Luận án tiến sĩ về vi khuẩn Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên hoa hồng và ớt tại Đồng Tháp

Luận án tiến sĩ nghiên cứu phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp gây bệnh trên hoa hồng và ớt tại Đồng Tháp, tuyển chọn vi khuẩn đối kháng.

• Tác giả: Lê Uyển Thanh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Đức Độ
• Trường học: Trường Đại Học Cần Thơ
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Vi Khuẩn Xanthomonas Spp Gây Bệnh Trên Hoa Hồng Và Ớt Tại Đồng Tháp
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Đồng Tháp

Mục lục chi tiết

• Tóm tắt
• 1. Chương 1: Đặt vấn đề
• 1.1. Mục tiêu của luận án
• 1.2. Nội dung nghiên cứu
• 1.3. Tính mới của luận án
• 1.4. Phạm vi và đối tượng nghiên cứu
• 1.4.1. Phạm vi nghiên cứu
• 1.4.2. Đối tượng nghiên cứu
• 1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
• 1.5.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. Chương 2: Tổng quan tài liệu
• 2.1. Sơ lược về chi Xanthomonas gây bệnh trên thực vật
• 2.1.1. Tác nhân gây bệnh
• 2.1.2. Triệu chứng bệnh
• 2.2. Sơ lược về cây hoa hồng và cây ớt
• 2.2.1. Cây hoa hồng
• 2.3. Ảnh hưởng của vi khuẩn trong đất đối với hệ sinh thái nông nghiệp
• 2.3.1. Tương tác của vi khuẩn trong đất đối với hệ sinh thái nông nghiệp
• 2.3.2. Cộng đồng vi khuẩn trong đất ngập nước
• 2.3.3. Một số cơ chế kiểm soát bệnh thực vật của các dòng vi khuẩn từ đất
• 2.4. Các nghiên cứu về vi khuẩn gây bệnh đốm lá do Xanthomonas sp. trên hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt
• 2.4.1. Vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng
• 2.4.2. Vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây ớt
• 2.5. Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát mầm bệnh do Xanthomonas spp. gây ra trên cây trồng
• 2.5.1. Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát Xanthomonas citri subsp. citri trên cây có múi
• 2.5.2. Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát Xanthomonas campestris pv. campestris trên cây trồng họ cải
• 2.5.3. Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát Xanthomonas campestris pv. campestris trên cây cà chua và ớt
• 2.5.4. Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát các loài Xanthomonas spp
• 2.6. Kỹ thuật MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desraction Ionization Time-Of-Flight mass spectrometry) và MLSA (Multilocus sequence analysis) trong nghiên cứu định danh vi khuẩn
• 3. Chương 3: Phương pháp nghiên cứu
• 3.1. Thời gian và địa điểm
• 3.2. Dụng cụ, thiết bị và Môi trường nuôi cấy
• 3.3. Mẫu bệnh cây
• 3.4. Vật liệu thí nghiệm
• 3.4.1. Mẫu cơ chất hoặc đất
• 3.4.2. Vật liệu trồng cây
• 3.5. Phương pháp
• 3.5.1. Nội dung 1: Phân lập và xác định các dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng và cây ớt
• 3.5.1.1. Thu thập mẫu bệnh tại các vùng trồng chuyên canh các loại cây trồng đã được chọn tại tỉnh Đồng Tháp
• 3.5.1.2. Phân lập, tách ròng vi khuẩn Xanthomonas spp. từ các mẫu bệnh
• 3.5.1.3. Khảo sát khả năng gây bệnh trên các cây trồng đã chọn của các dòng Xanthomonas spp
• 3.5.1.4. Xác định danh pháp vi khuẩn Xanthomonas spp. dựa vào hình thái và phương pháp sinh hóa
• 3.5.1.5. Xác định danh pháp vi khuẩn Xanthomonas spp. theo phương pháp MALDI-TOF-MS
• 3.5.2. 3.6 Xác định danh pháp vi khuẩn Xanthomonas spp. theo kỹ thuật Phân tích trình tự đa locus (MultiLocus Sequence Analysis – MLSA).2 Nội dung 2: Tuyển chọn vi khuẩn có nguồn gốc từ cơ chất vùng rễ và đất vùng sinh thái bản địa có khả năng đối kháng với Xanthomonas spp. gây bệnh đã được phân lập
• 3.5.2.1. Phân lập vi khuẩn từ mẫu đất thu được
• 3.5.2.2. Khảo sát khả năng đối kháng in vitro trước các dòng Xanthomonas spp. được chọn của những dòng vi khuẩn phân lập được từ mẫu đất
• 3.5.2.3. Định danh một số dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng
• 3.5.3. Nội dung 3: Khảo sát khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trong điều kiện nhà lưới của những dòng vi khuẩn triển vọng
• 3.5.4. Nội dung 4: Đánh giá hiệu quả của những dòng vi khuẩn kiểm soát bệnh (BCA) ở điều kiện ngoài đồng
• 3.5.5. Phương pháp lây nhiễm bệnh
• 3.6. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. Chương 4: Kết quả và thảo luận
• 4.1. Nội dung 1: Phân lập các dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá vi khuẩn
• 4.1.1. Phân lập và xác định danh pháp dòng vi khuẩn gây bệnh trên cây hoa hồng tại tỉnh Đồng Tháp
• 4.1.1.1. Phân lập dòng Xanthomonas spp. gây bệnh trên cây hoa hồng
• 4.1.1.2. Khảo sát khả năng gây bệnh trên cây hoa hồng của các dòng Xanthomonas spp. được phân lập
• 4.1.2. Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng theo phương pháp MALDI-TOF-MS
• 4.1.3. Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng theo kỹ thuật Phân tích trình tự đa locus (MultiLocus Sequence Analysis – MLSA)
• 4.1.4. Phân lập và xác định danh pháp dòng vi khuẩn gây bệnh trên cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp
• 4.1.4.1. Phân lập dòng Xanthomonas spp. gây bệnh trên cây ớt
• 4.1.4.2. Khảo sát khả năng gây bệnh trên cây ớt của các dòng Xanthomonas spp. được phân lập
• 4.1.5. Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây ớt theo hình thái, sinh hóa và sinh học phân tử
• 4.2. Nội dung 2: Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng đối kháng với Xanthomonas spp. được phân lập từ cơ chất vùng rễ và đất vùng sinh thái bản địa
• 4.2.1. Phân lập vi khuẩn
• 4.2.2. Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng các dòng Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng trong điều kiện in vitro
• 4.2.2.1. Khả năng đối kháng đối với Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng của vi khuẩn phân lập từ cơ chất vùng rễ
• 4.2.2.2. Khả năng đối kháng đối với Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng của vi khuẩn phân lập từ đất vùng sinh thái bản địa tỉnh Đồng Tháp
• 4.2.3. Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng các dòng Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt trong điều kiện in vitro
• 4.2.3.1. Khả năng đối kháng đối với Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây ớt của vi khuẩn phân lập từ đất vùng rễ
• 4.2.3.2. Khả năng đối kháng đối với Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây ớt của vi khuẩn phân lập từ đất vùng sinh thái bản địa
• 4.2.4. Xác định các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng
• 4.2.4.1. Xác định các dòng vi khuẩn đối kháng dựa vào kỹ thuật phân tích MALDI-TOF-MS
• 4.2.4.2. Xác định các dòng vi khuẩn đối kháng dựa vào kỹ thuật phân tích Sinh học phân tử
• 4.2.5. Khảo sát mật độ đối kháng của các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng đối với Xanthomonas spp. XP17 và XR13
• 4.3. Nội dung 3: Khảo sát khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trong điều kiện nhà lưới của những dòng vi khuẩn triển vọng
• 4.3.1. Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng trong điều kiện nhà lưới
• 4.3.1.1. Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng trong điều kiện nhà lưới của ba dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng từ cơ chất vùng rễ
• 4.3.1.2. Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng trong điều kiện nhà lưới của ba dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng từ vùng sinh thái bản địa
• 4.3.2. Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt trong điều kiện nhà lưới
• 4.3.2.1. Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt trong điều kiện nhà lưới của ba dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng từ cơ chất vùng rễ
• 4.3.2.2. Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt trong điều kiện nhà lưới của ba dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng từ vùng sinh thái bản địa
• 4.4. Nội dung 4: Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng và cây ớt ở điều kiện ngoài đồng
• 4.4.1. Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng ở điều kiện ngoài đồng
• 4.4.1.1. Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng ở điều kiện ngoài đồng của ba dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng từ cơ chất vùng rễ
• 4.4.1.2. Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng ở điều kiện ngoài đồng của ba dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng từ vùng sinh thái bản địa
• 4.4.2. Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt ở điều kiện ngoài đồng
• 4.4.2.1. Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt ở điều kiện ngoài đồng của ba dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng từ cơ chất vùng rễ
• 4.4.2.2. Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt ở điều kiện ngoài đồng của ba dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng từ vùng sinh thái bản địa
• 5. Chương 5: Kết luận và đề xuất
• 5.1. Phân lập và xác định được các dòng vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng giống hồng lửa (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp
• 5.2. Tuyển chọn được những dòng vi khuẩn có khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn do Xanthomonas spp.
• Tài liệu tham khảo
• Phụ lục

