Tổng quan nghiên cứu

Cây lá ngón (Gelsemium elegans Benth) là một loại thực vật có độc tính cao, phân bố chủ yếu ở các vùng núi phía Bắc Việt Nam và nhiều quốc gia Đông Nam Á khác. Theo thống kê tại huyện Điện Biên Đông, tỉnh Điện Biên, trong tám tháng đầu năm 2015 đã ghi nhận 68 trường hợp tự tử bằng lá ngón, trong đó có 14 người tử vong; năm 2016 con số này tăng lên 73 trường hợp với 29 người tử vong. Độc tính của cây lá ngón chủ yếu do các alcaloid chứa trong toàn cây, trong đó gelsemin và koumin là hai alcaloid chính có hàm lượng cao nhất và độc tính mạnh. Việc xác định đồng thời gelsemin và koumin trong mẫu máu là rất cần thiết để chẩn đoán chính xác nguyên nhân ngộ độc, góp phần nâng cao hiệu quả giám định pháp y và điều trị lâm sàng.

Mục tiêu nghiên cứu là xây dựng phương pháp xác định đồng thời gelsemin và koumin trong máu bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) và áp dụng phương pháp này để phân tích các mẫu máu từ những trường hợp nghi ngờ ngộ độc alcaloid cây lá ngón. Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Pháp y Quốc gia và Trường Đại học Dược Hà Nội trong năm 2023, với phạm vi tập trung vào mẫu máu người. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp công cụ phân tích chính xác, nhạy và có độ chọn lọc cao, góp phần nâng cao chất lượng giám định pháp y và hỗ trợ xử lý các trường hợp ngộ độc thực tế.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình phân tích hóa học hiện đại, trong đó:

  • Alcaloid cây lá ngón: Gelsemin và koumin thuộc nhóm alcaloid indol có cấu trúc phức tạp, độc tính cao, ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương và cơ vân.
  • Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS): Kỹ thuật kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao với khối phổ ba tứ cực, cho phép tách và định lượng chính xác các hợp chất trong mẫu sinh học phức tạp.
  • Phương pháp xử lý mẫu sinh học: Bao gồm tủa protein, chiết lỏng-lỏng (LLE) và chiết pha rắn (SPE) nhằm loại bỏ tạp chất, làm sạch và làm giàu mẫu trước khi phân tích.

Các khái niệm chính bao gồm: ion hóa phun điện tử (ESI), ion mẹ và ion con trong MS/MS, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ chính xác, độ đúng và hiệu suất chiết.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Mẫu máu trắng không chứa gelsemin và koumin dùng để khảo sát phương pháp; mẫu máu người nghi ngờ ngộ độc alcaloid cây lá ngón gửi đến Viện Pháp y Quốc gia để phân tích thực tế.
  • Phương pháp chọn mẫu: Lựa chọn mẫu máu dựa trên tiêu chí không nhiễm tạp chất và mẫu thực tế có nghi ngờ ngộ độc.
  • Phương pháp phân tích:
    • Khảo sát tối ưu điều kiện phổ khối, sắc ký lỏng và xử lý mẫu.
    • So sánh hiệu quả của các phương pháp tủa protein, chiết lỏng-lỏng với nhiều dung môi và chiết pha rắn trên các loại cột khác nhau.
    • Thẩm định phương pháp dựa trên các chỉ tiêu: độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, hiệu suất chiết, ảnh hưởng nền mẫu, độ ổn định và độ nhiễm chéo.
  • Timeline nghiên cứu: Tiến hành khảo sát và tối ưu trong vòng 6 tháng, thẩm định phương pháp trong 3 tháng tiếp theo, áp dụng phân tích mẫu thực tế trong 3 tháng cuối năm 2023.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Khảo sát phổ khối và điều kiện MS/MS: Ion mẹ của gelsemin và koumin lần lượt là 322,8 và 306,8 m/z, với hai ion con đặc trưng được chọn để định lượng và xác nhận. Điều kiện ion hóa ESI dương, điện thế 3500 V, nhiệt độ 300°C cho tín hiệu ổn định và cường độ cao.

  2. Khảo sát hệ pha động và sắc ký lỏng: Hệ pha động methanol – acid formic 0,1% theo chương trình gradient cho sắc ký đồ sắc nét, píc cân đối, thời gian phân tích ngắn (khoảng 3-4 phút cho gelsemin và koumin). Tốc độ dòng 0,4 mL/phút được lựa chọn tối ưu, tránh kéo đuôi píc và giảm áp suất cột.

