Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Leuprolid acetat là một nonapeptid tổng hợp có hoạt tính tương tự hormon giải phóng gonadotropin nội sinh (GnRH), giữ vai trò quan trọng trong điều trị các bệnh lý phụ thuộc hormon sinh dục như dậy thì sớm phụ thuộc gonadotropin, ung thư tuyến tiền liệt giai đoạn tiến triển, ung thư vú ở phụ nữ quanh và sau mãn kinh, u xơ cơ trơn tử cung và lạc nội mạc tử cung. Do có thời gian bán thải sinh học tương đối ngắn (khoảng 3 giờ sau khi tiêm), nếu sử dụng ở dạng thuốc tiêm giải phóng quy ước thông thường, bệnh nhân bắt buộc phải tiêm thuốc lặp lại hàng ngày. Trong khi đó, phác đồ điều trị các bệnh mạn tính liên quan đến hormon thường kéo dài từ vài tháng đến nhiều năm. Việc thiết kế và phát triển dạng thuốc tiêm giải phóng kéo dài chứa leuprolid acetat nạp trong hệ chất mang vi cầu phân hủy sinh học poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) là giải pháp kỹ thuật cần thiết nhằm duy trì nồng độ điều trị ổn định, giảm số lần can thiệp xâm lấn và nâng cao tính tuân thủ điều trị của người bệnh.

Mặc dù một số chế phẩm vi cầu PLGA chứa leuprolid acetat thương mại đã được lưu hành trên thế giới (điển hình như Lucrin Depot), nguồn cung và số lượng biệt dược nhập khẩu vào Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Trong quy trình nghiên cứu và phát triển (R&D) cũng như kiểm soát chất lượng vi cầu giải phóng kéo dài, phép thử giải phóng dược chất in vitro ở điều kiện dài hạn thường đòi hỏi thời gian theo dõi liên tục trong nhiều tuần hoặc nhiều tháng (từ 28 đến 56 ngày), gây tốn kém chi phí, nhân lực và làm chậm tiến độ tối ưu hóa công thức. Do đó, theo khuyến cáo của Hiệp hội các nhà khoa học dược phẩm Hoa Kỳ và Liên đoàn dược phẩm quốc tế (AAPS/FIP), việc nghiên cứu thiết lập một phương pháp thử giải phóng in vitro ở điều kiện cấp tốc, có khả năng rút ngắn thời gian phân tích xuống còn vài ngày nhưng vẫn phản ánh chính xác động học giải phóng dài hạn, mang ý nghĩa thực tiễn quan trọng.

Trên cơ sở kế thừa các kết quả nghiên cứu bào chế vi cầu PLGA-LA trước đây tại Bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội, đề tài khóa luận "Nghiên cứu xây dựng và ứng dụng tương quan giải phóng in vitro ở điều kiện dài hạn và cấp tốc của vi cầu leuprolid acetat giải phóng kéo dài" do sinh viên Ngô Giao Thông thực hiện tập trung vào 2 mục tiêu cụ thể:

  1. Mô hình hóa quá trình giải phóng leuprolid acetat in vitro từ vi cầu PLGA; thiết lập mối tương quan giữa mức độ giải phóng dược chất in vitro ở điều kiện dài hạn với điều kiện cấp tốc.
  2. Ứng dụng mối tương quan này trong nghiên cứu xây dựng và khảo sát công thức bào chế vi cầu leuprolid acetat đông khô giải phóng kéo dài.