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Luận án này tập trung vào việc phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp. Nghiên cứu được thực hiện trong bối cảnh nông nghiệp hiện đại, nơi mà việc lạm dụng thuốc trừ sâu hóa học đã dẫn đến nhiều tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người. Mục tiêu chính của nghiên cứu là xác định các dòng vi khuẩn gây bệnh và tìm kiếm các dòng vi khuẩn đối kháng có khả năng kiểm soát bệnh. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển các biện pháp phòng trừ sinh học hiệu quả hơn trong quản lý bệnh hại cây trồng.

1.1. Tình hình nghiên cứu

Nghiên cứu về vi khuẩn gây bệnh trong nông nghiệp đã được thực hiện rộng rãi, đặc biệt là các loài thuộc chi Xanthomonas. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng Xanthomonas spp có thể gây ra nhiều loại bệnh trên cây trồng, ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng sản phẩm. Tại Đồng Tháp, cây hoa hồng và cây ớt là hai loại cây trồng quan trọng, nhưng cũng dễ bị tấn công bởi các loại vi khuẩn gây bệnh. Việc tìm hiểu và phân lập các dòng vi khuẩn này là cần thiết để phát triển các biện pháp phòng trừ hiệu quả.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện thông qua các phương pháp phân lập và xác định vi khuẩn Xanthomonas spp từ các mẫu bệnh thu thập tại các vùng trồng cây hoa hồng và cây ớt. Các mẫu bệnh được thu thập từ các địa điểm khác nhau tại Đồng Tháp và được phân lập trong điều kiện phòng thí nghiệm. Kỹ thuật phân tích sinh hóa, MALDI-TOF-MS và MLSA được sử dụng để xác định danh pháp của các dòng vi khuẩn. Ngoài ra, khả năng gây bệnh của các dòng vi khuẩn cũng được khảo sát thông qua các thí nghiệm in vitro và điều kiện nhà lưới.

2.1. Phân lập vi khuẩn

Quá trình phân lập vi khuẩn gây bệnh bắt đầu bằng việc thu thập mẫu bệnh từ cây hoa hồng và cây ớt. Các mẫu này được xử lý và nuôi cấy trong môi trường thích hợp để tách rời các dòng vi khuẩn. Kết quả phân lập cho thấy sự hiện diện của nhiều dòng Xanthomonas spp khác nhau, trong đó có Xanthomonas euvesicatoria là tác nhân chính gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng. Việc xác định chính xác các dòng vi khuẩn này là rất quan trọng để phát triển các biện pháp phòng trừ hiệu quả.

III. Kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy các dòng vi khuẩn Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng và cây ớt có khả năng gây hại khác nhau. Các dòng vi khuẩn được phân lập đã được đánh giá về khả năng gây bệnh thông qua các thí nghiệm in vitro. Kết quả cho thấy một số dòng vi khuẩn có khả năng gây bệnh mạnh mẽ, trong khi một số dòng khác lại có khả năng đối kháng tốt với các dòng Xanthomonas spp gây bệnh. Điều này mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc sử dụng các dòng vi khuẩn đối kháng để kiểm soát bệnh hại.

3.1. Đánh giá khả năng gây bệnh

Các thí nghiệm đánh giá khả năng gây bệnh của các dòng Xanthomonas spp cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các dòng vi khuẩn. Một số dòng như XR13, XR9, XR18 thể hiện khả năng gây bệnh cao trên cây hoa hồng, trong khi các dòng khác lại có khả năng gây bệnh thấp hơn. Điều này cho thấy sự cần thiết phải phân loại và xác định chính xác các dòng vi khuẩn để có thể áp dụng các biện pháp phòng trừ hiệu quả.

IV. Kết luận và đề xuất

Nghiên cứu đã phân lập và xác định được các dòng vi khuẩn Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng và cây ớt tại tỉnh Đồng Tháp. Đồng thời, nghiên cứu cũng đã tuyển chọn được các dòng vi khuẩn có khả năng kiểm soát bệnh hiệu quả. Các dòng vi khuẩn đối kháng này có thể được sử dụng như một biện pháp sinh học trong quản lý bệnh hại cây trồng. Việc áp dụng các dòng vi khuẩn này trong thực tiễn sẽ góp phần giảm thiểu việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học, bảo vệ môi trường và sức khỏe con người.

