MỞ ĐẦU Một thực trạng chúng ta đang thấy hiện nay là sự lạm dụng phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật đã làm giảm khả năng chống chịu của cây trồng dẫn đến bùng nổ dịch bệnh, ảnh hƣởng không tốt đến chất lƣợng nông sản và cũng là nguyên nhân tất yếu dẫn đến thoái hóa đất canh tác. Các sản phẩm hóa học này đã để lại những tồn dƣ của chúng và đang đƣợc tích lũy trong hệ sinh thái, trở thành mối hiểm họa nghiêm trọng đe dọa sức khỏe của con ngƣời và môi trƣờng sống. Sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh vật (HCVSV) là giải pháp mà các nhà khoa học trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam đang hƣớng đến. Đất nƣớc ta có nền kinh tế nông nghiệp là chủ yếu thì việc quan tâm đến năng suất và chất lƣợng nông sản là mục tiêu hàng đầu vì không những giúp nâng cao đời sống của nông dân mà còn thúc đẩy sự phát triển nền kinh tế quốc gia.
Phân bón HCVSV (hay còn gọi là phân hữu cơ vi sinh) là sản phẩm đƣợc sản xuất từ các nguồn nguyên liệu hữu cơ khác nhau, nhằm cung cấp chất dinh dƣỡng cho cây trồng, cải tạo đất, chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống đƣợc tuyển chọn với mật độ đạt tiêu chuẩn quy định. Phân bón HCVSV góp phần nâng cao năng suất cây trồng và chất lƣợng nông sản, giảm chi phí, tiết kiệm phân bón vô cơ, đóng góp quan trọng trong việc bảo vệ môi trƣờng và phát triển nền nông, lâm nghiệp bền vững. Vì vậy, nghiên cứu và sử dụng nguồn dinh dƣỡng tạo ra từ các hoạt động sống của vi sinh vật đã và đang đƣợc nhiều nƣớc trên thế giới quan tâm và phát triển. Bên cạnh các sản phẩm phân HCVSV đơn chủng đã đƣợc nghiên cứu và sử dụng hiệu quả nhƣ: Nitragin, Rhizoda, Azogin, Rhizolu, Phosphobacterin, Azotobacterin.
một số nghiên cứu gần đây cho thấy chế phẩm phân bón tổng hợp bao gồm các nhóm cố định nitơ, phân giải photphat, kích thích sinh trƣởng thực vật, đối kháng vi sinh vật gây bệnh (chế phẩm EM, vi sinh vật tổng hợp) có tác dụng đối với cây trồng tốt hơn so với từng loại vi sinh vật riêng rẽ. 8 z Nhiều kết quả nghiên cứu về phân bón HCVSV đã khẳng định, hiệu quả của phân HCVSV phụ thuộc hoạt tính sinh học, khả năng cạnh tranh với vi sinh vật có sẵn trong đất và khả năng thích ứng với điều kiện môi trƣờng đất của các vi sinh vật sử dụng trong phân bón [13], [14], [15]. Phân vi sinh vật đặc biệt có ý nghĩa sử dụng nếu các vi sinh vật sử dụng có nhiều hoạt tính sinh học. Azotobacter là nhóm có phổ phân bố khá rộng.
Các nghiên cứu trƣớc đây đã phát hiện ra nhiều đặc tính quý của Azotobacter nhƣ khả năng cố định nitơ tự do, kích thích sinh trƣởng, đối kháng, sinh polyshacarit v. Để sản xuất phân bón HCVSV tốt, phải có chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao, đa hoạt tính, khả năng tồn tại lớn. Vì vậy, việc phân lập, tuyển chọn đánh giá hoạt tính của các chủng vi sinh vật là việc làm không thể thiếu trong quy trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh vật [11]. Đây là đề tài nghiên cứu mà chúng tôi đang hƣớng tới.
Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn các chủng Azotobacter có hoạt tính sinh học cao (cố định nitơ, kích thích sinh trƣởng và đối kháng bệnh héo xanh) để sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh cho cây lạc. Nội dung nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn các chủng Azotobacter từ đất canh tác. - Lựa chọn tổ hợp chủng Azotobacter thích hợp để sản xuất phân bón. - Phân loại và mức độ an toàn của các chủng vi sinh vật nghiên cứu - Đánh giá ảnh hƣởng của tổ hợp các chủng Azotobacter lựa chọn đến sinh trƣởng, phát triển và năng suất của cây lạc (thí nghiệm trong nhà lƣới và ngoài đồng ruộng diện hẹp).