Đối tượng nghiên cứu là vi cầu PLGA nạp leuprolid acetat được bào chế theo phương pháp nhũ hóa kép kết hợp bốc hơi dung môi và làm khô bằng phương pháp đông khô; mẫu đối chiếu là thuốc tiêm đông khô Lucrin® PDS Depot 3,75 mg (Takeda - Nhật Bản, số lô 1129842, tác dụng kéo dài 1 tháng). Phạm vi thực nghiệm tập trung vào việc khảo sát động học giải phóng in vitro dài hạn (ở 37°C trong môi trường đệm phosphat saline pH 7,4 có bổ sung 0,02% Tween 80 và 0,02% natri diazid - PBS-TN) kéo dài 56 ngày và giải phóng cấp tốc (ở 50°C trong môi trường đệm phosphat saline pH 7,4 có 0,02% Tween 80 - PBS-T hoặc dung dịch Tween 80 0,02%) trong vòng 72 giờ, được tiến hành tại hệ thống phòng thí nghiệm của Trường Đại học Dược Hà Nội trong năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và mô hình động học giải phóng

Khóa luận xây dựng cơ sở lý thuyết dựa trên các cơ chế chuyển khối và phân hủy chất mang polyme phân hủy sinh học PLGA, bao gồm:

  • Khuếch tán dược chất qua hệ thống lỗ xốp và vi mao quản có sẵn hoặc mới hình thành trên bề mặt vi cầu.
  • Khuếch tán qua mạng lưới chuỗi polyme (chủ yếu khi polyme chuyển từ trạng thái thủy tinh sang trạng thái lỏng nhớt dẻo).
  • Áp suất thẩm thấu sinh ra do dòng dung môi thâm nhập hòa tan dược chất hoặc tá dược thân nước.
  • Quá trình xói mòn và thủy phân cắt đứt liên kết este trong mạch PLGA tạo thành acid lactic và acid glycolic.

Quá trình mô hình hóa toán học động học hòa tan/giải phóng được thực hiện thông qua hai cách tiếp cận:

  • Phương pháp không phụ thuộc mô hình: Ứng dụng hệ số sai khác ($f_1$) và hệ số tương đồng ($f_2$) theo tiêu chuẩn FDA để so sánh sự tương đồng giữa hai đồ thị giải phóng ($f_1 < 15$ và $50 \le f_2 \le 100$ kết luận hai đường cong giải phóng tương đương).
  • Phương pháp phụ thuộc mô hình: Dữ liệu giải phóng thực nghiệm được khớp với các phương trình động học kinh điển và bán kinh nghiệm gồm:
    • Động học bậc 0: $F = k_0 \times t$
    • Động học bậc 1: $F = 100 \times (1 - e^{-k_1 \times t})$
    • Mô hình Weibull: $F = 100 \times [1 - \exp(-\alpha \times t^\beta)]$
    • Mô hình Korsmeyer-Peppas: $F = a \times t^n$ (với tham số mũ $n$ dùng để định danh cơ chế khuếch tán Fick, phi Fick, vận chuyển loại II hoặc siêu loại II)
    • Mô hình Duvvuri (mô hình sigmoid mở rộng mô tả quá trình giải phóng 3 pha): $$F = A \times (1 - e^{-k_1 \times t}) + \frac{B}{1 + e^{-k_2 \times (t - t_{50})}}$$
  • Tiêu chuẩn đánh giá độ phù hợp của mô hình: Sử dụng hệ số xác định ($R^2$), hệ số xác định hiệu chỉnh ($R^2_{\text{adjusted}}$) và tiêu chuẩn thông tin Akaike (AIC). Mô hình có giá trị AIC nhỏ nhất và $R^2$ tiệm cận 1 được xác định là mô hình mô tả tối ưu bộ dữ liệu.