4.1. Đề xuất nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của các dòng vi khuẩn đối kháng, cũng như khả năng tương tác của chúng với các yếu tố môi trường. Việc nghiên cứu này sẽ giúp tối ưu hóa các biện pháp phòng trừ bệnh hại cây trồng, đồng thời phát triển các sản phẩm sinh học có hiệu quả cao trong quản lý bệnh hại.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ chuyên ngành Công nghệ sinh học (mã số 62420201) của nghiên cứu sinh Lê Uyển Thanh, với đề tài "Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh", được thực hiện tại Trường Đại học Cần Thơ dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Đức Độ và TS. Trần Đình Giỏi, bảo vệ năm 2022.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Canh tác hoa hồng (Rosa spp.) và ớt (Capsicum spp.) là hai ngành sản xuất nông nghiệp chủ lực tại tỉnh Đồng Tháp, đặc biệt tại các vùng chuyên canh như Làng hoa Sa Đéc, huyện Châu Thành và huyện Thanh Bình. Việc mở rộng diện tích, thâm canh liên tục quanh năm, kết hợp tập quán nhân giống bằng chiết cành trên hoa hồng và dùng hạt giống không kiểm soát nguồn gốc trên cây ớt đã tạo điều kiện cho các mầm bệnh vi khuẩn lưu tồn, lây lan. Trong đó, bệnh đốm lá vi khuẩn do chi Xanthomonas gây thiệt hại nghiêm trọng đến sinh trưởng, năng suất và giá trị thương phẩm.

Thực tế sản xuất cho thấy người dân phụ thuộc nhiều vào thuốc bảo vệ thực vật hóa học và kháng sinh vượt ngưỡng cho phép, gây ngộ độc cây trồng, tiêu diệt vi sinh vật có ích, làm bùng phát tính kháng thuốc của mầm bệnh và ô nhiễm môi trường. Do đó, việc nghiên cứu kiểm soát sinh học bằng các tác nhân vi khuẩn đối kháng (Biological Control Agents - BCA) là yêu cầu cấp thiết. Tại Đồng Tháp, bên cạnh vùng rễ cây trồng, các khu bảo tồn đất ngập nước tự nhiên như Vườn Quốc gia Tràm Chim, Khu di tích Xẻo Quýt và Khu du lịch sinh thái Gáo Giồng sở hữu hệ vi sinh vật bản địa chưa bị tác động bởi hóa chất nông nghiệp. Tuy nhiên, trước đây chưa có công trình nào phân lập, định danh chính xác tác nhân Xanthomonas gây bệnh đốm lá trên hoa hồng và ớt tại địa phương bằng các kỹ thuật phân tử hiện đại, cũng như khai thác nguồn vi khuẩn bản địa để tuyển chọn các dòng đối kháng phục vụ quản lý bệnh bền vững.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định hai mục tiêu chính:

• (i) Phân lập và xác định được các dòng vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng giống hồng lửa (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.).
• (ii) Tuyển chọn được những dòng vi khuẩn có khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn do Xanthomonas spp. gây ra.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu:
  • Cây ký chủ: Cây hoa hồng giống hồng lửa (hồng Pháp) và cây ớt chỉ thiên.
  • Vi sinh vật gây bệnh: Các dòng vi khuẩn thuộc chi Xanthomonas phân lập từ mẫu lá bệnh đốm lá trên hoa hồng và ớt tại tỉnh Đồng Tháp.
  • Vi sinh vật đối kháng: Các dòng vi khuẩn phân lập từ cơ chất vùng rễ cây hoa hồng, đất vùng rễ cây ớt và đất vùng sinh thái ngập nước bản địa tỉnh Đồng Tháp.
• Phạm vi nghiên cứu:
  • Không gian: Thí nghiệm phân lập, định danh và sàng lọc in vitro tại phòng thí nghiệm; thí nghiệm đánh giá khả năng gây bệnh và hiệu lực đối kháng trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng ruộng tại Sa Đéc, Châu Thành, Đồng Tháp.
  • Thời gian: Đề tài được triển khai thực hiện từ tháng 9 năm 2016 đến tháng 9 năm 2021.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước đây

Tác giả đã hệ thống hóa các tài liệu khoa học liên quan đến phân loại Xanthomonas, cơ chế tương tác đất - vi sinh vật và các biện pháp kiểm soát sinh học:

• Tác nhân Xanthomonas trên cây trồng: Chi Xanthomonas gồm các vi khuẩn Gram âm, hình que, sinh sắc tố vàng, gây bệnh trên hơn 400 loài thực vật (Ryan et al., 2011; Rodriguez et al., 2012). Trên họ Rosaceae, các ghi nhận gồm Xanthomonas fragariae trên dâu tây (Roberts et al., 1996) và X. arboricola pv. pruni trên đào (Wert et al., 2010). Trên cây hoa hồng, các nghiên cứu tại Florida và Texas của Huang et al. (2013) đã phân lập các dòng gây bệnh đốm lá thuộc Xanthomonas axonopodis phân nhóm 9.2 dựa trên giải trình tự đa locus (MLSA). Barak et al. (2016) giải trình tự toàn bộ hệ gen dòng GEV-Rose-07 và xác định độ tương đồng nucleotide >97% với Xanthomonas euvesicatoria, đề xuất danh pháp Xanthomonas euvesicatoria pv. rosa (Xer), được Fan et al. (2017) tiếp tục công nhận.
• Tác nhân Xanthomonas trên cây họ cà (Solanaceae): Jones et al. (2004) phân nhóm vi khuẩn gây đốm lá (Bacterial spot Xanthomonas - BSX) thành 4 loài: X. euvesicatoria, X. vesicatoria, X. perforans, và X. gardneri. Potnis et al. (2015) ghi nhận X. perforans xuất hiện trên ớt. Tại Hàn Quốc, Myung et al. (2009, 2015) phân lập các dòng từ ớt mang đặc điểm catalase dương tính, oxidase âm tính, không phân giải pectin và amylase. Kyeon et al. (2016) phân tích 72 mẫu bệnh trên ớt kết hợp RFLP gen rpoB, phân tích protein SDS-PAGE (phát hiện protein đặc trưng 32 kDa của X. euvesicatoria) và MLSA 3 gen (gapA, gyrB, lepA). Stoyanova et al. (2014) chứng minh việc chỉ dựa vào đặc tính sinh hóa amylolytic và cis-aconitic acid là chưa đủ để phân biệt các loài BSX.
• Kiểm soát sinh học mầm bệnh Xanthomonas:
  • Trên cây có múi (Xanthomonas citri subsp. citri): Gade & Lad (2018), Fira et al. (2018), Huang et al. với các dòng B. subtilis TKS1-1 và B. amyloliquefaciens WG6-14; Das et al. (2010) với dòng B. subtilis S-12; Khodakaramian et al. và Gholami et al. với các dòng Pseudomonas, Cronobacter, Enterobacter sinh bacteriocin.
  • Trên cây họ cải (Xanthomonas campestris pv. campestris): Singh et al. dùng B. subtilis và P. fluorescens; Mishra & Arora (2012) dùng P. fluorescens KA19 và B. thuringiensis SE; Liu et al. (2016) khảo sát 23 dòng PGPR; Ghazalibiglar et al. (2015) với dòng Paenibacillus P16.
  • Trên cà chua và ớt: Mirik et al. (2008) ứng dụng Bacillus spp.; Lanna Filho et al. (2010, 2017) dùng B. pumilus, Paenibacillus macerans và B. amyloliquefaciens; Abo-Elyousr & El-Hendawy (2008) dùng P. fluorescens; Liu et al. (2018) phối hợp các dòng PGPR (B. velezensis AP197 + AP298).
  • Nghiên cứu trong nước: Trung et al. phân lập 15 dòng Bacillus velezensis kháng nấm và Xanthomonas oryzae; Oanh (2020) nghiên cứu xạ khuẩn Streptomyces và Bacillus kiểm soát bệnh bạc lá lúa tại Hà Nam.

