Tổng quan luận án
Luận án tiến sĩ chuyên ngành Vật lý kỹ thuật (mã số: 9520401) của nghiên cứu sinh Đỗ Thị Ngọc Trâm, được thực hiện tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Trương Thị Ngọc Liên và GS. Patrick Wagner (Đại học KU Leuven, Vương quốc Bỉ), mang tiêu đề: "Nghiên cứu và chế tạo cảm biến sinh học điện hóa độ nhạy cao sử dụng điện cực in các bon ứng dụng trong chẩn đoán bệnh sớm".
Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu
Theo số liệu thống kê của Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC), trên thế giới có khoảng 23 triệu người sống chung với bệnh ung thư, mỗi năm ghi nhận hơn 14 triệu ca mắc mới và 8,2 triệu ca tử vong. Tại Việt Nam, số lượng ca mắc mới tăng từ 68.000 ca vào năm 2000 lên 126.000 ca vào năm 2010 và tiếp tục gia tăng; Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) xếp Việt Nam ở vị trí 78/172 quốc gia và vùng lãnh thổ với tỷ lệ tử vong 110/100.000 người. Phần lớn người bệnh đến khám ở giai đoạn muộn hoặc khi tế bào ung thư đã di căn, dẫn đến chi phí điều trị tốn kém và tỷ lệ hồi phục thấp.
Các phương pháp chẩn đoán lâm sàng truyền thống tại bệnh viện (siêu âm, chụp cộng hưởng từ, sinh thiết) phụ thuộc nhiều vào kích thước khối u, chỉ nhận diện được khi bệnh đã phát triển. Các kỹ thuật phân tích hóa sinh và sinh học phân tử hiện hành (ELISA, PCR, miễn dịch phóng xạ RIA, phổ huỳnh quang, phổ khối, sắc ký) đạt độ chính xác cao nhưng đòi hỏi thời gian phân tích kéo dài, chi phí hóa chất lớn, thiết bị phức tạp và chỉ phân tích đơn lẻ từng mẫu.
Khoảng trống nghiên cứu được xác định là nhu cầu phát triển các hệ cảm biến sinh học điện hóa có cấu trúc đơn giản, chi phí thấp, độ nhạy và độ chọn lọc cao, tiêu hao ít mẫu phân tích (cỡ vài microlit), thời gian đo nhanh và có khả năng tích hợp trong các thiết bị đo cầm tay phục vụ xét nghiệm tại chỗ (Point-of-Care Testing - POCT).
Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định cụ thể theo ba nội dung:
- Nghiên cứu cảm biến sinh học phổ tổng trở điện hóa sử dụng đầu thu sinh học (kháng thể, aptamer, enzyme) trên cơ sở điện cực in lưới thương mại với chi phí thấp hướng đến ứng dụng thực tế trong các thiết bị cầm tay.
- Cải tiến và phát triển các kỹ thuật biến tính bề mặt điện cực mực in các bon nhằm nâng cao hiệu suất cố định đầu thu sinh học cũng như tăng cường đáp ứng tín hiệu đối với cảm biến phổ tổng trở điện hóa.
- Chế tạo cảm biến sinh học điện hóa có độ nhạy và độ chọn lọc cao phát hiện chỉ dấu khối u (bao gồm kháng nguyên α-hCG, PSA, AFP) ứng dụng trong chẩn đoán sớm một số bệnh ung thư; cảm biến điện hóa enzyme xác định glucose trong máu.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu:
- Các chỉ dấu khối u phục vụ chẩn đoán ung thư bao gồm: kháng nguyên α-hCG (chỉ dấu u tế bào mầm tinh), PSA (chỉ dấu ung thư tiền liệt tuyến), AFP (chỉ dấu ung thư gan nguyên phát) và chỉ dấu sinh học glucose liên quan đến bệnh đái tháo đường.
- Các giải pháp vật liệu và kỹ thuật biến tính bề mặt điện cực in lưới màng dày mực in các bon (SPCE) và điện cực in lưới màng dày mực in vàng (SPAuE).