Nguyên vật liệu và trang thiết bị thực nghiệm

  • Dược chất và chất mang: Leuprolid acetat (Trung Quốc, đạt tiêu chuẩn Dược điển Châu Âu EP8); các loại polyme poly(acid lactic-co-glycolic) từ hãng Sigma - Đức gồm PLGA tỷ lệ L/G 50:50 (khối lượng phân tử 7-17 kDa), PLGA tỷ lệ L/G 50:50 (khối lượng phân tử 24-38 kDa), PLGA tỷ lệ L/G 75:25 (khối lượng phân tử 4-15 kDa).
  • Tá dược: Gelatin type B (G9391, Sigma - Đức); Alcol polyvinyl (PVA-124, Trung Quốc); Natri clorid (DĐVN V); D-Manitol (Trung Quốc); Amoni bicarbonat (Trung Quốc); Dicloromethan (DCM); Dimethyl sulfoxid (DMSO); Acetonitril (ACN, HPLC Merck); Methanol (Merck); Natri diazid ($NaN_3$); Tween 80; các muối đệm phosphat ($KH_2PO_4$, $Na_2HPO_4$, $NH_4H_2PO_4$, $KCl$).
  • Chế phẩm đối chiếu: Lucrin® PDS Depot 3,75 mg (dạng bột đông khô kèm dung môi hoàn nguyên, Takeda Chemical Industries - Nhật Bản).
  • Thiết bị nghiên cứu: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu 20A với cột InertSustain C18 ($5,\mu\text{m}, 4,6 \times 250,\text{mm}$); máy đo kích thước tiểu phân tán xạ laser MasterSizer 3000E (Anh); máy đo huỳnh quang Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer (Mỹ); kính hiển vi điện tử quét SEM Regulus 8100 (Hitachi - Nhật Bản); máy đông khô Alpha 1-2 LD Plus (Đức); máy ly tâm lạnh Hand Supra R2 (Hàn Quốc); máy đồng nhất hóa Unidrive X1000 (Đức); bể lắc điều nhiệt WiseBath SciLab (Hàn Quốc).

Phương pháp nghiên cứu

  • Bào chế vi cầu PLGA-LA: Ứng dụng kỹ thuật nhũ hóa kép kết hợp bốc hơi dung môi (N/D/N). Pha nước nội chứa 60 mg leuprolid acetat và 6,6 mg gelatin trong 0,6 ml đệm phosphat pH 7,4. Pha dầu gồm 360 mg hỗn hợp PLGA hòa tan trong 4 ml DCM. Tiến hành nhũ hóa lần 1 bằng máy đồng nhất hóa ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 5 phút tạo nhũ tương N/D. Phối hợp nhũ tương N/D vào 10 ml pha nước ngoại (dung dịch PVA 1,5% - NaCl 1,5%), nhũ hóa lần 2 ở 4.000 vòng/phút trong 40 giây tạo nhũ tương kép N/D/N. Pha loãng hệ với 20 ml dung dịch PVA 1,5% - NaCl 1,5%, sục khí nitơ ($N_2$) tốc độ 20 ml/phút trong 30 phút để rắn hóa vi cầu. Thu hồi vi cầu bằng ly tâm lạnh 5.000 vòng/phút trong 5 phút ở 5°C, rửa 2 lần bằng nước cất, phân tán lại trong 10 ml dung dịch D-manitol 1,25% (kl/tt), đóng lọ 2 ml và tiến hành đông khô (-70°C trong 7 giờ, thăng hoa ở -50°C dưới áp suất 0,04 mbar trong 24 giờ).
  • Phương pháp định lượng:
    • Định lượng hàm lượng leuprolid acetat tổng số trong vi cầu đông khô bằng HPLC với detector UV tại bước sóng 280 nm, pha động đệm phosphat $0,03\text{M}$ pH 4,0 : ACN (75:25 tt/tt), tốc độ dòng 0,8 ml/phút.
    • Định lượng hàm lượng leuprolid acetat giải phóng trong môi trường hòa tan bằng phương pháp đo huỳnh quang phân tử (bước sóng kích thích $\lambda_{\text{ex}} = 280,\text{nm}$, bước sóng phát xạ $\lambda_{\text{em}} = 356,\text{nm}$).
  • Phương pháp thử giải phóng in vitro dài hạn: Thực hiện theo phương pháp lấy mẫu và phân tách (sample and separate). Hỗn dịch vi cầu được ủ trong 1 ml đệm PBS-TN pH 7,4 ở nhiệt độ $37 \pm 0,5^\circ\text{C}$, lắc ngang 125 vòng/phút. Lấy mẫu tại các ngày 1, 4, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56; ly tâm tách dịch trong để đo huỳnh quang và bù lại lượng môi trường tương ứng.
  • Phương pháp thử giải phóng in vitro cấp tốc: Hỗn dịch vi cầu được ủ trong 80 ml môi trường (dung dịch Tween 80 0,02% hoặc dung dịch PBS-T pH 7,4) ở nhiệt độ gia nhiệt $50 \pm 0,5^\circ\text{C}$, lắc ngang 125 vòng/phút. Lấy mẫu phân tích tại các thời điểm 1, 4, 7, 24, 30, 48, 54, 72 giờ.
  • Xử lý số liệu: Thực hiện lặp lại 3 lần ($n=3$), biểu diễn dạng Trung bình $\pm$ Độ lệch chuẩn ($\text{TB} \pm \text{SD}$). Khớp mô hình toán học và tính toán hệ số $f_1, f_2$ bằng phần mềm Microsoft Excel tích hợp công cụ DDSolver.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan về leuprolid acetat