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Vi khuẩn Azotobacter 1. Đặc điểm hình thái và các đặc tính sinh lí, sinh hóa của Azotobacter. Họ Azotobacteraceae gồm 2 chi Azotobacter (Beijerinck, 1901) và Azomonas (Winogradsky, 1938).
Azotobacter đƣợc phân lập lần đầu tiên vào năm 1901. Đó là loài Azotobacter chroococcum, về sau ngƣời ta tìm thấy nhiều loài khác trong chi Azotobacter (beijerinskii, vinelandii, agllis). Azotobacter là vi khuẩn cố định nitơ sống tự do trong đất, hiếu khí, không sinh bào tử, Gram âm. Khi còn non tế bào thƣờng có dạng hình que, kích thƣớc khoảng 2,0- 7,0 × 10- 2,5 μm, đứng riêng rẽ hay xếp thành từng đôi chồng chất, tế bào nhuộm màu đồng đều, có khả năng di động nhờ tiên mao mọc khắp cơ thể (chu mao).
Khi già tế bào Azotobacter mất khả năng di động, kích thƣớc thu nhỏ lại trông giống nhƣ hình cầu. Nguyên sinh chất xuất hiện nhiều hạt lổn nhổn. Đó là các hạt volutin, granulose, các giọt mỡ… Quan sát dƣới kính hiển vi ta còn thấy khi già tế bào Azotobacter đƣợc bao bọc bởi một vỏ nhầy khá dày. Vỏ nhầy của vi khuẩn Azotobacter chứa khoảng 75 % là chất hiđrit của axit uronic và chứa khoảng 0,023 % nitơ.
Lƣợng ADN trong tế bào Azotobacter thƣờng thấp hơn so với nhiều loại vi khuẩn khác (0,70- 0,81%) [4]. Azotobacter có thể sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cơ làm nguồn thức ăn cacbon. Chúng cũng cần nhiều nguyên tố khoáng, đặc biệt là 2 nguyên tố vi lƣợng bor (B) và molipden (Mo)(Mo cần cho quá trình cố định nitơ). Khi sống trong điều kiện không có nitơ, Azotobacter sẽ dùng nitơ của không khí để biến thành nitơ của cơ thể sống.
Khi sống trong môi trƣờng đủ thức ăn nitơ hữu cơ hoặc vô cơ thì tác dụng cố định nitơ sẽ rất thấp hoặc không có. Azotobacter thích hợp với điều kiện hiếu khí vừa phải và pH trung tính hoặc hơi kiềm. Khi nuôi trong môi trƣờng thạch, vi khuẩn Azotobacter có khuẩn lạc nhầy, lồi hoặc tan, lúc đầu không màu, sau biến thành màu nâu tối, thậm chí đến màu đen 10 z nhƣng không làm nhuộm màu môi trƣờng. Ngoài ra một số loài Azotobacter có dạng nhăn nheo, khuẩn lạc có màu vàng lục, màu hồng.
Vi khuẩn Azotobacter thuộc loại vi khuẩn hiếu khí, sống theo phƣơng thức dị dƣỡng. Chúng sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cơ khác nhau: disacarit, dextrin, tinh bột, axit hữu cơ, hợp chất thơm … Tuy vậy, nhiều tác giả cho biết có không ít chủng Azotobacter không có khả năng đồng hoá lactose, manitơl hoặc natribenzoat [12]. Trên các môi trƣờng không chứa nitơ khuẩn lạc Azotobacter có dạng nhầy, lồi, đôi khi nhăn nheo, chứng tỏ vi khuẩn Azotobacter có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng không có nitơ. Sở dĩ chúng tồn tại đƣợc là vì có khả năng đồng hoá muối amonium, urê.
Một số chủng Azotobacter có khả năng sử dụng nitrit, nitrat. Hai loại axit thích hợp nhất đối với nhu cầu dinh dƣỡng của Azotobacter là axit glutamic và axit asparaginic. Nguồn dinh dƣỡng Vi sinh vật cũng nhƣ các loài động thực vật khác, luôn có nhu cầu sử dụng những chất chúng có thể hấp thụ từ môi trƣờng xung quanh và đƣợc sử dụng làm nguyên liệu để cung cấp cho quá trình sinh tổng hợp tạo ra các thành phần của tế bào hoặc để cung cấp cho các quá trình trao đổi năng lƣợng. Tuy nhiên không phải mọi thành phần của môi trƣờng nuôi cấy đều đƣợc coi là chất dinh dƣỡng.
