ĐẶT VẤN ĐỀ Cải thiện sinh trưởng (năng suất) cây rừng là một mục tiêu chọn giống quan trọng trong nhiều chương trình nghiên cứu lâm nghiệp, tuy nhiên năng suất có hệ số di truyền thấp. Năng suất là một tính trạng số lượng phức tạp thể hiện qua các thông số đường kính và chiều cao, về cơ bản nó là tổng hợp của nhiều tính trạng khác nhau, ảnh hưởng lớn bởi các yếu tố môi trường. Sự khác biệt về năng suất không phải do sự phân li của một hoặc hai gen mà là do sự phân li của rất nhiều gen, với ảnh hưởng của mỗi gen là nhỏ. Tính trạng số lượng không phân li thành các nhóm cụ thể, do đó ta không thể đơn giản chỉ sử dụng các nguyên lí di truyền Mendel để nghiên cứu.
Các nghiên cứu về chọn giống cây trồng lâm nghiệp trong nước và quốc tế có sự trợ giúp của công nghệ sinh học đã có những thành công nhất định, như nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống bạch đàn (E. nitens) đã được Bundock và cộng sự 2008; Freeman và cộng sự 2009 cho thấy các chỉ thị SSRs, RAPDs có tương quan đến sinh trưởng về đường kính cây với mức đóng góp biến dị kiểu hình từ 3,8 đến 17,9%, ngoài ra tác giả cũng chỉ ra một số tính trạng về chất lượng như mật độ gỗ, hàm lượng xenlulô, lignin cũng đóng góp cho mức biến dị từ 5,6 - 12,3% [20] [28]. Theo Brondani và cộng sự, (2006) trên bản đồ liên kết cho loài E. grandis, trong số 172 chỉ thị có 153 (89%) chỉ thị giữ nguyên vị trí trên bản đồ chung cho Eucalyptus.
Trong khi đó trên bản đồ liên kết cho loài E. Anand Raj Kumar Kullan và cộng sự (2012) đã nghiên cứu về sự di truyền của các tính trạng tăng trưởng, tỷ trọng gỗ và biểu hiện của gen ở trong hai gia đình lai trở lại giữa loài Bạch đàn urô và Bạch đàn grandis đã xác định được 2 QTL đường kính thân và 12 QTL cho tỷ trọng gỗ. Các QTLs cho đường kính và tỷ trọng gỗ cho thấy mức đóng góp biến đổi kiểu hình là 3,1 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Như vậy cả tính trạng chất lượng lẫn số lượng ở các nghiên cứu chỉ đóng góp dưới 18% biến dị cho các tính trạng nghiên cứu.
Một gợi ý của Bala R. Thumma và cộng sự 2010 là nghiên cứu chọn giống truyền thống có sự trợ giúp của công nghệ sinh học (chỉ thị phân tử liên kết với tính trạng sinh trưởng) để tăng hiệu quả lựa chọn cho những tính trạng số lượng có di truyền thấp, như là năng suất vẫn là cách tiếp cận có hiệu quả. Đây chính là hướng đề tài“ Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử SSR trong chọn giống bạch đàn lai (E. exserta)” được đề xuất và thực hiện [41].
Luận văn này là một phần của đề tài “Nghiên cứu chọn giống bạch đàn lai bằng chỉ thị phân tử” giai đoạn 2012-2016, do TS. Nguyễn Việt Cường làm chủ nhiệm đề tài và tôi là cộng tác viên đề tài. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU A. Những nghiên cứu về chọn giống bạch đàn Các loài bạch đàn (Eucalyptus) có nguồn giống từ Australia và Indonesia đã được gây trồng rộng rãi trên thế giới và đóng vai trò hết sức quan trọng trong trồng rừng cung cấp nguyên liệu giấy, ván dăm, gỗ xây dựng và đồ nội thất.