Chương tổng quan hệ thống hóa cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa, cơ chế dược lý, hồ sơ phân hủy sinh học của leuprolid acetat và chất mang PLGA, cùng các nguyên lý mô hình hóa giải phóng dược chất:

  • Dược chất: Leuprolid acetat có công thức phân tử $\text{C}{59}\text{H}{84}\text{N}{16}\text{O}{12}$, khối lượng phân tử 1269,45 g/mol, cấu trúc gồm 9 acid amin (pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt). Do có chứa gốc D-Leu ở vị trí số 6 thay cho Gly tự nhiên của GnRH, chất này có ái lực thụ thể mạnh hơn và thời gian bán hủy dài hơn GnRH nội sinh. Dược chất tan tốt trong nước, acid acetic và DMSO ($>100,\text{mg/ml}$ ở 25°C), điểm nóng chảy 150-155°C. Trong dung dịch nước, phân tử dễ bị phân hủy do thủy phân liên kết peptid và hiện tượng D,L-đồng phân hóa; độ ổn định tối ưu ở pH 7,4 và nhiệt độ bảo quản thấp (4°C). Về mặt tác dụng, thuốc gây ức chế chọn lọc bài tiết LH và FSH thông qua cơ chế điều hòa ngược âm tính sau 2-4 tuần kích thích liên tục, từ đó làm giảm nồng độ hormon sinh dục về mức thiến.
  • Cơ chế giải phóng từ cốt PLGA: Quá trình giải phóng thường biểu hiện theo mô hình 2 pha hoặc 3 pha. Mô hình 3 pha kinh điển gồm: pha giải phóng ồ ạt ban đầu (burst release, do thuốc bám dính lỏng lẻo ở bề mặt vi cầu khuếch tán ra môi trường), pha giải phóng chậm (lag phase, do mạng lưới polyme trương nở tạo hàng rào cản trở khuếch tán khi chuỗi PLGA chưa bị phân cắt đủ nhỏ) và pha giải phóng nhanh/xói mòn (erosion phase, khi chuỗi polyme bị thủy phân đạt khối lượng phân tử giới hạn khoảng 20 kDa khiến cấu trúc vi cầu rã hoàn toàn).
  • Mô hình hóa và tương quan cấp tốc - dài hạn: Tổng hợp ưu nhược điểm của các mô hình toán học ($f_1, f_2$, bậc 0, bậc 1, Weibull, Korsmeyer-Peppas, Duvvuri); cơ sở rút ngắn thời gian giải phóng bằng cách tăng nhiệt độ thử nghiệm lên 50°C nhằm gia tốc quá trình thủy phân liên kết este của cốt PLGA mà không làm biến tính cấu trúc chuỗi peptid của leuprolid acetat.