  3. Khảo sát phương pháp chiết mẫu:

    • Phương pháp chiết lỏng-lỏng với dung môi ethyl acetat cho hiệu suất chiết cao nhất, diện tích píc gelsemin đạt khoảng 221.735 Abu.s, koumin 19.592 Abu.s, với độ lặp lại RSD dưới 2%.
    • Các phương pháp tủa protein và chiết pha rắn cũng cho hiệu quả nhưng thời gian xử lý lâu hơn và dễ tạo nhũ khi làm khô mẫu.

  4. Thẩm định phương pháp:

    • Độ phù hợp hệ thống: RSD diện tích píc gelsemin 1,37%, koumin 1,74%, thời gian lưu RSD dưới 0,3%, đáp ứng yêu cầu phân tích.
    • Độ đặc hiệu: Mẫu trắng không có tín hiệu nhiễu vượt quá 20% so với LLOQ, đảm bảo chọn lọc cao.
    • Đường chuẩn tuyến tính trong khoảng 1,0 – 100 ng/mL với hệ số tương quan r ≥ 0,99.
    • Giới hạn phát hiện (LOD) đạt khoảng 0,1 ng/mL, giới hạn định lượng (LOQ) 0,3 ng/mL.
    • Độ đúng và độ chính xác đạt trên 90%, RSD dưới 5% ở các mức nồng độ thấp, trung bình và cao.
    • Hiệu suất chiết đạt trên 85%, ảnh hưởng nền mẫu thấp với hệ số ma trận (MF) gần 1.
    • Độ ổn định mẫu trong 21 ngày và qua 3 chu kỳ rã – đông được đảm bảo với biến thiên dưới 10%.
    • Độ nhiễm chéo không đáng kể, đáp ứng pic mẫu trắng dưới 5% so với mẫu chuẩn.

Thảo luận kết quả

Phương pháp LC-MS/MS kết hợp chiết lỏng-lỏng bằng ethyl acetat đã chứng minh hiệu quả cao trong việc xác định đồng thời gelsemin và koumin trong mẫu máu người. So với các nghiên cứu trước đây sử dụng SPE hoặc tủa protein, phương pháp này đơn giản, nhanh chóng và cho hiệu suất chiết tốt hơn. Thời gian phân tích ngắn giúp tăng năng suất phân tích mẫu trong thực tế giám định pháp y.

Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có độ nhạy và độ chọn lọc cao, phù hợp để phát hiện hàm lượng vết của alcaloid trong mẫu máu, hỗ trợ chẩn đoán chính xác các trường hợp ngộ độc cây lá ngón. Các biểu đồ sắc ký và bảng số liệu minh họa rõ ràng sự phân tách tốt và độ lặp lại của phương pháp, đồng thời so sánh với các nghiên cứu quốc tế cho thấy tính ứng dụng rộng rãi.

Phương pháp này có thể được áp dụng trong các phòng thí nghiệm pháp y, y học lâm sàng và nghiên cứu dược lý để đánh giá độc tính và theo dõi điều trị ngộ độc alcaloid cây lá ngón.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Triển khai áp dụng phương pháp LC-MS/MS trong giám định pháp y: Đào tạo kỹ thuật viên và trang bị thiết bị tại các Viện Pháp y địa phương nhằm nâng cao năng lực phân tích alcaloid cây lá ngón, giảm thiểu sai sót trong chẩn đoán ngộ độc.

  2. Phát triển quy trình xử lý mẫu chuẩn hóa: Áp dụng quy trình chiết lỏng-lỏng với ethyl acetat làm chuẩn mực để đảm bảo tính đồng nhất và hiệu quả trong phân tích mẫu máu, rút ngắn thời gian xử lý mẫu.

  3. Mở rộng nghiên cứu ứng dụng: Khuyến khích nghiên cứu thêm về dược động học và chuyển hóa gelsemin, koumin trong cơ thể người để hỗ trợ điều trị ngộ độc và phát triển thuốc an toàn.

  4. Tăng cường công tác tuyên truyền và phòng ngừa ngộ độc: Hướng đến các vùng núi, vùng sâu vùng xa nơi cây lá ngón phân bố nhiều, phối hợp với ngành y tế và giáo dục để nâng cao nhận thức cộng đồng về nguy cơ ngộ độc.

