NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Colletotrichum spp. GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN DƯA LEO VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ BẰNG VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG

• Tác giả: Nguyễn Thị Liên
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Đắc Khoa
• Trường học: Trường Đại học Cần Thơ
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Đa Dạng Di Truyền Của Nấm Colletotrichum Spp. Gây Bệnh Thán Thư Trên Dưa Leo Và Biện Pháp Phòng Trị Bằng Vi Khuẩn Đối Kháng
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Cần Thơ

• TÓM TẮT
• LỜI CAM ĐOAN
• MỤC LỤC
• DANH SÁCH BẢNG
• DANH SÁCH HÌNH
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
• 1.1. Đặt vấn đề
• 1.2. Mục tiêu đề tài
• 1.3. Đối tượng nghiên cứu
• 1.4. Phạm vi nghiên cứu
• 1.5. Nội dung nghiên cứu
• 1.6. Đóng góp mới của luận án
• 1.7. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án
• 1.7.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.7.2. Ý nghĩa thực tế
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Bệnh thán thư trên dưa leo
• 2.2. Chu kỳ bệnh
• 2.3. Tổng quan về nấm
• 2.4. Kỹ thuật nghiên cứu đa dạng di truyền
• 2.4.1. Kỹ thuật đa hình đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphic DNA – RAPD)
• 2.4.2. Kỹ thuật đa dạng đoạn giữa các chuỗi lặp lại đơn giản (Inter simple sequence repeat – ISSR)
• 2.5. Vi khuẩn vùng rễ cây trồng
• 2.5.1. Tương tác giữa vi khuẩn vùng rễ và cây trồng
• 2.5.2. Khả năng kiểm soát bệnh hại cây trồng của vi khuẩn vùng rễ
• 2.5.3. Cơ chế đối kháng của vi khuẩn
• 2.5.4. Một số nghiên cứu về vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng và kiểm soát bệnh hại cây trồng
• 3. CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Phương tiện nghiên cứu
• 3.1.1. Thời gian và địa điểm
• 3.1.2. Nguyên vật liệu
• 3.1.3. Thiết bị - dụng cụ và hóa chất
• 3.2. Đánh giá đa dạng di truyền của nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trên cây dưa leo tại đồng bằng sông Cửu Long
• 3.2.1. Phân lập và nhận diện mầm bệnh
• 3.2.2. Đa dạng di truyền của các chủng nấm
• 3.2.3. Nhận diện nấm bằng kỹ thuật sinh học phân tử
• 3.3. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ cây dưa leo kháng nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư ở đồng bằng sông Cửu Long
• 3.3.1. Phân lập và khảo sát khả năng đối kháng nấm của vi khuẩn vùng rễ
• 3.3.2. Các cơ chế đối kháng của các chủng vi khuẩn vùng rễ tuyển chọn
• 3.3.3. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn vùng rễ tuyển chọn đến chỉ số khoẻ mạnh của hạt dưa leo
• 3.3.4. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn vùng rễ tuyển chọn đến khả năng sinh trưởng và phát triển của dưa leo
• 3.3.5. Hiệu quả giảm bệnh của các chủng vi khuẩn vùng rễ tuyển chọn ở điều kiện nhà lưới
• 3.3.6. Định danh vi khuẩn đối kháng
• 3.3.7. Khảo sát hiệu quả giảm bệnh của chủng vi khuẩn đối kháng ở điều kiện ngoài đồng
• 3.4. Xử lý số liệu
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Đa dạng di truyền của nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trên cây dưa leo tại đồng bằng sông Cửu Long
• 4.1.1. Kết quả phân lập nấm từ vết bệnh
• 4.1.2. Kết quả thực hiện quy trình Koch
• 4.1.3. Đặc điểm tản nấm và bào tử của các chủng nấm gây bệnh trên dưa leo
• 4.1.4. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng nấm
• 4.1.5. Đa dạng di truyền của các chủng C. lagenarium thông qua phân tích với marker RAPD và ISSR
• 4.1.6. Kết quả nhận diện nấm bằng kỹ thuật sinh học phân tử
• 4.2. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ cây dưa leo kháng nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư ở đồng bằng sông Cửu Long
• 4.2.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn vi khuẩn vùng rễ đối kháng
• 4.2.2. Kết quả khảo sát các đặc tính đối kháng của các chủng vi khuẩn vùng rễ tuyển chọn
• 4.2.3. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đối kháng mạnh đến chỉ số khoẻ mạnh của hạt dưa leo
• 4.2.4. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đối kháng mạnh đến các chỉ tiêu sinh trưởng của cây dưa leo
• 4.2.5. Hiệu quả giảm bệnh thán thư trên dưa leo ở điều kiện nhà lưới dưới tác động của vi khuẩn đối kháng
• 4.2.6. Kết quả định danh chủng vi khuẩn đối kháng
• 4.2.7. Kết quả khảo sát hiệu quả phòng trừ bệnh thán thư của chủng Bacillus amyloliquefaciens VL4.6 ở điều kiện ngoài đồng
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Giới Thiệu Bệnh Thán Thư Dưa Leo Tác Hại Tổng Quan