Chương 2. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc hóa chất, thông số kỹ thuật thiết bị, quy trình chuẩn bị và các bước thực nghiệm:

  • Trình bày công thức cơ sở gồm: pha nước nội (60 mg LA, 6,6 mg gelatin, 0,6 ml đệm phosphat pH 7,4), pha dầu (360 mg PLGA hòa trong 4 ml DCM), pha nước ngoại (10 ml PVA 1,5% - NaCl 1,5%), dung dịch pha loãng (20 ml PVA 1,5% - NaCl 1,5%) và chất bảo vệ đông khô (10 ml D-manitol 1,25%).
  • Quy định điều kiện sắc ký HPLC định lượng leuprolid acetat: bước sóng phát hiện UV 280 nm; tốc độ dòng 0,8 ml/phút; thể tích tiêm $50,\mu\text{l}$; pha động đệm amoni dihydrophosphat $0,03\text{M}$ pH 4,0 : ACN (75:25 tt/tt).
  • Quy trình phân tích huỳnh quang: lập đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ $1 - 20,\mu\text{g/ml}$ trong môi trường thử giải phóng tại bước sóng kích thích 280 nm và bước sóng phát xạ 356 nm, hệ số tương quan đạt $R > 0,995$.
  • Chi tiết hóa điều kiện đo kích thước vi cầu bằng tán xạ laser (chỉ số $D[4,3]$ và khoảng phân bố Span) và chụp ảnh hình thái vi cầu bằng kính hiển vi điện tử quét SEM sau khi phủ màng platin dẫn điện trong 35 giây ở điện thế 1 - 1,5 kV.

Chương 3. Thực nghiệm và kết quả

1. Mô hình hóa quá trình giải phóng dài hạn

Tiến hành thử giải phóng dài hạn (37°C, PBS-TN) trên hai công thức vi cầu mẫu M1 và M2:

  • Mẫu M1 (PLGA 50:50 7-17 kDa : PLGA 50:50 24-38 kDa tỷ lệ 7:3): Giải phóng theo mô hình 3 pha. Pha giải phóng ồ ạt kéo dài 4 ngày đầu đạt 27,42%; pha giải phóng ổn định kéo dài từ ngày 4 đến ngày 21 (đạt 23,38%, hằng số tốc độ giải phóng bậc không $K = 1,3637%/\text{ngày}$); pha xói mòn tăng tốc từ ngày 21 đến ngày 56 (chiếm 41,38%). Tổng lượng giải phóng sau 56 ngày đạt $92,18%$.
  • Mẫu M2 (PLGA 75:25 4-15 kDa : PLGA 50:50 24-38 kDa tỷ lệ 7:3): Giải phóng theo mô hình 2 pha. Pha giải phóng ồ ạt trong 4 ngày đầu đạt 33,92%; tiếp nối là pha giải phóng ổn định kéo dài suốt từ ngày 4 đến ngày 56 (đạt 54,68%, hằng số tốc độ $K = 1,0311%/\text{ngày}$). Tổng lượng giải phóng sau 56 ngày đạt $88,60%$.

Dữ liệu giải phóng dài hạn được khớp vào các mô hình toán học:

Mô hình toán học Thông số khớp mẫu M1 Thông số khớp mẫu M2
Động học bậc 0 $F = 1,986 \times t$
$R^2 = 0,8177$; $\text{AIC} = 85,26$		 $F = 1,791 \times t$
$R^2 = 0,6610$; $\text{AIC} = 78,75$
Động học bậc 1 $F = 100 \times [1 - e^{-0,044t}]$
$R^2 = 0,9615$; $\text{AIC} = 68,15$		 $F = 100 \times [1 - e^{-0,036t}]$
$R^2 = 0,8507$; $\text{AIC} = 87,77$
Weibull $F = 100 \times [1 - e^{-(t^{0,881}/15,593)}]$
$R^2 = 0,9653$; $\text{AIC} = 69,01$		 $F = 100 \times [1 - e^{-(t^{0,576}/6,731)}]$
$R^2 = 0,9507$; $\text{AIC} = 68,57$
Korsmeyer-Peppas $F = 11,577 \times t^{0,525}$
$R^2 = 0,9783$; $\text{AIC} = 63,83$		 $F = 16,082 \times t^{0,406}$
$\mathbf{R^2 = 0,9752}$; $\mathbf{AIC = 61,01}$
Mô hình Duvvuri $F = 27,317 \times (1 - e^{-0,403t}) + \frac{64,986}{1 + e^{-0,174(t - 29,998)}}$
$\mathbf{R^2 = 0,9960}$; $\mathbf{AIC = 51,95}$		 (Không áp dụng do M2 giải phóng 2 pha)