Vị trí và khoảng trống luận án giải quyết

Luận án định vị là nghiên cứu tiếp cận hệ thống từ nhận diện mầm bệnh bằng công cụ phổ khối lượng MALDI-TOF-MS kết hợp giải trình tự đa locus MLSA (6 gen giữ nhà) trên hoa hồng tại Đồng Tháp, đến việc sàng lọc đa tầng (in vitro, nhà lưới, ngoài đồng) các chủng vi khuẩn đối kháng có nguồn gốc từ vùng rễ và đất ngập nước tự nhiên bản địa.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Khung lý thuyết về vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật (PGPB/PGPR) và tác nhân kiểm soát sinh học (BCA) theo cơ chế: cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống, tổng hợp siderophore thu hút sắt (Pandey et al., 2005), tiết enzyme thủy phân vách tế bào như β-1,3-glucanase, cellulase, chitinase, protease (Szekeres et al., 2004), sinh hợp chất kháng sinh và HCN (Kang et al., 2004; Senthilkumar et al., 2009).
• Hệ thống đánh giá bệnh thực vật: Tỷ lệ bệnh (Disease Incidence - DI, %), Chỉ số bệnh (Severity Index - SI, %), và Chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian (Area Under Disease Progressive Curve - AUDPC).

Phương pháp nghiên cứu

Luận án triển khai theo 4 nội dung nghiên cứu thực nghiệm:

[Nội dung 1] Phân lập & Định danh mầm bệnh (Morphology, Sinh hóa, MALDI-TOF-MS, MLSA 6 gen)
[Nội dung 2] Tuyển chọn In Vitro dòng đối kháng (Khuếch tán thạch, Định danh MALDI-TOF-MS & 16S rRNA)
[Nội dung 3] Đánh giá hiệu lực trong Nhà lưới (Xử lý BCA, Lây nhiễm nhân tạo, Đo DI, SI, AUDPC tại 16 NSKLN)
[Nội dung 4] Đánh giá hiệu lực Ngoài đồng ruộng (Đánh giá trên hoa hồng và ớt tại vùng chuyên canh Đồng Tháp)

1. Phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh:

   • Thu mẫu lá hoa hồng giống hồng lửa và lá ớt có triệu chứng bệnh đốm lá tại các vườn chuyên canh ở Đồng Tháp.
   • Phân lập, tách ròng khuẩn lạc màu vàng đặc trưng trên môi trường nuôi cấy.
   • Thử nghiệm lây nhiễm nhân tạo trên cây ký chủ trong nhà lưới để kiểm tra khả năng gây bệnh (theo quy tắc Koch).
   • Xác định danh pháp qua đặc điểm hình thái, nhuộm Gram, thử nghiệm sinh hóa (catalase, oxidase).
   • Định danh bằng khối phổ MALDI-TOF-MS (so sánh dấu vân tay khối lượng peptide - PMF).
   • Phân tích trình tự đa locus (MLSA) đối với 6 gen giữ nhà (housekeeping genes): fusA (translation elongation factor G), gap-1 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), gltA (citrate synthase), gyrB (DNA gyrase subunit B), lacF (ABC transporter sugar permease), và lepA (GTP binding protein). Phân tích phát sinh loài bằng phần mềm Clustal X 2.6 và MEGA 5 theo mô hình Maximum Composite Likelihood.

2. Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng:

   • Nguồn mẫu: Cơ chất vùng rễ hoa hồng, đất vùng rễ ớt, và 9 mẫu đất thu tại Vườn Quốc gia Tràm Chim, Xẻo Quýt, Gáo Giồng.
   • Khảo sát khả năng đối kháng in vitro bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch, đo đường kính vòng vô khuẩn (mm) ở các nồng độ pha loãng khác nhau.
   • Định danh vi khuẩn đối kháng triển vọng bằng MALDI-TOF-MS và giải trình tự gen 16S rRNA, tra cứu BLASTN trên GenBank và đăng ký mã số truy cập (accession number).

3. Khảo nghiệm hiệu lực kiểm soát trong nhà lưới và ngoài đồng:

   • Bố trí thí nghiệm khối hoàn toàn ngẫu nhiên (RCBD), lây nhiễm nhân tạo mầm bệnh sau khi xử lý huyền phù vi khuẩn đối kháng (mật số tính bằng CFU/mL).
   • Đánh giá tỷ lệ bệnh (DI), chỉ số bệnh (SI) và chỉ số AUDPC tại các mốc thời gian, đặc biệt ghi nhận kết quả tại 16 ngày sau khi lây nhiễm (NSKLN).
   • Phương pháp xử lý số liệu: Phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định Duncan bằng phần mềm thống kê chuyên dụng.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Đặt vấn đề

Chương này nêu rõ bối cảnh nông nghiệp tỉnh Đồng Tháp đối mặt với áp lực dịch hại đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng và cây ớt. Tác giả luận giải tính cấp thiết của việc tìm kiếm tác nhân sinh học thay thế hóa chất độc hại, xác lập 2 mục tiêu, 4 nội dung nghiên cứu, đối tượng nghiên cứu (giống hồng lửa, ớt chỉ thiên, các mẫu vi khuẩn tại Đồng Tháp), phạm vi đề tài, ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Nội dung chương tổng hợp 6 mảng kiến thức lớn:

• Đặc điểm sinh học, phân loại, triệu chứng và tác hại của chi vi khuẩn Xanthomonas trên thực vật.
• Sơ lược về đặc tính nông học, giá trị kinh tế và thực trạng bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại Đồng Tháp.
• Tương tác sinh thái của quần thể vi khuẩn đất, vi khuẩn kích thích sinh trưởng (PGPB) và đặc điểm vi sinh vật đất ngập nước nội địa (Đồng Tháp Mười).
• Cơ chế ức chế mầm bệnh của vi khuẩn đối kháng (siderophore, enzyme phân giải thành tế bào, kháng sinh).
• Tổng quan các công trình nghiên cứu sử dụng vi khuẩn kiểm soát Xanthomonas spp. trên cây có múi, rau họ cải, họ cà và các cây trồng khác trên thế giới và tại Việt Nam.
• Cơ sở nguyên lý của hai kỹ thuật hiện đại: Khối phổ MALDI-TOF-MS và phân tích phát sinh loài đa gen MLSA.