- Phạm vi nghiên cứu:
- Khảo sát thực nghiệm quy mô phòng thí nghiệm từ năm 2013 đến năm 2018 tại Bộ môn Vật liệu Điện tử (Trường Đại học Bách khoa Hà Nội), phối hợp với Đại học KU Leuven (Bỉ), Đại học Yamanashi (Nhật Bản), Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Viện Hóa học và Viện Công nghệ Sinh học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam).
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Các hướng nghiên cứu trước trong tài liệu tham khảo
Trong phần tổng quan tài liệu, tác giả hệ thống hóa các hướng phát triển chính của cảm biến sinh học:
- Phân loại cảm biến sinh học theo cơ chế chuyển đổi tín hiệu: Dữ liệu thống kê giai đoạn 2000–2018 trên hệ thống ScienceDirect cho thấy cảm biến sinh học điện hóa chiếm tỷ lệ công bố cao nhất (48%), tiếp theo là quang học (45%), áp điện (6%) và nhiệt (1%).
- Cảm biến điện hóa đo dòng (Amperometric): Phân tích các mô hình cảm biến miễn dịch cấu trúc sandwich sử dụng chất đánh dấu enzyme như HRP, ALP, GOx hoặc các chất xúc tác kim loại nano (Au, Ag, hạt lượng tử PbS, CdS). Các tác giả trước đây đã sử dụng hệ cơ chất $H_2O_2$, hỗn hợp $H_2O_2$ và hydroquinone ($H_2Q$), hoặc $H_2O_2$ kết hợp 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) để đo dòng khử.
- Cảm biến điện hóa đo điện thế (Potentiometric) và đo độ dẫn (Conductometric): Tổng quan các công trình nghiên cứu sử dụng điện cực chọn lọc ion (ISE), transistor hiệu ứng trường nhạy ion (ISFET), cảm biến điện thế chiếu sáng vùng (LAPS), và cấu trúc dây nano polymer dẫn điện poly(EDOT-co-EDOT-COOH).
- Cảm biến điện hóa đo phổ tổng trở (Impedimetric - EIS): Khảo sát các cấu trúc cảm biến không sử dụng chất đánh dấu (label-free), ghi nhận sự thay đổi điện trở truyền điện tích ($R_{ct}$) tại mặt phân giới điện cực/dung dịch thông qua cặp chất ôxy hóa - khử $[Fe(CN)_6]^{3-/4-}$.
- Kỹ thuật biến tính bề mặt điện cực bằng vật liệu nano: Luận án điểm lại các công trình tiêu biểu như:
- Biến tính điện cực vàng bằng hạt nano vàng kết hợp màng SAM cysteamine, chất liên kết trung gian p-phenyldiisothiocyanate (PDITC) và protein G để phát hiện EGFR.
- Sử dụng hạt nano vàng trên nền poly(2,6-pyridinediamine) trên điện cực GCE phát hiện chỉ dấu PSA.
- Sử dụng tổ hợp vật liệu AuNPs - Graphene - Silica sol-gel trên điện cực ITO để phát hiện IL-6.
- Sử dụng tổ hợp AuNPs - PDA - Thi - GO trên điện cực GCE để phát hiện AFP.
- Ứng dụng ống nano các bon đa tường (MWCNT) và đơn tường (SWCNT) định hướng cố định aptamer để phát hiện Mucine và protein đích.
Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết
Mặc dù các nghiên cứu trước đã đạt được độ nhạy nhất định, đa số vẫn sử dụng điện cực các bon thủy tinh (GCE) đòi hỏi mài bóng phức tạp, hoặc điện cực vàng màng mỏng/in lưới (SPAuE) có giá thành cao. Luận án lựa chọn giải quyết bài toán thay thế điện cực kim loại quý bằng điện cực in lưới mực in các bon (SPCE) thương mại giá rẻ; đồng thời giải quyết vấn đề tăng cường diện tích hiệu dụng, kiểm soát định hướng phân tử sinh học và nâng cao độ nhạy thông qua các hệ vật liệu lai nano hữu cơ - vô cơ mới được chế tạo trực tiếp bằng phương pháp điện hóa.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Cơ sở lý thuyết và khung phân tích
- Cơ chế tương tác sinh học:
- Tương tác kháng nguyên - kháng thể: Cơ chế nhận diện đặc hiệu giữa vùng epitope của kháng nguyên và paratope của kháng thể (đoạn Fab) với hằng số liên kết $K_a \approx 10^{15}\text{ M}^{-1}$. Các dạng định hướng cố định của kháng thể gồm: "end-on" (gắn ở đuôi Fc, tối ưu hóa khả năng liên kết), "head-on", "side-on" và "lying-on".