Dưa leo (Cucumis sativus L.), một loại rau quả quan trọng và giàu dinh dưỡng, được trồng rộng rãi ở vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Bên cạnh vai trò là thực phẩm, dưa leo còn được ứng dụng trong y học và thẩm mỹ. Tuy nhiên, quá trình canh tác dưa leo thường xuyên đối mặt với nhiều thách thức, trong đó có sự tấn công của các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, nấm bệnh và côn trùng. Đặc biệt, bệnh thán thư trên dưa leo do nấm Colletotrichum lagenarium gây ra những thiệt hại đáng kể về năng suất và chất lượng. Theo nghiên cứu của Damm et al., C. lagenarium (còn được gọi là Colletotrichum orbiculare) là tác nhân chính gây ra bệnh thán thư trên dưa leo. Sự đa dạng về nòi của C. lagenarium cũng là một yếu tố làm phức tạp thêm quá trình phòng trị bệnh, gây ảnh hưởng đến nhiều loại cây trồng thuộc họ bầu bí.

1.1. Tầm quan trọng của dưa leo trong nông nghiệp và đời sống

Dưa leo không chỉ là nguồn cung cấp thực phẩm quan trọng mà còn mang lại giá trị kinh tế cao cho người nông dân. Với khả năng thích nghi với nhiều điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng, dưa leo trở thành một loại cây trồng phổ biến và đóng góp vào sự đa dạng của hệ thống canh tác. Bên cạnh đó, dưa leo còn có vai trò quan trọng trong y học và làm đẹp, với nhiều công dụng đã được chứng minh. Tuy nhiên, để khai thác tối đa tiềm năng của cây dưa leo, việc kiểm soát hiệu quả các loại bệnh hại, đặc biệt là bệnh thán thư, là vô cùng quan trọng.

1.2. Thiệt hại kinh tế do bệnh thán thư gây ra trên dưa leo

Bệnh thán thư gây ra những thiệt hại đáng kể cho người trồng dưa leo. Bệnh có thể lây lan nhanh chóng trong điều kiện thời tiết ẩm ướt, làm giảm năng suất và chất lượng quả, thậm chí gây mất trắng nếu không được kiểm soát kịp thời. Ngoài ra, việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học để phòng trị bệnh thán thư cũng làm tăng chi phí sản xuất, ảnh hưởng đến lợi nhuận của người nông dân. Hơn nữa, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật có thể gây hại cho sức khỏe người tiêu dùng và môi trường.

II. Giải Pháp Mới Vi Khuẩn Đối Kháng Phòng Trị Thán Thư

Trong bối cảnh các loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học đang đối mặt với nhiều thách thức như ô nhiễm môi trường, kháng thuốc và ảnh hưởng đến sức khỏe con người, việc tìm kiếm các giải pháp thay thế an toàn và bền vững trở nên cấp thiết. Một trong những hướng đi đầy hứa hẹn là sử dụng các tác nhân kiểm soát sinh học (BCA), trong đó vi khuẩn đối kháng đóng vai trò quan trọng. Theo Vanshree et al., BCA có thể được ứng dụng làm thuốc trừ sâu sinh học, phân bón sinh học và tác nhân kích thích sinh trưởng thực vật. Vi khuẩn đối kháng sử dụng nhiều cơ chế hoạt động khác nhau để kiểm soát mầm bệnh, bao gồm tương tác trực tiếp với mầm bệnh, sản sinh enzyme phân giải và cạnh tranh dinh dưỡng.

