - Xác định 1-2 gen ứng viên (trình tự, vị trí, bản đồ vật lí) đối với tính trạng kháng bệnh bạc lá có trong tập đoàn các giống lúa bản địa của Việt Nam đã giải mã; - Thiết kế bộ chỉ thị phân tử mới (PCR based: các marker chức năng, các marker đặc hiệu SSR, SSLP, SNP/CAPs/dCAPs.) liên kết với candidate gen kháng bệnh bạc lá 3. Cơ sở khoa học và cơ sở thực tiễn 3. Cơ sở khoa học Sử dụng các kỹ thuật toán tin, sinh tin và các marker phân tử để tạo cơ sở cho việc tìm kiếm các gen kháng bạc lá có trong một số giống lúa bản địa của Việt Nam phục vụ cho các chương trình nghiên cứu chọn tạo giống lúa và nâng cao tiềm năng di truyền của các giống lúa kháng bạc lá trong sản xuất. Phát hiện sai khác di truyền của các giống lúa kháng bạc lá có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định các allele hiếm, allele đặc trưng để nhận dạng chính xác các nguồn gen ưu tú phục vụ nghiên cứu lai tạo giống và định hướng cho công tác thu thập bảo tồn đa dạng nguồn gen lúa kháng bạc lá ở mức phân tử.
3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Cơ sở thực tiễn Nghiên cứu để xác định các gen ứng viên kháng bạc lá góp phần nâng cao hiệu quả công tác bảo tồn và chọn tạo giống lúa có phẩm chất gạo tốt, năng suất cao lại có khả năng kháng bệnh bạc lá, phù hợp với điều kiện canh tác lúa và cơ cấu sản xuất lúa ở các vùng khác nhau của Việt Nam. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 4. Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu Tập đoàn giống lúa kháng bạc lá bản địa của Việt Nam đã giải mã và 5 tổ hợp lai: DT39 X OM6377 An dân 11 X CNBN2 OM6976 X CNBN2 Q1-8-1 X Chấn Thơm Thủ Đô 1 X CNBN2 4.
Phạm vi nghiên cứu Các nghiên cứu về lĩnh vực Tin - Sinh học, phân tích genome, các thí nghiệm về Sinh học phân tử, thiết kế marker được thực hiện tại Bộ môn Kỹ thuật Di truyền, Viện Di truyền Nông Nghiệp. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về nghiên cứu bệnh bạc lá ở cây lúa 1. Bệnh Bạc lá lúa (Xanthomonas oryzae.oryzae) Bệnh bạc lá lúa được phát hiện đầu tiên ở Fukuoka - Nhật Bản vào năm 1884.
Ban đầu người ta lầm tưởng nguyên nhân gây nên triệu chứng bệnh là do acid đất. Nhưng không lâu sau đó, người ta đã công nhận nguyên nhân của nó là do vi khuẩn gây nên và thuộc loại Bacillus oryzae. Vi khuẩn này cuối cùng đã được Ezuka (1974) xác định là do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây nên. Bệnh bạc lá lúa trở nên phổ biến ở tất cả các vùng trồng lúa trên khắp thế giới vào cuối thập kỉ 60 đến đầu thập kỉ 80 của thế kỉ XX, đặc biệt trên các nước trồng lúa ở Châu Á như: Ấn Độ, Philippin, Indonexia, Trung Quốc.
Bệnh bạc lá lúa có xu hướng tăng trở lại và gây hại cả ở vụ xuân[13]. Hiện nay, bệnh đã gây hại phổ biến ở hầu hết các nước trồng lúa trên thế giới. Vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây ra 3 triệu chứng điển hình của bệnh bạc lá lúa là: bạc lá, vàng nhợt, héo xanh (còn được gọi là Kresek). Cho đến nay mối quan hệ giữa 3 triệu chứng này vẫn chưa được làm sáng tỏ, nhiều thí nghiệm trong nhà lưới đã chứng minh hiện tượng Kresek và bạc lá khác nhau rõ rệt mặc dù chúng đều là triệu chứng ban đầu của sự nhiễm bệnh.
Các giống lúa khác nhau có thể biểu hiện triệu chứng nhiễm Kresek hoặc bạc lá. Triệu chứng vàng nhợt là ảnh hưởng sau, là hậu quả của sự bạc lá hay Kresek gây nên hoặc cũng có thể là do độc tố (toxin) của vi khuẩn sản sinh ra. Theo Lê Lương Tề (1980) thì ở Việt Nam, bệnh bạc lá lúa phát sinh phá hại suốt từ thời kỳ mạ đến chín nhưng có triệu chứng điển hình là ở thời kỳ cây lúa trên ruộng từ sau đẻ - trỗ, chín sữa[5]. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Trên mạ, triệu chứng thể hiện không đặc trưng như ở trên lúa, do đó cũng dễ nhầm lẫn với các triệu chứng khác.
Chủ yếu vi khuẩn hại mạ gây ra triệu chứng ở mút lá hoặc mép lá mạ những vết dài ngắn khác nhau màu xanh vàng rồi nâu bạc, lá dễ bị khô. Trên lá lúa, triệu chứng bệnh thể hiện rõ hơn, tuy có thể biến đổi ít nhiều tuỳ theo giống lúa và điều kiện bên ngoài nhưng nói chung vết bệnh có những đặc điểm điển hình sau đây: - Vết bệnh ở mép lá, mút lá lan dần vào phiến lá hoặc lan thẳng xuống gân chính, ở một số trường hợp vết bệnh có khi bắt đầu ở ngay giữa phiến lá. - Vết bệnh lan rộng theo đường gợn sóng hoặc thẳng, mô bệnh xanh tái vàng lục, cuối cùng cháy khô có màu nâu xám. - Thông thường ranh giới giữa mô bệnh với mô khỏe trên phiến lá rất rõ rệt, có giới hạn theo đường gợn sóng vàng hoặc không vàng, có khi chỉ một đường viền màu nâu sẫm, đứt quãng hay không đứt quãng.
Có thể căn cứ vào những đặc điểm triệu chứng trên để phát hiện bệnh. Tuy nhiên nhiều khi vết bệnh quá cũ hoặc biến đổi quá nhiều theo giống và điều kiện bên ngoài, nhất là ở mạ, do vậy có thể nhầm lẫn với những hiện tượng khô đầu lá sinh lý[1]. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá trên thế giới Có rất nhiều phương pháp được áp dụng để tạo giống lúa kháng bạc lá như: Chuyển gen kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp chọn lọc truyền thống và chuyển gen kháng bệnh bạc lá bằng ứng dụng công nghệ sinh học tạo ra các dòng đẳng gen (Near Isogenic Line) có mang gen kháng sau đó lai quy tụ (pyramiding) nhiều gen kháng hoặc nhiều QTL từ nhiều nguồn bố mẹ vào trong một giống.