- Đầu thu aptamer: Đoạn oligonucleotide DNA/RNA sợi đơn (kích thước $< 100\text{ mer}$) được sàng lọc qua công nghệ SELEX, có khả năng cuộn gập tạo cấu trúc không gian ba chiều liên kết đặc hiệu với phân tử đích.
- Xúc tác enzyme: Phản ứng chuyển hóa cơ chất của Glucose Oxidase (GOx) với trung tâm hoạt động flavin adenine dinucleotide (FAD), kết hợp chất truyền điện tử polymer chứa phức chất ôxy hóa khử Osmium.
- Lý thuyết phổ tổng trở điện hóa (EIS) và mô hình Randles:
- Tổng trở của hệ được biểu diễn trong mặt phẳng phức Nyquist ($Z'$ so với $-Z''$).
- Mô hình mạch tương đương Randles chuẩn bao gồm: điện trở dung dịch ($R_s$), điện trở truyền điện tích ($R_{ct}$ hoặc $R_p$), điện dung lớp kép ($C_{dl}$ hoặc phần tử pha không đổi $CPE$) và tổng trở khuếch tán Warburg ($Z_w$). Sự hình thành phức hợp miễn dịch hoặc liên kết aptamer - kháng nguyên làm cản trở quá trình chuyển điện tích của ion $[Fe(CN)6]^{3-/4-}$, dẫn đến sự gia tăng giá trị $\Delta R{ct}$.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
Luận án sử dụng phương pháp thực nghiệm định lượng kết hợp phân tích cấu trúc vật lý:
- Phương pháp điện hóa:
- Kỹ thuật quét thế tuần hoàn (Cyclic Voltammetry - CV): Sử dụng để tổng hợp hạt nano vàng (AuNPs), đồng trùng hợp polymer dẫn, khử điện hóa graphene oxide (GO) thành erGO, và khảo sát tính chất dòng - thế của cảm biến.
- Kỹ thuật phổ tổng trở điện hóa (EIS): Sử dụng thiết bị AutoLab PGSTAT 12 và Vertex Ivium; dải tần quét từ $100\text{ kHz}$ đến $50\text{ mHz}$, biên độ điện áp xoay chiều $E_{ac} = 10\text{ mV}$, điện áp phân cực một chiều $E_{dc} = 0,16\text{ V}$ (so với Ag/AgCl). Dung dịch đo tiêu chuẩn gồm $5\text{ mM } [Fe(CN)_6]^{3-/4-}$ pha trong $0,1\text{ M KCl}$.
- Phương pháp phân tích hình thái và cấu trúc vật liệu:
- Kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FE-SEM): Đánh giá hình thái bề mặt, mật độ và kích thước hạt nano vàng, lớp màng polymer và graphene.
- Phổ tán xạ năng lượng tia X (EDS): Phân tích thành phần nguyên tố trên bề mặt điện cực.
- Phổ tán xạ Raman: Sử dụng nguồn kích thích bước sóng $632,8\text{ nm}$ để xác định các dao động liên kết hóa học đặc trưng của màng PPy-PPa, GO, erGO và poly(p-ATP).
- Kỹ thuật vi cân tinh thể thạch anh (QCM):
- Sử dụng linh kiện thạch anh AT-cut $5\text{ MHz}$ kết nối bộ dao động QCM25 (Stanford Research Systems) để theo dõi động học dịch chuyển tần số ($\Delta f$), định lượng khối lượng phân tử cố định qua phương trình Sauerbrey.
- Công nghệ vi lưu ly tâm (Centrifugal Microfluidics):
- Thiết kế chíp vi lưu với độ rộng vi kênh xấp xỉ $200\text{ }\mu\text{m}$, vận hành trên hệ giá đỡ quay ly tâm với tốc độ $1200\text{ vòng/phút}$, tích hợp trực tiếp 4 cụm chíp - điện cực in lưới.