  5. Thời gian thực hiện: Các giải pháp trên nên được triển khai trong vòng 1-2 năm tới để kịp thời ứng phó với các trường hợp ngộ độc gia tăng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Chuyên gia pháp y và kỹ thuật viên phòng giám định pháp y: Nghiên cứu cung cấp phương pháp phân tích hiện đại, chính xác để xác định nguyên nhân tử vong do ngộ độc alcaloid cây lá ngón, hỗ trợ công tác giám định pháp y.

  2. Bác sĩ lâm sàng và nhân viên y tế cấp cứu: Hiểu rõ về độc tính và phương pháp phát hiện gelsemin, koumin giúp chẩn đoán nhanh và điều trị kịp thời các trường hợp ngộ độc thực tế.

  3. Nhà nghiên cứu dược học và dược động học: Cung cấp dữ liệu về đặc tính hóa học, dược động học và phương pháp phân tích alcaloid cây lá ngón, làm cơ sở cho nghiên cứu phát triển thuốc và an toàn sinh học.

  4. Cơ quan quản lý và phòng chống ngộ độc: Thông tin về tần suất ngộ độc, độc tính và phương pháp phát hiện giúp xây dựng chính sách phòng ngừa và xử lý ngộ độc hiệu quả.

Câu hỏi thường gặp

  1. Phương pháp LC-MS/MS có ưu điểm gì so với các kỹ thuật khác trong phân tích gelsemin và koumin?
    LC-MS/MS cho độ nhạy và độ chọn lọc cao, khả năng phân tích đồng thời nhiều chất trong mẫu phức tạp như máu, giảm thiểu nhiễu nền và cho kết quả chính xác hơn so với HPLC-UV hay GC-MS.

  2. Giới hạn phát hiện của phương pháp này là bao nhiêu?
    Phương pháp đạt giới hạn phát hiện khoảng 0,1 ng/mL và giới hạn định lượng 0,3 ng/mL, đủ nhạy để phát hiện hàm lượng vết của gelsemin và koumin trong mẫu máu người.

  3. Tại sao chọn chiết lỏng-lỏng với ethyl acetat làm dung môi chiết?
    Ethyl acetat cho hiệu suất chiết cao, thời gian làm khô mẫu nhanh, ít tạo nhũ và thao tác đơn giản, phù hợp với đặc tính hóa học của gelsemin và koumin.

  4. Phương pháp có thể áp dụng cho các mẫu sinh học khác ngoài máu không?
    Có thể áp dụng cho các mẫu huyết tương, dịch sinh học khác sau khi tối ưu quy trình xử lý mẫu phù hợp, tuy nhiên cần thẩm định lại để đảm bảo độ chính xác.

  5. Phương pháp này có thể hỗ trợ điều trị ngộ độc như thế nào?
    Việc xác định chính xác nồng độ gelsemin và koumin trong máu giúp đánh giá mức độ ngộ độc, theo dõi hiệu quả điều trị và đưa ra quyết định y khoa kịp thời.

Kết luận

  • Đã xây dựng thành công phương pháp xác định đồng thời gelsemin và koumin trong máu bằng sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS với độ nhạy cao, độ chính xác và độ chọn lọc tốt.
  • Phương pháp chiết lỏng-lỏng sử dụng ethyl acetat được lựa chọn tối ưu cho việc xử lý mẫu máu, đảm bảo hiệu suất chiết trên 85%.
  • Thẩm định phương pháp đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn về độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn phát hiện và định lượng.
  • Phương pháp đã được áp dụng thành công để phân tích các mẫu máu thực tế từ các trường hợp nghi ngờ ngộ độc alcaloid cây lá ngón.
  • Đề xuất triển khai áp dụng rộng rãi trong giám định pháp y và nghiên cứu dược học, đồng thời tăng cường công tác phòng ngừa ngộ độc tại các vùng có nguy cơ cao.

Tiếp theo, cần mở rộng nghiên cứu về dược động học và chuyển hóa alcaloid cây lá ngón, đồng thời đào tạo nhân lực và trang bị thiết bị phân tích hiện đại tại các cơ sở pháp y. Mời các chuyên gia và nhà quản lý quan tâm phối hợp triển khai ứng dụng phương pháp này để nâng cao hiệu quả giám định và phòng chống ngộ độc.