Chương 3: Phương pháp nghiên cứu

Chương 3 trình bày chi tiết địa điểm, thời gian, thiết bị, môi trường nuôi cấy và thiết kế thí nghiệm cho 4 nội dung:

• Quy trình thu thập mẫu bệnh, phân lập ròng mầm bệnh, khảo sát khả năng gây bệnh trên 20 dòng hoa hồng và 20 dòng ớt trong nhà lưới.
• Thiết kế mồi PCR và chu trình nhiệt cho 6 gen housekeeping (fusA, gap-1, gltA, gyrB, lacF, lepA).
• Quy trình lấy mẫu đất ngập nước bản địa (9 vị trí tại Vườn Quốc gia Tràm Chim, Gáo Giồng, Xẻo Quýt) và mẫu vùng rễ.
• Phương pháp đánh giá đối kháng in vitro, bố trí thí nghiệm nhà lưới và ngoài đồng (quy mô lô thí nghiệm, số lần lặp lại, công thức tính DI, SI, AUDPC, mật độ vi khuẩn CFU/mL).

Chương 4: Kết quả và thảo luận

1. Phân lập và xác định danh pháp vi khuẩn gây bệnh

• Trên cây hoa hồng: Phân lập được 20 dòng vi khuẩn Xanthomonas spp. Khảo sát khả năng gây bệnh trong nhà lưới ghi nhận 3 dòng có độc lực mạnh nhất: XR9, XR13 và XR18. Phân tích MALDI-TOF-MS định danh 3 dòng này thuộc chi Xanthomonas. Giải trình tự và phân tích MLSA 6 gen giữ nhà đối với dòng đại diện XR13, so sánh ma trận tương đồng (Similarity matrix values) và xây dựng cây phát sinh loài, kết quả xác định dòng XR13 là Xanthomonas euvesicatoria (thuộc nhóm Xanthomonas axonopodis phân nhóm 9.2).
• Trên cây ớt: Phân lập 20 dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá. Tuyển chọn được 3 dòng gây bệnh mạnh nhất gồm XP1, XP7 và XP17. Dựa vào triệu chứng hình thái, phản ứng nhuộm Gram âm, phản ứng catalase dương tính và oxidase âm tính, xác định tác nhân gây bệnh là Xanthomonas spp.

Cây ký chủ	Mã dòng gây bệnh tiêu biểu	Đặc điểm nhận diện / Phương pháp định danh	Danh pháp xác định
Hoa hồng (Rosa spp.)	XR9, XR13, XR18	Phổ PMF (MALDI-TOF-MS), MLSA 6 gen (fusA, gap1, gltA, gyrB, lacF, lepA)	Xanthomonas euvesicatoria (X. axonopodis subgroup 9.2)
Ớt (Capsicum spp.)	XP1, XP7, XP17	Triệu chứng ngấm nước hoại tử, Gram (-), Catalase (+), Oxidase (-)	Xanthomonas spp.

2. Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng in vitro và định danh

• Đối kháng với Xanthomonas trên hoa hồng: Sàng lọc in vitro phát hiện 3 dòng từ cơ chất vùng rễ hoa hồng (BR16, BR37, BR88) và 3 dòng từ đất bản địa (T265, X61, G24) tạo đường kính vòng ức chế lớn trước các dòng XR13, XR9, XR18.
• Đối kháng với Xanthomonas trên cây ớt: Tuyển chọn được 3 dòng từ đất vùng rễ ớt (BP11, BP49, BP103) và 3 dòng từ đất bản địa (G24, T11, T188) có hiệu lực ức chế cao đối với các dòng XP17, XP7, XP1.
• Định danh các dòng đối kháng: Phân tích MALDI-TOF-MS và giải trình tự gen 16S rRNA xác định các dòng thuộc chi Bacillus (BR16, BR37, BR88, BP11, BP49, BP103, X32, X61, G24), dòng T11 thuộc chi Enterobacter, và dòng X16 thuộc chi Serratia. Các dòng ưu tú được đăng ký lên cơ sở dữ liệu GenBank gồm:
  • Dòng BR88: Bacillus amyloliquefaciens (mã số MW828656)
  • Dòng BP103: Bacillus velezensis (mã số OM017175)
  • Dòng G24: Bacillus subtilis (mã số MZ841644)

Mã dòng vi khuẩn	Nguồn gốc phân lập	Phương pháp định danh	Danh pháp khoa học	Mã số GenBank
BR88	Cơ chất vùng rễ hoa hồng	MALDI-TOF-MS, 16S rRNA	Bacillus amyloliquefaciens	MW828656
BP103	Đất vùng rễ cây ớt	MALDI-TOF-MS, 16S rRNA	Bacillus velezensis	OM017175
G24	Đất sinh thái bản địa (ngập nước)	MALDI-TOF-MS, 16S rRNA	Bacillus subtilis	MZ841644
BP49, X61	Đất vùng rễ ớt / Đất bản địa	MALDI-TOF-MS	Bacillus subtilis	—
T11	Đất sinh thái bản địa	MALDI-TOF-MS	Enterobacter sp.	—
X16	Đất sinh thái bản địa	MALDI-TOF-MS	Serratia sp.	—

3. Khảo sát hiệu quả kiểm soát bệnh trong nhà lưới

Tại thời điểm 16 NSKLN, các dòng đối kháng thể hiện hiệu lực giảm tỷ lệ bệnh (DI), chỉ số bệnh (SI) và chỉ số AUDPC rõ rệt so với đối chứng không xử lý:

• Trên cây hoa hồng: Dòng B. amyloliquefaciens BR88 (vùng rễ) và dòng B. subtilis G24 (đất bản địa) thể hiện hiệu quả kiểm soát cao nhất.
• Trên cây ớt: Dòng B. velezensis BP103 (vùng rễ) và dòng B. subtilis G24 (đất bản địa) mang lại hiệu quả giảm bệnh và chỉ số AUDPC tốt nhất.

4. Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh ngoài đồng ruộng

Kết quả thử nghiệm diện hẹp ngoài đồng ở 16 NSKLN khẳng định tính ổn định của các dòng vi khuẩn:

• Trên hoa hồng: Dòng BR88 đạt hiệu quả kiểm soát cao nhất trong nhóm vùng rễ; dòng G24 đạt hiệu quả cao nhất trong nhóm nguồn gốc đất bản địa.
• Trên cây ớt: Dòng BP103 cho hiệu quả cao nhất trong nhóm vùng rễ; dòng G24 tiếp tục dẫn đầu về khả năng ức chế bệnh ở nhóm đất bản địa.
• Đáng chú ý, dòng Bacillus subtilis MZ841644 (G24) phân lập từ đất ngập nước tự nhiên đạt hiệu lực kiểm soát bệnh vượt trội trên cả hai đối tượng cây hoa hồng và cây ớt trong điều kiện ngoài đồng.