Nguồn vật liệu và hóa chất
- Điện cực in lưới thương mại: SPCE (mực in các bon) và SPAuE (mực in vàng) từ BioDevice Technology (Nhật Bản) và Dropsens (Tây Ban Nha).
- Hóa chất tổng hợp và chức năng hóa: $HAuCl_4$, pyrrole (Py), pyrrole-2-carboxylic acid (Pa), para-aminothiophenol (p-ATP), graphene oxide (GO), axit 16-mercaptohexadecanoic (MHDA), 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS), polymer ôxy hóa - khử Osmium.
- Mẫu sinh học: Kháng thể đơn dòng (mAb) và kháng nguyên chuẩn α-hCG, PSA, AFP, DNA aptamer đặc hiệu PSA, enzyme GOx, albumin huyết thanh bò (BSA), cùng các mẫu huyết thanh thực tế.
Nội dung chính theo từng chương
CHƯƠNG 1. CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN BỆNH SỚM
Chương 1 tổng thuật các kiến thức cơ sở về cảm biến sinh học, cấu trúc và phân loại đầu thu sinh học (kháng thể, enzyme, axít nucleic, aptamer, tế bào, MIP), các bộ phận chuyển đổi tín hiệu (điện hóa, quang học, áp điện, nhiệt). Tác giả trình bày chi tiết về các phương pháp cố định phân tử sinh học (hấp phụ vật lý, liên kết cộng hóa trị, ái lực sinh học, liên kết chéo, bẫy, hóa rắn), phân tích ưu và nhược điểm của từng kỹ thuật gắn kết qua các nhóm chức $-NH_2$, $-COOH$, $-SH$, $-CHO$.
Chương này phân tích bệnh học và nồng độ ngưỡng lâm sàng của ba chỉ dấu khối u:
- $\alpha$-hCG: Chỉ dấu của ung thư tế bào mầm tinh và u tế bào nuôi.
- PSA: Kháng nguyên đặc hiệu tuyến tiền liệt, nồng độ ngưỡng cảnh báo nguy cơ ung thư tiền liệt tuyến trong huyết thanh là $4\text{ ng/mL}$.
- AFP: Alpha-fetoprotein, chỉ dấu quan trọng trong sàng lọc và chẩn đoán ung thư gan nguyên phát (ngưỡng thông thường $10 - 20\text{ ng/mL}$).
Từ việc đánh giá thực trạng nghiên cứu trong và ngoài nước, tác giả xác định mục tiêu và lộ trình thực nghiệm của đề tài.
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chương 2 mô tả chi tiết quy trình công nghệ chế tạo, bao gồm:
- Quy trình tổng hợp hạt nano vàng (AuNPs) trên điện cực SPCE bằng phương pháp quét thế tuần hoàn CV trong dung dịch $1\text{ mM } HAuCl_4 + 100\text{ mM PBS}$ tại tốc độ quét $50\text{ mV/s}$ (dải điện áp từ $-0,6\text{ V}$ đến $0,5\text{ V}$).
- Kỹ thuật tạo màng đơn lớp tự lắp ghép SAM (MHDA hoặc p-ATP) và quy trình hoạt hóa liên kết cộng hóa trị thông qua EDC/NHS.
- Tổng hợp các hệ vật liệu polymer và vật liệu lai: Đồng trùng hợp PPy-PPa; khử điện hóa GO thành erGO trong đệm PBS pH 6,6 qua 30 chu kỳ quét thế; tổng hợp vật liệu lai nano hai chiều PPy-PPa/erGO; trùng hợp điện hóa màng poly(p-ATP) kết hợp AuNPs.
- Thiết kế hệ thống vi lưu ly tâm và thiết lập các phép đo điện hóa, quy hoạch dữ liệu thực nghiệm để tính toán độ nhạy, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, giới hạn phát hiện (LOD = $3\sigma/S$) và độ chọn lọc.
CHƯƠNG 3. CẢM BIẾN MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN CHỈ DẤU α-hCG ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN U TẾ BÀO MẦM TINH
Chương 3 tập trung nghiên cứu chế tạo cảm biến phát hiện chỉ dấu $\alpha$-hCG:
- Cảm biến nhạy khối lượng mAb $\alpha$-hCG/SAM(MHDA)/QCM: Đánh giá hiệu suất cố định kháng thể qua độ dịch tần số dao động ($\Delta f$). Kết quả đo cho thấy tần số giảm dần theo thời gian khi tiếp xúc với nồng độ kháng nguyên $\alpha$-hCG từ $100\text{ pg/mL}$ đến $27\text{ ng/mL}$.