Tổng diện tích rừng trồng bạch đàn trên thế giới đến năm 2000 là 17,9 triệu ha, tập trung chủ yếu ở các nước như Braxin, Công Gô, Trung Quốc, Ấn Độ, Nam Phi. Chỉ riêng các nước khu vực Đông Nam Á và Nam Trung Quốc (gồm có 2 tỉnh Quảng Đông và Quảng Tây), diện tích trồng rừng keo và bạch đàn lên tới khoảng 7 triệu ha (Harwood và Nambiar, 2014) [30]. Nghiên cứu chọn giống bạch đàn là một khâu quan trọng trong chiến lược cải thiện giống nhóm loài bạch đàn. Mặc dù, nhiều loài bạch đàn có biên độ sinh thái rộng nhưng khi được trồng trên nhiều quốc gia khác nhau thì bạch đàn có sự phân hóa mạnh về sinh trưởng.
Các chương trình khảo nghiệm bạch đàn ở một số quốc gia đã và đang được chú trọng như Công Gô (1970 - 1981) đã khảo nghiệm trên 100 xuất xứ của loài Bạch đàn urô. (1980) đã khảo nghiệm 10 loài tại 3 nơi khác nhau trên bán đảo Malaysia. Sau 10 năm trồng, tác giả nhận thấy sinh trưởng tốt nhất là loài Bạch đàn caman (2 xuất xứ Bắc Úc) và Bạch đàn degluta, các loài triển vọng khác là Bạch đàn brassiana, Bạch đàn urô và Bạch đàn tere [25]. Tại Nam Phi từ năm 1973 - 1974 đến năm 1980, Darrow W.
(1983) đã tiến hành 9 khảo nghiệm phối hợp của 26 xuất xứ Bạch đàn caman và 23 xuất LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4 xứ của Bạch đàn tere. Kết quả cho thấy: ở những vùng ẩm thì Bạch đàn grandis cho năng suất cao nhất, sau đó đến Bạch đàn tere, còn ở những vùng khô hạn và có sương giá thì Bạch đàn caman lại cho năng suất cao hơn. (1984) tiến hành khảo nghiệm nhiều xuất xứ khác nhau của Bạch đàn caman, Bạch đàn tere tại các vùng Pradesh, Maharastra và Haryana của Ấn Độ. Qua điều tra sinh trưởng cho thấy có 10 xuất xứ Bạch đàn caman và 5 xuất xứ Bạch đàn tere sinh trưởng tốt [34].
Ngoài ra, các năm 80 - 90 của thế kỷ XX còn có nhiều tác giả nghiên cứu về chọn loài và xuất xứ bạch đàn ở nhiều nước khác nhau như: Agpaoa A.C (1986) khảo nghiệm loài và xuất xứ bạch đàn tại Philippine. Năm 1975 Viện nghiên cứu lâm nghiệp Quảng Tây (Trung Quốc) đã lai giữa Bạch đàn saligna với Bạch đàn liễu tạo ra được một số tổ hợp lai có khả năng vượt trội hơn loài Bạch đàn liễu tới 82% về thể tích thân cây, trong đó tổ hợp lai nghịch Bạch đàn liễu x Bạch đàn saligna có sinh trưởng nhanh hơn tổ hợp lai thuận Bạch đàn saligna x Bạch đàn liễu (Shuxiong, 1989) [39]. Hiện các giống lai được trồng chủ yếu ở các vùng ven biển vì chúng có khả năng chịu gió bão tốt đồng thời sinh trưởng nhanh. Từ năm 1989 Viện lâm nghiệp nhiệt đới của Trung Quốc cũng tạo ra 204 cây lai từ các cặp bố mẹ giữa Bạch đàn urô với các loài Bạch đàn tere, Bạch đàn caman, Bạch đàn liễu, Bạch đàn grandis, Bạch đàn saligna và Bạch đàn pellita.