Kết quả cho thấy mô hình Duvvuri phù hợp nhất đối với mẫu M1 (AIC nhỏ nhất = 51,95), phản ánh chính xác đặc tính 3 pha kết hợp giữa giải phóng khuếch tán bậc 1 ban đầu và giải phóng sigmoid do xói mòn polyme. Đối với mẫu M2, mô hình Korsmeyer-Peppas đạt độ tương thích cao nhất (AIC nhỏ nhất = 61,01).

2. Xây dựng tương quan giải phóng dài hạn - cấp tốc

Thử giải phóng cấp tốc ở 50°C cho thấy trong môi trường dung dịch Tween 80 0,02% không đệm, quá trình thủy phân PLGA sinh ra acid lactic và glycolic làm giảm pH môi trường, gây xúc tác acid tự thân làm vi cầu vỡ nhanh bất thường, dẫn đến pha ồ ạt giả tạo của mẫu M1 lên tới 49,92% (gấp 1,8 lần điều kiện thực) và xuất hiện khoảng dừng giải phóng nhân tạo kéo dài từ 7 đến 24 giờ.

Ngược lại, trong môi trường PBS-T (đệm phosphat pH 7,4 duy trì ổn định pH), mẫu M1 và M2 giữ được đường cong động học giải phóng tương đồng với điều kiện dài hạn (mẫu M1 duy trì mô hình 3 pha, mẫu M2 duy trì mô hình 2 pha). Mô hình Duvvuri khớp với mẫu M1 trong PBS-T đạt AIC = 31,10; mô hình Korsmeyer-Peppas khớp với mẫu M2 trong PBS-T đạt AIC = 35,17 ($F = 15,824 \times t^{0,341}$). Do đó, môi trường PBS-T được lựa chọn làm môi trường chuẩn để thiết lập tương quan.

Từ dữ liệu tính toán thời điểm đạt các mức giải phóng 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% giữa hai điều kiện, tác giả xây dựng được 2 phương trình tương quan tuyến tính:

  • Phương trình tương quan về thời gian giải phóng: $$y = 2,1717x - 7,539 \quad (R^2 = 0,9675)$$ (với $x$ là thời gian thử dài hạn tính bằng ngày; $y$ là thời gian thử cấp tốc tính bằng giờ).
  • Phương trình tương quan về mức độ (% dược chất) giải phóng: $$y = 1,1055x - 4,8136 \quad (R^2 = 0,9282)$$ (với $x$ là % giải phóng ở điều kiện dài hạn; $y$ là % giải phóng ở điều kiện cấp tốc).