- Cảm biến phổ tổng trở mAb $\alpha$-hCG/SAM(MHDA)/SPAuE: Kháng thể đơn dòng được cố định trên điện cực in lưới vàng thông qua màng SAM(MHDA) được hoạt hóa bởi EDC/NHS. Phổ tổng trở Faradaic ghi nhận giá trị $R_{ct}$ tăng đều đặn theo sự gia tăng nồng độ $\alpha$-hCG trong dải từ $0$ đến $100\text{ ng/mL}$.
- Thông số kỹ thuật đạt được: Cảm biến có khoảng tuyến tính từ $4\text{ ng/mL}$ đến $100\text{ ng/mL}$, giới hạn phát hiện (LOD) đạt $9,35\text{ ng/mL}$, đáp ứng yêu cầu chẩn đoán lâm sàng u tế bào mầm tinh.
CHƯƠNG 4. CẢM BIẾN APTAMER PHÁT HIỆN CHỈ DẤU PSA ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN UNG THƯ TIỀN LIỆT TUYẾN
Chương 4 thực hiện chế tạo cảm biến phổ tổng trở sử dụng đầu thu aptamer trên điện cực SPAuE và điện cực SPCE biến tính hạt nano vàng (AuNPs-SPCE):
- Khảo sát quá trình lắng đọng AuNPs trên SPCE qua số chu kỳ quét thế CV (5, 10, 15, 20 chu kỳ). Kết quả ảnh FE-SEM và phổ EDS xác định 20 chu kỳ quét tạo ra mật độ hạt AuNPs kích thước $10 - 20\text{ nm}$ đồng đều nhất.
- Khảo sát nồng độ cố định aptamer ($5, 10, 25, 50, 100\text{ }\mu\text{g/mL}$).
- Cảm biến PSA-aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE thể hiện độ tuyến tính cao trong dải nồng độ PSA từ $2\text{ ng/mL}$ đến $10\text{ ng/mL}$ (bao phủ ngưỡng bệnh lý $4\text{ ng/mL}$).
- Thử nghiệm độ chọn lọc cho thấy cảm biến không xuất hiện đáp ứng chéo đáng kể đối với các protein gây nhiễu như hCG, protein TAU và amylin.
CHƯƠNG 5. CẢM BIẾN MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN CHỈ DẤU AFP ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN UNG THƯ GAN
Chương 5 phát triển và so sánh 4 cấu trúc biến tính bề mặt điện cực SPCE nhằm nâng cao hiệu năng bắt cặp kháng thể mAb AFP:
- mAb AFP/PPy-PPa/SPCE: Tối ưu hóa tỷ lệ nồng độ monome pyrrole ($120\text{ mM}$) và pyrrole-2-carboxylic acid ($40\text{ mM}$) trong PBS $10\text{ mM}$ (pH 7,4, chứa $100\text{ mM KCl}$), quét 20 chu kỳ CV từ $-0,8\text{ V}$ đến $0,8\text{ V}$.
- mAb AFP/PPy-PPa/erGO-SPCE: Điện cực được phủ lớp erGO qua 30 chu kỳ CV trước khi đồng trùng hợp PPy-PPa, tạo cấu trúc lai nano 2D làm tăng diện tích tiếp xúc và độ dẫn điện.
- mAb AFP/SAM(p-ATP)/AuNPs-SPCE: Khảo sát ảnh hưởng của số chu kỳ quét AuNPs (10, 20, 40, 60) và thời gian tự lắp ghép màng SAM(p-ATP) ($6, 12, 18, 24\text{ giờ}$). Kháng thể được gắn qua nhóm $-COOH$ của đoạn Fc với nhóm $-NH_2$ của p-ATP.
- mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE: Trùng hợp điện hóa màng poly(p-ATP) trực tiếp trên nền AuNPs-SPCE.
Cả 4 cấu trúc cảm biến đều đạt dải làm việc tuyến tính từ $1\text{ ng/mL}$ đến $100\text{ ng/mL}$ đối với kháng nguyên AFP.