Một số chất rắn cần thiết cho vi sinh vật nhƣng chỉ làm nhiệm vụ bảo đảm các điều kiện thích hợp về thế oxy hoá - khử, về pH, về áp suất thẩm thấu, về cân bằng ion v.v… Chất dinh dƣỡng phải là những chất có tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào. Nguồn cacbon Cacbon chiếm tỷ lệ trên 50% vật chất khô của vi sinh vật. Cacbon là yếu tố đặc biệt quan trọng trong cấu trúc tất cả các hợp chất có mặt trong tế bào. Hợp chất cacbon là nguồn năng lƣợng quan trọng trong hoạt động sống của vi sinh vật.
Trong tự nhiên có hai dạng hợp chất cacbon cơ bản là: Cacbon vô cơ và cacbon hữu cơ. Các loại vi sinh vật khác nhau sử dụng các nguồn cacbon không giống nhau. Tuỳ 11 z theo nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon đƣợc cung cấp có thể là chất vô cơ (CO2, NaHCO3, CaCO3 …) hoặc hữu cơ. Giá trị dinh dƣỡng và khả năng hấp thụ các nguồn thức ăn cacbon phụ thuộc vào hai yếu tố: + Thành phần hoá học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn + Đặc điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật Hầu nhƣ không có hợp chất cacbon hữu cơ nào mà không bị nhóm vi sinh vật này hoặc nhóm vi sinh vật khác phân huỷ.
Về thức ăn cacbon, Azotobacter có khả năng đồng hoá, nhiều loại monosaccarit (glucoza, fructoza, galactoza, manoza arabinoza, xyloza), disaccarit (saccaroza, maltoza, trehaloza, melibioza, lactoza), trisaccarit (raffinoza melizitoza), polysaccarit (tinh bột, dextrin, glycogen, inulin), 2,3 butylenglycol, glyxerin, mannit, sorbit, inozit, các oxi axit (nhƣ axit lactic, axit glycolic, axit saccaric, axit sucxinic, axit malic, axit limonic, axit glycolic, axit galactonic, axit mannonic , axit glyxetinic, axit pyruvic, axit quinic, axit butyric, axit valeric, axit cepronic), các diaxit (axit fumaric, axit maleic, axit malonic, axit oxaloaxetic) các hợp chất thơm (nhƣ axit benzoic, axit salixilic, phenol. Khả năng đồng hoá các nguồn thức ăn cacbon nói trên không phải là giống nhau ở tất cả các chủng Azotobacter. Có không ít các chủng Azotobacter không có khả năng đồng hoá lactoza, mannit hoặc natri benzoat. Khi đồng hóa glucose, Azotobacter thƣờng làm tích luỹ lại trong môi trƣờng axit pyruvic, axit lactic và etanol.
Chính vì lí do này cho nên khi phát triển Azotobacter thƣờng làm axit hoá môi trƣờng nuôi cấy. Nguồn nitơ Nguồn dinh dƣỡng nitơ có ý nghĩa rất quan trọng đối với sự phát triển của vi sinh vật. Nguồn nitơ dễ hấp thụ đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+. Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp đối với nhiều loại tảo, nấm sợi và xạ khuẩn nhƣng ít thích hợp với nhiều loại nấm men và vi khuẩn.
Sau khi vi sinh vật sử dụng hết gốc NO3- các ion kim loại còn lại: K+, Na+, Mg2+,… làm kiềm hoá môi trƣờng. Để tránh 12 z hiện tƣợng này ngƣời ta sử dụng muối NH4NO3 làm nguồn nitơ cho nhiều loại vi sinh vật. Tuy nhiên gốc NH4+ thƣờng bị hấp thụ nhanh rồi mới hấp thụ đến gốc NO3- Đa số vi khuẩn không có khả năng đồng hóa N2 trong không khí, tuy nhiên có những vi sinh vật có thể chuyển hoá N2 thành NH3 nhờ hoạt động xúc tác của hệ thống enzym nitrogenaza, các vi sinh vật này gọi là các vi sinh vật cố định nitơ. Cụ thể có các loại nhƣ: Rhizobium, Azotobacter, Clostridium, v.v… Vi sinh vật còn có khả năng đồng hoá rất tốt nitơ chứa trong thức ăn hữu cơ.