Chương 5: Kết luận và đề xuất

Chương 5 tóm tắt các kết quả đạt được theo 2 nhóm mục tiêu, đồng thời đề xuất ứng dụng các dòng vi khuẩn tuyển chọn (BR88, BP103, G24) để phát triển chế phẩm sinh học phòng trị bệnh đốm lá tại vùng chuyên canh.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt lý luận và khoa học

• Cung cấp dẫn liệu khoa học chính xác về thành phần loài gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng giống hồng lửa tại Đồng Tháp là Xanthomonas euvesicatoria (thuộc nhóm Xanthomonas axonopodis phân nhóm 9.2) thông qua phân tích sinh học phân tử MLSA 6 gen giữ nhà (fusA, gap1, gltA, gyrB, lacF, lepA) và phổ khối lượng MALDI-TOF-MS.
• Chứng minh tiềm năng đa dạng sinh học và giá trị ứng dụng của nguồn vi khuẩn bản địa từ hệ sinh thái đất ngập nước tự nhiên Đồng Tháp (Tràm Chim, Xẻo Quýt, Gáo Giồng) trong việc cung cấp các chủng vi sinh vật đối kháng mầm bệnh thực vật.
• Xác định và đăng ký thành công lên cơ sở dữ liệu NCBI các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng: Bacillus amyloliquefaciens MW828656 (BR88), Bacillus velezensis OM017175 (BP103), và Bacillus subtilis MZ841644 (G24).

Đóng góp về mặt thực tiễn

• Tuyển chọn được các dòng vi khuẩn đối kháng bản địa có hoạt lực cao, thích nghi tốt với điều kiện sinh thái địa phương, làm cơ sở sản xuất chế phẩm sinh học (BCA) thay thế thuốc bảo vệ thực vật hóa học.
• Xây dựng quy trình đánh giá sàng lọc đa tầng từ in vitro, nhà lưới đến ngoài đồng ruộng phục vụ công tác nghiên cứu và chuyển giao quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) trên cây hoa kiểng và cây rau màu.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Khuyến nghị tiếp tục nghiên cứu công nghệ lên men, tạo cơ chất mang và xây dựng dạng bào chế thương phẩm (chế phẩm sinh học) từ các dòng B. subtilis G24, B. velezensis BP103 và B. amyloliquefaciens BR88.
• Xây dựng mô hình ứng dụng thử nghiệm quy mô lớn tại các hợp tác xã sản xuất hoa hồng Sa Đéc và vùng chuyên canh ớt Thanh Bình, kết hợp đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng ngoài đồng ruộng.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án

• Nghiên cứu chỉ tập trung trên hai giống cây trồng cụ thể là hoa hồng giống hồng lửa và ớt chỉ thiên; chưa mở rộng đánh giá phản ứng trên các giống hoa hồng và giống ớt thương mại khác.
• Việc định danh tác nhân gây bệnh đốm lá trên cây ớt dừng lại ở mức độ chi Xanthomonas spp. dựa trên đặc điểm hình thái, sinh hóa, chưa tiến hành giải trình tự đa locus (MLSA) sâu như trên đối tượng hoa hồng.
• Hiệu quả kiểm soát ngoài đồng ruộng mới được khảo nghiệm ở các ô thí nghiệm diện hẹp tại một số tiểu vùng sinh thái của tỉnh Đồng Tháp.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Tiến hành phân tích sâu hệ gen (whole-genome sequencing) hoặc MLSA cho các dòng Xanthomonas spp. phân lập từ cây ớt để xác định chính xác vị trí loài và phân loài.
• Khảo sát chi tiết cơ chế phân tử của hoạt tính đối kháng (giải trình tự các cụm gen tổng hợp lipopeptide kháng sinh như surfactin, iturin, fengycin hoặc bacteriocin) của dòng B. subtilis G24.
• Hoàn thiện quy trình sản xuất sinh khối, nghiên cứu chất phụ gia bảo quản và khảo nghiệm diện rộng trên nhiều vùng sinh thái nông nghiệp khác nhau.

---

Giá trị tham khảo

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên ngành Công nghệ sinh học, Bảo vệ thực vật, Vi sinh vật học: Tài liệu tham khảo về quy trình phân lập, giám định vi khuẩn gây bệnh và sàng lọc tác nhân đối kháng sinh học.
• Giảng viên và cán bộ nghiên cứu: Nguồn dữ liệu thực nghiệm về ứng dụng kỹ thuật MALDI-TOF-MS và MLSA 6 gen trong phân loại vi khuẩn thực vật.
• Cán bộ khuyến nông và nhà quản lý nông nghiệp: Căn cứ khoa học định hướng các mô hình canh tác nông nghiệp an toàn, bền vững, giảm thiểu sử dụng hóa chất độc hại tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long.

Các phần đáng tham khảo trong luận án

• Phương pháp phân tích trình tự đa locus (MLSA) với hệ thống 6 gen giữ nhà (fusA, gap-1, gltA, gyrB, lacF, lepA) tại Bảng 3.2 và Hình 4.7.
• Quy trình ứng dụng khối phổ MALDI-TOF-MS để định danh nhanh vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn đối kháng.
• Chuỗi thí nghiệm đánh giá hiệu lực sinh học thông qua các chỉ số DI, SI và AUDPC theo dõi diễn tiến bệnh đến 16 ngày sau lây nhiễm.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tác nhân gây bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng tại Đồng Tháp được xác định là loài nào và bằng phương pháp gì?
Trả lời: Tác nhân gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng giống hồng lửa được xác định là Xanthomonas euvesicatoria (thuộc nhóm Xanthomonas axonopodis phân nhóm 9.2). Kết quả này được xác định thông qua việc kết hợp kỹ thuật phân tích khối phổ protein MALDI-TOF-MS và phân tích phát sinh loài bằng kỹ thuật giải trình tự đa locus (MLSA) trên 6 gen giữ nhà (fusA, gap-1, gltA, gyrB, lacF, lepA).

2. Các dòng vi khuẩn đối kháng ưu tú nhất được phân lập từ những nguồn nào và mang mã số đăng ký GenBank là gì?
Trả lời: Ba dòng vi khuẩn đối kháng đạt hiệu lực cao nhất gồm:

• Dòng BR88 phân lập từ cơ chất vùng rễ hoa hồng, được định danh là Bacillus amyloliquefaciens (mã số GenBank: MW828656).
• Dòng BP103 phân lập từ đất vùng rễ cây ớt, được định danh là Bacillus velezensis (mã số GenBank: OM017175).
• Dòng G24 phân lập từ đất vùng sinh thái bản địa ngập nước, được định danh là Bacillus subtilis (mã số GenBank: MZ841644).