CHƯƠNG 6. CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA GLUCOSE
Chương 6 trình bày kết quả chế tạo cảm biến đo dòng enzyme thế hệ thứ 2:
- Cấu trúc đa lớp $(GOx/\text{Osmium})_n$ được tạo màng trên điện cực AuNPs-SPCE với số lớp khảo sát từ 1 đến 6.
- Kết quả tối ưu xác định cấu trúc 4 lớp $(GOx/\text{Osmium})_4/\text{AuNPs-SPCE}$ cho mật độ dòng đáp ứng cao và ổn định nhất.
- Cảm biến vận hành tại điện thế thấp $-0,02\text{ V}$ (so với Ag/AgCl), giúp loại bỏ ảnh hưởng của các chất ôxy hóa - khử nội sinh trong máu. Dải đo tuyến tính đạt từ $0$ đến $10\text{ mM}$ glucose với hệ số tương quan $R^2 = 0,99$.
Bảng tổng hợp các hệ cảm biến sinh học được phát triển trong luận án
| Hệ cảm biến |
Điện cực nền / Vật liệu biến tính |
Đầu thu sinh học |
Phương pháp đo |
Dải tuyến tính |
Giới hạn phát hiện (LOD) / Thông số |
| Cảm biến $\alpha$-hCG |
SPAuE / SAM(MHDA) |
mAb $\alpha$-hCG |
EIS Faradaic |
$4 - 100\text{ ng/mL}$ |
$9,35\text{ ng/mL}$ |
| Cảm biến PSA |
SPCE / AuNPs ($10-20\text{ nm}$) / SAM(MHDA) |
PSA-Aptamer |
EIS Faradaic |
$2 - 10\text{ ng/mL}$ |
Phù hợp ngưỡng chẩn đoán ($4\text{ ng/mL}$) |
| Cảm biến AFP (1) |
SPCE / PPy-PPa |
mAb AFP |
EIS Faradaic & CV |
$1 - 100\text{ ng/mL}$ |
Khảo sát theo tỷ lệ Py:Pa |
| Cảm biến AFP (2) |
SPCE / erGO / PPy-PPa |
mAb AFP |
EIS Faradaic & CV |
$1 - 100\text{ ng/mL}$ |
Cấu trúc lai nano 2D |
| Cảm biến AFP (3) |
SPCE / AuNPs / SAM(p-ATP) |
mAb AFP |
EIS Faradaic |
$1 - 100\text{ ng/mL}$ |
Tối ưu hóa thời gian SAM |
| Cảm biến AFP (4) |
SPCE / AuNPs / poly(p-ATP) |
mAb AFP |
EIS Faradaic |
$1 - 100\text{ ng/mL}$ |
Trùng hợp điện hóa trực tiếp |
| Cảm biến Glucose |
SPCE / AuNPs / $(\text{GOx/Osmium})_4$ |
Enzyme GOx |
Đo dòng Amperometry |
$0 - 10\text{ mM}$ |
Điện thế làm việc $-0,02\text{ V}$; $R^2 = 0,99$ |
Kết quả và những đóng góp mới
Đóng góp về mặt lý luận và công nghệ
- Làm sáng tỏ cơ chế tín hiệu tổng trở: Luận án giải thích cơ chế biến đổi tổng trở Faradaic khi sử dụng đầu thu sinh học tự nhiên (kháng thể) và đầu thu bán tổng hợp (aptamer) trên nền điện cực biến tính hạt nano kim loại và polymer dẫn.
- Công nghệ tổng hợp AuNPs trên nền SPCE: Xây dựng thành công quy trình điện hóa tạo hạt nano vàng kích thước $10 - 20\text{ nm}$ phân tán đồng đều trên điện cực mực in các bon thương mại, thay thế hoàn toàn điện cực in lưới vàng đắt tiền nhưng vẫn duy trì độ nhạy phân tích.
- Phát triển ba hệ vật liệu biến tính bề mặt mới trên SPCE:
- Polymer dẫn đồng trùng hợp polypyrrole - pyrrole-2-carboxylic acid (PPy-PPa).
- Vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều giữa polymer PPy-PPa và graphene oxide dạng khử điện hóa (erGO).
- Vật liệu lai giữa poly(para-aminothiophenol) và hạt nano vàng.
- Ứng dụng thành công aptamer và polymer redox Osmium: Ứng dụng aptamer nhận diện PSA không cần điều kiện bảo quản nghiêm ngặt; ứng dụng cấu trúc đa lớp $(GOx/\text{Osmium})_4$ vận hành ở thế thấp ($-0,02\text{ V}$), hạn chế nhiễu nền sinh học.
- Quy trình chế tạo 06 hệ cảm biến hoàn chỉnh: Xây dựng quy trình chế tạo 06 loại cảm biến điện hóa quy mô phòng thí nghiệm đáp ứng các ngưỡng nồng độ phát hiện sớm bệnh ung thư và tiểu đường.
Kiến nghị và giải pháp đề xuất
- Đề xuất tích hợp các điện cực in lưới đã chức năng hóa vào hệ thống vi lưu ly tâm (Centrifugal Microfluidic Lab-on-a-Disc) nhằm tự động hóa hoàn toàn chu trình nạp mẫu, phản ứng và rửa giải với thể tích mẫu nhỏ ($3\text{ }\mu\text{L}$), thời gian phân tích rút ngắn xuống dưới 30 phút.
- Định hướng chuyển giao quy trình biến tính điện cực in lưới sang dạng kit thử nghiệm tương thích với các máy đo điện hóa cầm tay.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của nghiên cứu
- Các khảo sát thực nghiệm trong luận án chủ yếu được thực hiện trong môi trường dung dịch đệm chuẩn và mẫu huyết thanh nhân tạo hoặc mẫu máu quy mô phòng thí nghiệm, chưa tiến hành thử nghiệm lâm sàng diện rộng trên số lượng lớn bệnh nhân thực tế.
- Hệ thống vi lưu ly tâm mới dừng ở mức độ tích hợp thử nghiệm cơ chế vận chuyển dòng chất lỏng, chưa hoàn thiện thành module thương mại khép kín hoàn toàn.
- Cảm biến đo glucose thế hệ 2 mới dừng lại ở kết quả bước đầu trong việc đánh giá hoạt tính của enzyme GOx trong mạng polymer Osmium.
Hướng nghiên cứu tiếp theo
- Hoàn thiện việc thử nghiệm cảm biến trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng phức tạp từ bệnh viện để đánh giá toàn diện độ thu hồi và độ trôi tín hiệu.
- Mở rộng ứng dụng nền tảng vật liệu lai nano đã phát triển để cố định các loại aptamer và kháng thể khác nhằm phát hiện đồng thời nhiều chỉ dấu khối u trên cùng một vi điện cực đa kênh.
- Nghiên cứu tối ưu hóa độ bền bảo quản lâu dài của các điện cực đã biến tính màng sinh học.
Giá trị tham khảo
Luận án là tài liệu tham khảo chuyên môn cho các đối tượng và định hướng nghiên cứu sau:
- Nghiên cứu sinh và học viên chuyên ngành: Vật lý kỹ thuật, Khoa học vật liệu, Hóa học phân tích, Kỹ thuật y sinh và Công nghệ sinh học; đặc biệt là phương pháp phân tích phổ tổng trở điện hóa (EIS) khớp mạch tương đương Randles và phương pháp quét thế CV.
- Giảng viên và nhà nghiên cứu: Tham khảo quy trình công nghệ chế tạo vật liệu lai nano (erGO/PPy-PPa, AuNPs/poly(p-ATP)) và kỹ thuật chức năng hóa bề mặt điện cực thông qua liên kết cộng hóa trị EDC/NHS.
- Kỹ sư phát triển thiết bị y tế: Tham khảo giải pháp thiết kế hệ vi lưu ly tâm tích hợp điện cực in lưới giá rẻ nhằm chế tạo các thiết bị xét nghiệm tại chỗ (POCT) chẩn đoán bệnh sớm.