2.1. Ưu điểm vượt trội của vi khuẩn đối kháng so với thuốc hóa học

Vi khuẩn đối kháng mang lại nhiều lợi ích so với thuốc hóa học trong phòng trị bệnh thán thư. Chúng an toàn hơn cho môi trường và sức khỏe con người, không gây ra tình trạng kháng thuốc ở nấm bệnh, và có khả năng kích thích sinh trưởng cho cây trồng. Ngoài ra, vi khuẩn đối kháng có thể sống cộng sinh với cây trồng, cung cấp sự bảo vệ lâu dài và bền vững. Việc sử dụng vi khuẩn đối kháng cũng phù hợp với xu hướng phát triển nông nghiệp hữu cơ và bền vững.

2.2. Cơ chế hoạt động của vi khuẩn đối kháng chống lại nấm bệnh

Vi khuẩn đối kháng có nhiều cơ chế hoạt động để ức chế sự phát triển của nấm Colletotrichum spp., bao gồm cạnh tranh dinh dưỡng, sản sinh các chất kháng sinh, enzyme phân giải vách tế bào nấm (chitinase, glucanase), và kích hoạt hệ thống phòng thủ của cây trồng. Một số vi khuẩn đối kháng còn có khả năng tạo ra các chất siderophore để cạnh tranh sắt với nấm bệnh, hoặc tạo ra các hợp chất dễ bay hơi (VOCs) có tác dụng ức chế sự phát triển của nấm. Việc hiểu rõ cơ chế hoạt động của vi khuẩn đối kháng sẽ giúp tối ưu hóa hiệu quả sử dụng trong phòng trị bệnh.

2.3. Tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn đối kháng trong sản xuất dưa leo sạch

Việc ứng dụng vi khuẩn đối kháng trong sản xuất dưa leo mở ra tiềm năng lớn cho việc tạo ra sản phẩm an toàn, chất lượng và thân thiện với môi trường. Vi khuẩn đối kháng có thể được sử dụng để xử lý hạt giống, tưới vào đất hoặc phun lên lá cây, giúp bảo vệ cây trồng khỏi bệnh thán thư và các bệnh hại khác. Việc kết hợp vi khuẩn đối kháng với các biện pháp canh tác bền vững khác như luân canh, bón phân hữu cơ, và quản lý dịch hại tổng hợp sẽ góp phần xây dựng hệ thống sản xuất dưa leo sạch và bền vững.

III. Nghiên Cứu Phân Lập Đánh Giá Vi Khuẩn Đối Kháng Hiệu Quả

Nghiên cứu tập trung vào việc phân lập và đánh giá các chủng vi khuẩn đối kháng từ vùng rễ cây dưa leo, nhằm tìm ra những chủng có khả năng ức chế mạnh mẽ sự phát triển của nấm Colletotrichum spp. Các chủng vi khuẩn đối kháng được tuyển chọn dựa trên khả năng ức chế nấm trong phòng thí nghiệm, khả năng sinh các enzyme phân giải, khả năng tạo siderophore và khả năng cố định đạm, hòa tan lân. Theo luận án, tổng số 135 chủng vi khuẩn phân lập từ đất vùng rễ cây dưa leo có khả năng đối kháng với nấm C. lagenarium, phần trăm ức chế sự phát triển của sợi nấm dao động từ 28,0-54,8%.

3.1. Quy trình phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng

Quy trình phân lập vi khuẩn đối kháng bắt đầu bằng việc thu thập mẫu đất vùng rễ cây dưa leo từ các vùng trồng dưa leo khác nhau. Sau đó, các mẫu đất được pha loãng và nuôi cấy trên môi trường chọn lọc để phân lập các vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum spp. Các chủng vi khuẩn phân lập được đánh giá khả năng ức chế nấm trên đĩa thạch, và những chủng có khả năng ức chế mạnh nhất sẽ được tuyển chọn để tiếp tục nghiên cứu.