3. Hiệu lực kiểm soát bệnh đốm lá của dòng vi khuẩn Bacillus subtilis G24 có điểm gì đáng chú ý?
Trả lời: Dòng Bacillus subtilis MZ841644 (G24) có nguồn gốc từ đất vùng sinh thái bản địa (khu bảo tồn đất ngập nước tự nhiên tại Đồng Tháp). Trong cả điều kiện nhà lưới và thử nghiệm ngoài đồng ruộng ở mốc 16 ngày sau lây nhiễm, dòng G24 đều đạt hiệu quả giảm tỷ lệ bệnh (DI), giảm chỉ số bệnh (SI) và giảm chỉ số tích lũy bệnh (AUDPC) cao nhất trên cả hai đối tượng cây chủ là hoa hồng và ớt.

4. Kỹ thuật MALDI-TOF-MS đóng vai trò như thế nào trong luận án?
Trả lời: MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry) được sử dụng để phân tích dấu vân tay khối lượng peptide (PMF) từ tế bào vi khuẩn nguyên vẹn. Kỹ thuật này giúp phân loại, định danh nhanh chóng và chính xác các dòng vi khuẩn gây bệnh (Xanthomonas spp.) và các dòng vi khuẩn đối kháng (Bacillus subtilis, Bacillus spp., Enterobacter sp., Serratia sp.) với thời gian đo ngắn và độ tin cậy cao so với các phương pháp sinh hóa truyền thống.

---

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Lê Uyển Thanh đã giải quyết trọn vẹn hai mục tiêu khoa học về phân lập, xác định chính xác tác nhân vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Xanthomonas euvesicatoria) và cây ớt (Xanthomonas spp.) tại tỉnh Đồng Tháp bằng các công cụ hiện đại như MALDI-TOF-MS và MLSA. Công trình đã tuyển chọn thành công các dòng vi khuẩn đối kháng bản địa ưu tú gồm Bacillus amyloliquefaciens MW828656 (BR88), Bacillus velezensis OM017175 (BP103) và đặc biệt là Bacillus subtilis MZ841644 (G24) có khả năng kiểm soát bệnh hiệu quả trong cả điều kiện nhà lưới và ngoài đồng ruộng. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu học thuật quan trọng và mở ra triển vọng ứng dụng chế phẩm sinh học phục vụ sản xuất nông nghiệp bền vững tại Đồng bằng sông Cửu Long.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Ngày nay, sản xuất nông nghiệp phụ thuộc rất nhiều vào việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật nhờ chúng đạt hiệu quả nhanh chóng. Thực trạng biến đổi khí hậu ngày càng khiến canh tác nông nghiệp gặp nhiều khó khăn như cây trồng sinh trưởng phát triển không hiệu quả, dịch bệnh dễ bùng phát, và tình trạng ô nhiễm môi trường ngày càng trở nên trầm trọng. Tại Đồng Tháp, gần đây đã xuất hiện nhiều dịch bệnh nghiêm trọng. Trong đó, bệnh đốm lá vi khuẩn do chi Xanthomonas gây ra trên hai loài cây trồng chủ lực của tỉnh là cây ớt và cây hoa hồng là đặc biệt nghiêm trọng.

Đối với các nông hộ thu nhập chính từ hai loài cây này, nông dân đã tiến hành canh tác liên tục trong năm để tăng thu nhập, kết hợp với việc mở rộng không ngừng vùng chuyên canh đã tạo điều kiện thuận lợi cho nhiều mầm bệnh phát triển và gây hại. Bên cạnh đó, biện pháp chiết nhánh cây hoa hồng để giữ giống hoặc sử dụng hạt giống ớt không kiểm soát nguồn gốc đã giúp bệnh lưu tồn và lây lan từ vụ này sang vụ khác. Để đối phó với bệnh đốm lá vi khuẩn, khi bệnh mới phát nên nhổ bỏ ngay cây bệnh và hạn chế tưới nước, nên phun ngay các loại thuốc hóa học đặc trị vi khuẩn (Cúc & Thủy, 2014). Tuy nhiên, thuốc kháng sinh và thuốc bảo vệ thực vật thường được sử dụng vượt ngưỡng cho phép, gây ngộ độc cho cây, sẽ rất tốn kém, có hại cho thiên địch và các vi sinh vật có lợi, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng (Robison et al., 2006; Adesemoye et al., 2009) và dễ làm mầm bệnh kháng thuốc.

Do đó, cần tập trung nghiên cứu phát triển các phương pháp mới giúp kiểm soát bệnh cây trồng một cách bền vững (Gerhardson, 2002), tiết kiệm chi phí và hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực vật. Trong trường hợp này, kiểm soát sinh học (biological control) ứng dụng vi khuẩn kiểm soát bệnh (Biological control agent- BCA) là một chiến lược quan trọng trong việc quản lý canh tác một cách bền vững và giảm các vấn đề về môi trường (Bale et al., 2008; Adesemoye et al., 2009; Hungria et al. Các chế phẩm vi sinh vật được sử dụng hiệu quả nhằm giảm bệnh hại trên lá hoặc sau thu hoạch ở các loại cây ngũ cốc, rau, cây ăn trái, cây hoa, cây cảnh (Cawoy et al. Chúng phân tán nhanh hơn vào môi trường và thường ít độc hơn đối với các loài không phải mục tiêu.

Ngoài ra, vì sử dụng các phương thức tác động khác với thuốc bảo vệ thực vật thông thường nên chúng có thể giúp ngăn chặn các mầm bệnh kháng thuốc (Bhattacharyya et al., 2016; Marasco et al. Trước đây, đa số các diện tích ẩm, lầy thấp ở Đồng Tháp được bao phủ bởi rừng rậm, và cây tràm được xem là đặc thù. Hiện nay, tại Đồng Tháp rừng đặc dụng được phân bổ ở các khu vực được bảo tồn như Vườn Quốc Gia Tràm Chim, Khu di tích Xẻo Quýt, Khu du lịch sinh thái Gáo Giồng). Những khu vực này do được bảo tồn khỏi các hoạt động của con người, đặc biệt là hoạt động nông nghiệp nên hệ vi sinh vật có thể 1 luan an còn rất đa dạng.

Bên cạnh vi khuẩn vùng rễ, đây là nguồn tài nguyên quý giá phục vụ cho công tác tuyển chọn các dòng vi sinh vật kiểm soát bệnh hiệu quả. Xuất phát từ những hiện trạng trên, luận án “Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh đồng tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh” đã được thực hiện.2 Mục tiêu của luận án Phân lập và xác định được các dòng vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.