Câu hỏi thường gặp
1. Cảm biến aptamer phát hiện chỉ dấu PSA trong luận án có cấu trúc như thế nào và đạt được khoảng tuyến tính bao nhiêu?
Cảm biến có cấu trúc PSA-aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE, được chế tạo bằng cách tạo màng hạt nano vàng ($10 - 20\text{ nm}$) trên điện cực mực in các bon qua 20 chu kỳ quét CV, sau đó tạo màng SAM(MHDA) để gắn liên kết cộng hóa trị với đoạn aptamer đặc hiệu PSA. Cảm biến đạt khoảng làm việc tuyến tính trong dải nồng độ PSA từ $2\text{ ng/mL}$ đến $10\text{ ng/mL}$, bao phủ nồng độ ngưỡng bệnh lý ung thư tiền liệt tuyến ($4\text{ ng/mL}$).
2. Luận án đã phát triển những hệ vật liệu biến tính bề mặt nào trên điện cực SPCE để phát hiện chỉ dấu AFP?
Luận án đã nghiên cứu và so sánh 4 hệ vật liệu biến tính trên SPCE gồm:
- Polymer đồng trùng hợp PPy-PPa.
- Vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều PPy-PPa/erGO.
- Màng đơn lớp tự lắp ghép SAM(p-ATP) trên lớp hạt AuNPs.
- Vật liệu lai poly(p-ATP) và hạt nano vàng.
Cả 4 cấu trúc đều cho khoảng đo tuyến tính từ $1\text{ ng/mL}$ đến $100\text{ ng/mL}$ đối với kháng nguyên AFP.
3. Giới hạn phát hiện (LOD) và khoảng làm việc tuyến tính của cảm biến miễn dịch $\alpha$-hCG là bao nhiêu?
Cảm biến miễn dịch phổ tổng trở mAb $\alpha$-hCG/SAM(MHDA)/SPAuE có khoảng làm việc tuyến tính từ $4\text{ ng/mL}$ đến $100\text{ ng/mL}$ và giới hạn phát hiện đạt được là $9,35\text{ ng/mL}$, đáp ứng yêu cầu phát hiện chỉ dấu $\alpha$-hCG phục vụ chẩn đoán sớm u tế bào mầm tinh.
4. Cảm biến điện hóa đo glucose thế hệ thứ 2 có đặc điểm kỹ thuật gì nổi bật?
Cảm biến sử dụng cấu trúc đa lớp $(GOx/\text{Osmium})_4$ chế tạo trên điện cực AuNPs-SPCE. Cảm biến vận hành ở điện áp thấp $-0,02\text{ V}$ (so với Ag/AgCl), giúp loại bỏ các tín hiệu can thiệp không đặc hiệu từ các chất ôxy hóa - khử trong máu, đạt dải đo tuyến tính từ $0$ đến $10\text{ mM}$ với hệ số tương quan $R^2 = 0,99$.
5. Thông số kỹ thuật chính của hệ thống vi lưu ly tâm được tích hợp trong luận án là gì?
Hệ thống vi lưu ly tâm được thiết kế với kích thước vi kênh dẫn rộng khoảng $200\text{ }\mu\text{m}$, vận hành trên giá đỡ gắn trục quay với tốc độ ly tâm $1200\text{ vòng/phút}$, cho phép tích hợp đồng thời 4 cụm chíp - điện cực để dẫn truyền mẫu thể tích nhỏ ($3\text{ }\mu\text{L}$) và rút ngắn thời gian phân tích xuống khoảng 30 phút.
Kết luận
Luận án tiến sĩ của tác giả Đỗ Thị Ngọc Trâm đã nghiên cứu và phát triển thành công 06 hệ cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở điện cực in lưới màng dày, phục vụ phát hiện các chỉ dấu khối u ($\alpha$-hCG, PSA, AFP) và glucose. Bằng việc kết hợp các phương pháp điện hóa hiện đại với các hệ vật liệu lai nano tiên tiến (AuNPs, erGO, PPy-PPa, poly(p-ATP), polymer Osmium), công trình đã giải quyết bài toán nâng cao độ nhạy, tính chọn lọc và giảm chi phí sản xuất cảm biến. Các kết quả thực nghiệm đạt được đã chứng minh tính khả thi của việc ứng dụng điện cực in lưới các bon kết hợp công nghệ vi lưu ly tâm hướng tới phát triển các thiết bị xét nghiệm tại chỗ trong chẩn đoán y sinh.