3.2. Đánh giá khả năng ức chế nấm Colletotrichum spp. trong phòng thí nghiệm

Khả năng ức chế nấm Colletotrichum spp. của các chủng vi khuẩn đối kháng được đánh giá thông qua phương pháp đối kháng trực tiếp trên đĩa thạch. Các chủng vi khuẩn được cấy cạnh nấm Colletotrichum spp. trên đĩa thạch, và sau một thời gian ủ, khả năng ức chế sự phát triển của nấm được đánh giá bằng cách đo đường kính vòng ức chế. Những chủng vi khuẩn có vòng ức chế lớn được coi là có khả năng ức chế nấm mạnh.

3.3. Xác định các đặc tính đối kháng của vi khuẩn được tuyển chọn

Các chủng vi khuẩn đối kháng được tuyển chọn sẽ được đánh giá các đặc tính đối kháng như khả năng sinh các enzyme phân giải (chitinase, glucanase, protease), khả năng tạo siderophore, khả năng cố định đạm, hòa tan lân, và khả năng sản sinh các chất kháng sinh. Việc xác định các đặc tính này sẽ giúp hiểu rõ cơ chế hoạt động của vi khuẩn đối kháng và lựa chọn những chủng có tiềm năng ứng dụng cao.

IV. Ứng Dụng Thực Tế Vi Khuẩn Đối Kháng Trên Đồng Ruộng

Nghiên cứu đã tiến hành đánh giá hiệu quả của các chủng vi khuẩn đối kháng trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng ruộng. Kết quả cho thấy việc phun lên lá dưa leo ở thời điểm 1 ngày sau chủng bệnh (NSCB) hoặc phun kết hợp 1 ngày trước chủng bệnh và 1 NSCB với huyền phù mật số 108 tế bào/mL của chủng vi khuẩn CL16, CL8, ĐTII3.3, ĐTII7 hoặc VL4.6 giúp giảm bệnh thán thư khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng không xử lý. Bên cạnh đó, ngâm hạt dưa leo giống hoặc tưới vào đất huyền phù mật số 108 tế bào/mL của chủng vi khuẩn ĐTII3.6 ở thời điểm 1 ngày trước hoặc 1 ngày sau khi gieo (NSKG) cũng có khả năng giúp giảm bệnh.

4.1. Hiệu quả phòng trị bệnh thán thư trong điều kiện nhà lưới

Trong điều kiện nhà lưới, việc phun các chủng vi khuẩn đối kháng lên lá dưa leo cho thấy hiệu quả rõ rệt trong việc giảm bệnh thán thư. Các nghiệm thức phun vi khuẩn đều cho thấy tỷ lệ bệnh thấp hơn đáng kể so với đối chứng không xử lý. Kết quả này chứng minh rằng vi khuẩn đối kháng có khả năng bảo vệ cây dưa leo khỏi sự tấn công của nấm Colletotrichum spp. trong điều kiện kiểm soát.

4.2. Thử nghiệm ngoài đồng ruộng Kết quả khả quan và tiềm năng mở rộng

Kết quả khảo sát hiệu quả phòng trừ bệnh thán thư của chủng Bacillus amyloliquefaciens VL4.6 ở điều kiện ngoài đồng cho thấy tiềm năng ứng dụng rộng rãi của vi khuẩn đối kháng trong sản xuất dưa leo. Theo nghiên cứu, kết hợp tưới vào đất ở thời điểm 7 NSKG và phun lên lá dưa leo 1 NSCB với huyền phù mật số 108 tế bào/mL của vi khuẩn B.6 giúp giảm bệnh thán thư trên dưa leo tương đương với thuốc hóa học trong điều kiện ngoài đồng. Mở ra hướng đi mới trong việc sản xuất dưa leo an toàn và bền vững.

4.3. Các phương pháp ứng dụng vi khuẩn đối kháng trên cây dưa leo

Có nhiều phương pháp ứng dụng vi khuẩn đối kháng trên cây dưa leo, bao gồm xử lý hạt giống, tưới vào đất, và phun lên lá. Mỗi phương pháp đều có ưu điểm và nhược điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp phù hợp sẽ phụ thuộc vào điều kiện cụ thể và mục tiêu của người sản xuất. Việc tối ưu hóa phương pháp ứng dụng vi khuẩn đối kháng sẽ giúp nâng cao hiệu quả phòng trị bệnh và giảm chi phí sản xuất.