Trong đó một số cá thể cây lai từ các tổ hợp Bạch đàn urô x Bạch đàn tere và Bạch đàn urô x Bạch đàn caman đã có ưu thế lai rõ rệt về sinh trưởng so với bố mẹ của chúng, cây lai có thể tích vượt bố mẹ với các trị số tương ứng là 120,7% và 89,4% (Xiang & Wang, 1996; Shen, 2000) [38], [44]. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 5 Các tổ hợp lai thuận nghịch giữa Bạch đàn urô và Bạch đàn grandis cũng đã được tạo ra ở Trung Quốc (Wang ADN Yang, 1996, Rezende, G., 2000; Bouvet và Combes, 1997), ở Brazil và ở Indonesia (Hardlyanto & Tridasa, 2000) [15], [35], [42]. Hiện các giống này đang được trồng phổ biến tại Trung Quốc, năng suất các giống này gấp rưỡi các giống Bạch đàn urô thuần. Trong những năm gần đây ở các nước Đông Nam Á và Nam Trung Quốc (Quảng Tây và Quảng Đông) ngoài 3 loài keo còn có 5 loài bạch đàn (Bạch đàn grandis, Bạch đàn urô, Bạch đàn pellita, Bạch đàn globulus, Bạch đàn dunnii) và bạch đàn lai là cây trồng chủ đạo và các chương trình cải thiện giống cường độ cao cũng chỉ tiến hành với 2 nhóm loài này, với diện tích trồng rừng lên tới 7 triệu ha (Hawood & Nambiar, 2014) [30].
Kết quả nghiên cứu cho thấy việc lựa chọn các cặp bố mẹ trong lai giống có tác động nhiều đến biểu hiện của ưu thế lai, thường các cặp bố mẹ có sinh trưởng tốt cho ưu thế lai mạnh hơn các cặp bố mẹ có sinh trưởng kém. Ngoài ra các nghiên cứu cũng cho thấy ảnh hưởng của việc chọn loài để lai cũng tác động đến biểu hiện ưu thế lai, các loài có quan hệ di truyền xa nhau cho ưu thế lai mạnh hơn những loài có quan hệ gần gũi (Brawner và cộng sự, 2012) [23]. Nhìn chung, các công trình khảo nghiệm trên đều cho thấy các loài Bạch đàn urô, Bạch đàn caman, Bạch đàn liễu. có nhiều xuất xứ tốt, thích nghi cao với điều kiện hoàn cảnh gây trồng khác nhau.
Đây cũng là những loài mà đề tài sẽ chọn sử dụng làm vật liệu nghiên cứu lai giống với sự trợ giúp của chỉ thị phân tử (MAS). Giới thiệu về chỉ thị SSR và một số ứng dụng trong chọn giống 1. Giới thiệu về chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat) SSR còn được gọi là Microsatellite được Litt và Luty phát triển thành một kỹ thuật chỉ thị phân tử năm 1989 (Litt M. Microsatellite có chứa các trình tự ADN, hiện nay đã có những nghiên cứu về LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 6 vai trò chức năng của chúng trong hệ gen của cây bạch đàn.
Chỉ thị microsatellite đóng một vai trò quan trọng trong cây bạch đàn ở các cấp độ khác nhau của sự cải thiện di truyền. Các chỉ thị microsatellite có tiềm năng phân tích được sự liên quan chặt chẽ giữa các cá thể và ngày càng phát hiện được nhiều hơn nữa các SSR trên các nhóm liên kết và các nghiên cứu di truyền khác. Hiện nay, đã phát hiện được một số lượng lớn các microsatellite có mối liên hệ từ nhóm liên kết (LG) đến vị trí vật lý (Murugan Sumathi and Ramasamy Yasodha, 2014). Gần đây, 223 marker microsatellite mới đã được khảo sát về đa dạng alen và được bổ sung vào bản đồ bạch đàn SSR hiện có, nâng tổng số các lôcut SSR đến hơn 400 và giúp nâng cao việc so sánh bản đồ hệ gen (Grattapaglia et al, 1996) [27].
Sự thay đổi các alen xảy ra ở lôcut SSR là kết quả của sự thay đổi số lần lặp lại của các đơn vị. Sự khác nhau về độ dài ở lôcut SSR được phát hiện bởi sự nhân đoạn ADN nhờ PCR dùng một cặp mồi oligonucleotide có trình tự bổ sung với SSR. Kích thước của sản phẩm PCR được xác định một cách chính xác bằng điện di trên gel polyacrylamide. Sự khác nhau về độ dài có thể rất nhỏ (2bp).
SSR thích hợp cho lập bản đồ, nghiên cứu QTL và in dấu ADN (ADN fingerprinting). SSR cho thấy mức độ đa hình cao ở hầu hết các loài thực vật, thậm chí trong các kiểu gen có quan hệ gần gũi, với số lượng lớn các alen tìm thấy ở mỗi lôcut và dị hợp tử được đánh giá thường lớn hơn 0,7.