Tuyển chọn được những dòng vi khuẩn có khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn do Xanthomonas spp.3 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Phân lập, khảo sát khả năng gây hại và xác định các dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng giống hồng lửa và cây ớt. Nội dung 2: Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng đối kháng với Xanthomonas spp. được phân lập từ cơ chất vùng rễ và đất vùng sinh thái bản địa. Nội dung 3: Khảo sát khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trong điều kiện nhà lưới của những dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng Nội dung 4: Đánh giá hiệu quả của những dòng vi khuẩn kiểm soát bệnh tiềm năng ở điều kiện ngoài đồng 1.4 Tính mới của luận án Nghiên cứu đã ghi nhận Xanthomonas euvesicatoria gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng và Xanthomonas spp.

gây bệnh đốm lá trên cây ớt nhờ vào các kỹ thuật sinh hóa, MALDI-TOF-MS và sinh học phân tử như multilocus sequence analysis (MLSA). Bên cạnh đó, nghiên cứu còn ghi nhận B. subtilis (BR37, BP49, X61), Bacillus spp. (X16) có khả năng đối kháng đáng kể, đặc biệt, nghiên cứu đã tuyển chọn được B.

subtilis G24 có khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn hiệu quả nhất dựa trên các thí nghiệm sàng lọc in vitro, nhà lưới, ngoài đồng, và được xác định danh pháp bằng kỹ thật phân tích MALDI-TOF-MS và Sinh học phân tử. Các dòng vi khuẩn này có thể được sử dụng như tác nhân sinh học phòng trị bệnh đốm lá trên cây hoa hồng và cây ớt.5 Phạm vi và đối tượng nghiên cứu 1.1 Phạm vi nghiên cứu 2 luan an Nghiên cứu được thực hiện trong phạm vi phòng thí nghiệm khi phân lập vi khuẩn gây bệnh và tuyển chọn in vitro các dòng vi khuẩn đối kháng. Nghiên cứu đánh giá khả năng gây hại của các dòng Xanthomonas spp. và đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh của các dòng vi khuẩn đối kháng được thực hiện ở điều kiện nhà lưới và ngoài đồng.2 Đối tượng nghiên cứu Giống cây hoa hồng giống hồng lửa và cây ớt chỉ thiên được sử dụng trong thí nghiệm, đây là giống cây được người dân trồng phổ biến tại tỉnh Đồng Tháp và được người dân đánh giá là giống có tỷ lệ nhiễm bệnh nhiều nhất.

Bên cạnh đó, vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn đối kháng được phân lập từ tỉnh Đồng Tháp.6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.1 Ý nghĩa khoa học Dựa trên các kỹ thuật phân tích liên quan đến sinh hóa và sinh học phân tử hiện đại xác định được các dòng gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng cũng như trên cây ớt làm cơ sở cho các thí nghiệm tuyển chọn vi khuẩn đối kháng có khả năng kiểm soát bệnh. Đồng thời qua các kỹ thuật này cũng xác định được các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng, góp phần vào chứng minh và khẳng định khả năng áp dụng vào thực tế sản xuất của các dòng vi khuẩn đối kháng này. Việc phân tích khả năng gây hại của mầm bệnh và khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn được phân lập trên cơ sở các kết quả đã được xử lý bằng các phân tích khoa học trên phần mềm đã được công nhận đã cung cấp một nguồn thông tin khoa học, tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu tiếp theo.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học hướng đến sử dụng các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng trong kiểm soát bệnh đốm lá trên cây hoa hồng và cây ớt trong điều kiện sản xuất thực tế, phục vụ sự phát triển nông nghiệp theo hướng bền vững. 3 luan an CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về chi Xanthomonas gây bệnh trên thực vật 2.1 Tác nhân gây bệnh Bệnh do vi khuẩn gây ra là một trong những trở ngại khó kiểm soát và dễ tái phát nhất đối với các vụ mùa trên khắp thế giới.

Nguyên nhân là do sự tăng sinh nhanh chóng, sự khó khăn trong quản lý, các vấn đề phát sinh khi kiểm soát bằng thuốc hóa học, và sự thiệt hại nghiêm trọng của các trang trại bị nhiễm bệnh (Sundin et al. Xanthomonas là một chi vi khuẩn lớn gây bệnh trên thực vật, có phản ứng gram âm, hình que và sắc tố vàng. Chi này gây bệnh trên 400 loài vật phân bố trên toàn thế giới và là tác nhân gây bệnh cho một số cây trồng quan trọng về kinh tế như: lúa (rice), cam quýt (citrus), sắn (cassava), cà chua (tomato), mía đường (sugar cane), chanh dây (passionfruit), chuối (banana) (Ryan et al., 2011; Rodriguez et al. Vi khuẩn thuộc chi Xanthomonas có thể tương tác với cây chủ bằng nhiều phương thức, chúng có thể tồn tại trong đất, hạt giống, tàn tích cây trồng, tương tác với côn trùng và đặc biệt là có thể sống độc lập với cây chủ.

Những hình thức sinh tồn này tạo điều kiện cho sự phát triển của dịch bệnh (Marcuzzo, 2009). Một số Xanthomonas spp. gây bệnh cho các loài cây thuộc họ Rosaceae đã được báo cáo, như Xanthomonas fragariae trên dâu tây (Roberts et al. pruni trên đào (Wert et al.

Tuy nhiên, rất ít báo cáo về Xanthomonas spp. gây bệnh về hoa hồng (Rosa spp.), một thành viên của họ Rosaceae, bước đầu ghi nhận dòng vi khuẩn này trên cây hoa hồng thuộc loài Xanthomonas euvesicatoria (Huang et al. 2013; Barak et al. Trên họ Solanaceae, Jones et al.

(2004) đã ghi nhận rằng tất cả vi khuẩn thuộc Xanthomonas gây bệnh đốm lá vi khuẩn (bacterial spot Xanthomonas – BSX) được phân thành 4 loài là X. vesicatoria gây bệnh trên cả ớt và cà chua (Jones et al. Trong khi, một số loài Xanthomonas spp. chỉ gây bệnh trên cà chua như X.

Tuy nhiên, gần đây Potnis et al. (2015) lại ghi nhận X. perforans đã xuất hiện trên ớt. Tại Hàn Quốc, Myung et al.

(2015) và Kyeon et al. (2016) đã ghi nhận Xanthomonas euvesicatoria gây bệnh trên ớt (Capsicum sp. Các vi khuẩn thuộc chi Xanthomonas lây nhiễm và gây bệnh trên nhiều loài thực vật nhờ vào các nhân tố lây nhiễm như các polysaccharide bề mặt, các chất có khả năng kết dính, các hệ thống tiết và phản ứng siêu nhạy cảm khác nhau, các chất độc, các chức năng liên quan làm mất tác dụng các hợp chất kháng khuẩn của cây trồng tiết ra, và khả năng thu nhận chất dinh dưỡng (Agrios, 2005).2 Triệu chứng bệnh Những triệu chứng bệnh điển hình của bệnh đốm lá vi khuẩn như: dưới dạng những đốm nhỏ, ngấm nước, phát triển thành những đốm hoại tử bất thường và có góc cạnh, thường có đường kính từ 1,58 mm (1/16 inch) đến 6,35 mm (1/4 inch). Những đốm này có trung tâm màu xám nhạt và mép nâu tối, được bao quanh bởi các vòng màu vàng hẹp (Lowell et al., 1991; Agrios, 2005; Nguyễn Thị Thu Cúc và Trần Thị Thu Thủy, 2014).