V. Định Danh Phân Loại Vi Khuẩn Bacillus Amyloliquefaciens VL4

Một trong những chủng vi khuẩn đối kháng có hiệu quả cao nhất trong nghiên cứu được định danh là Bacillus amyloliquefaciens VL4.6. Việc định danh này được thực hiện dựa trên các kỹ thuật vi sinh, sinh hóa và giải trình tự vùng gen 16S rRNA. Bacillus amyloliquefaciens là một loài vi khuẩn Gram dương, có khả năng sinh nhiều enzyme và chất kháng sinh, và được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp để kiểm soát các bệnh hại cây trồng.

5.1. Đặc điểm sinh học và sinh hóa của Bacillus amyloliquefaciens

Bacillus amyloliquefaciens là một loài vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có khả năng tạo bào tử, giúp chúng tồn tại trong điều kiện môi trường khắc nghiệt. Chúng có khả năng sinh nhiều enzyme như amylase, protease, cellulase, và chitinase, giúp chúng phân hủy các chất hữu cơ phức tạp và ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác. Bacillus amyloliquefaciens cũng có khả năng sản sinh các chất kháng sinh như bacilysin, fengycin, và surfactin, có tác dụng ức chế sự phát triển của nấm bệnh và vi khuẩn gây hại.

5.2. Ứng dụng của Bacillus amyloliquefaciens trong nông nghiệp và các lĩnh vực khác

Bacillus amyloliquefaciens được ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp như một tác nhân kiểm soát sinh học, phân bón sinh học, và chất kích thích sinh trưởng. Chúng có khả năng kiểm soát nhiều loại bệnh hại cây trồng do nấm và vi khuẩn gây ra, và có thể cải thiện khả năng hấp thụ dinh dưỡng của cây trồng. Ngoài ra, Bacillus amyloliquefaciens còn được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, sản xuất enzyme, và xử lý chất thải.

VI. Kết Luận Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Bệnh Thán Thư

Nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng to lớn của vi khuẩn đối kháng, đặc biệt là Bacillus amyloliquefaciens, trong việc phòng trị bệnh thán thư trên dưa leo. Việc ứng dụng vi khuẩn đối kháng không chỉ giúp giảm thiểu việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học, mà còn góp phần vào việc xây dựng hệ thống sản xuất dưa leo an toàn, bền vững và thân thiện với môi trường. Nghiên cứu cần tiếp tục được mở rộng để đánh giá hiệu quả của vi khuẩn đối kháng trên các giống dưa leo khác nhau, trong các điều kiện môi trường khác nhau, và để tìm ra các phương pháp ứng dụng tối ưu.

6.1. Tổng kết các kết quả nghiên cứu chính và ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu đã xác định được nhiều chủng vi khuẩn đối kháng có khả năng ức chế nấm Colletotrichum spp., tác nhân gây bệnh thán thư trên dưa leo. Nghiên cứu cũng đã chứng minh hiệu quả của việc ứng dụng vi khuẩn đối kháng trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng ruộng. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa khoa học quan trọng trong việc tìm kiếm các giải pháp thay thế an toàn và bền vững cho thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong sản xuất dưa leo.

6.2. Các hướng nghiên cứu tiếp theo và khuyến nghị cho sản xuất

Các hướng nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc đánh giá hiệu quả của vi khuẩn đối kháng trên các giống dưa leo khác nhau, trong các điều kiện môi trường khác nhau. Cần nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của vi khuẩn đối kháng, và tìm ra các phương pháp ứng dụng tối ưu. Ngoài ra, cần có các nghiên cứu về tính an toàn của vi khuẩn đối kháng đối với môi trường và sức khỏe con người. Khuyến nghị cho sản xuất là cần khuyến khích người nông dân sử dụng vi khuẩn đối kháng để phòng trị bệnh thán thư trên dưa leo, và kết hợp vi khuẩn đối kháng với các biện pháp canh tác bền vững khác để xây dựng hệ thống sản xuất dưa leo an toàn và hiệu quả.