3. Ứng dụng tương quan khảo sát công thức vi cầu

  • Xây dựng đường giải phóng cấp tốc lý thuyết cho mẫu đối chiếu Lucrin Depot (M0): Thử giải phóng dài hạn mẫu M0, áp dụng phương trình tương quan chuyển đổi sang dữ liệu cấp tốc lý thuyết và khớp mô hình Korsmeyer-Peppas thu được phương trình $F = 27,258 \times t^{0,274}$ ($\text{AIC} = 36,51$). Các giá trị % giải phóng lý thuyết dự đoán của M0 lần lượt là: 1h (27,26%), 4h (39,85%), 7h (46,46%), 24h (65,11%), 30h (69,22%), 48h (78,73%), 54h (81,31%) và 72h (87,98%).
  • Khảo sát ảnh hưởng của chủng loại PLGA: Bào chế các mẫu vi cầu với tỷ lệ polyme 7:3 gồm M1 (PLGA 50:50 7-17 kDa / PLGA 50:50 24-38 kDa), M2 (PLGA 75:25 4-15 kDa / PLGA 50:50 24-38 kDa) và M3 (PLGA 50:50 7-17 kDa / PLGA 75:25 4-15 kDa). Mẫu M3 giải phóng ồ ạt cao (47,03%) và có pha trễ kéo dài do kích thước vi cầu lớn ($28,1,\mu\text{m}$) bắt nguồn từ độ nhớt pha dầu cao. So sánh với mẫu đối chiếu M0:
Cặp so sánh Chỉ số $f_1$ Chỉ số $f_2$ Kết luận tương đồng
M1 và M0 17,46 45,93 Gần với mẫu đối chiếu nhất
M2 và M0 27,69 38,96 Khác biệt lớn, tốc độ chậm
M3 và M0 18,19 44,18 Khác biệt
  • Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ phối hợp PLGA: Cố định hai loại PLGA 50:50 (7-17 kDa) và PLGA 50:50 (24-38 kDa) ở các tỷ lệ 6:4 (M4), 7:3 (M1) và 8:2 (M5). Tăng tỷ lệ polyme phân tử lượng thấp (7-17 kDa) làm tăng lượng giải phóng ồ ạt ban đầu (M4: 16,54%; M1: 29,27%; M5: 32,28%) và tăng tổng lượng giải phóng sau 72 giờ (M4: 66,45%; M1: 81,96%; M5: 89,86%) do nhiệt độ chuyển kính giảm và tốc độ thủy phân acid tự xúc tác tăng. Kết quả so sánh với M0 cho thấy mẫu M1 vẫn có độ tương đồng cao nhất ($f_1 = 17,46; f_2 = 45,93$) so với M4 ($f_1 = 36,55; f_2 = 32,89$) và M5 ($f_1 = 19,57; f_2 = 44,06$).
  • Khảo sát chất tạo lỗ xốp (Amoni bicarbonat): Thêm 20 mg amoni bicarbonat vào pha nước nội. Dưới tác dụng cơ học và nhiệt của quá trình nhũ hóa, chất này phân hủy tạo bọt khí $NH_3$ và $CO_2$ thoát ra, tạo cấu trúc vi xốp rỗng trên bề mặt vi cầu (được kiểm chứng qua ảnh chụp SEM). Bào chế và so sánh 4 mẫu: M1 (tỷ lệ 7:3 không muối xốp), M6 (PLGA 75:25 4-15 kDa / PLGA 50:50 24-38 kDa tỷ lệ 7:3, không muối xốp), M7 (thành phần như M1 + 20 mg muối xốp) và M8 (thành phần như M6 + 20 mg muối xốp).
Cặp so sánh Chỉ số $f_1$ Chỉ số $f_2$ Đánh giá tương đồng động học
M1 và M0 17,46 45,93 Chưa đạt tương đồng ($f_2 < 50$)
M6 và M0 18,01 46,09 Chưa đạt tương đồng ($f_2 < 50$)
M7 và M0 6,48 68,13 Đạt tương đồng toán học nhưng giải phóng 3 pha không đều
M8 và M0 4,34 75,72 Tương đồng tối ưu, giải phóng 2 pha đồng nhất

Mẫu M7 dù đạt tương đồng toán học nhưng có pha ồ ạt quá cao (54,57%) và giải phóng ngắt quãng. Mẫu M8 thể hiện đường cong giải phóng 2 pha liên tục, hằng định, đạt $f_1 = 4,34$ và $f_2 = 75,72$, hoàn toàn tương đồng với chế phẩm đối chiếu Lucrin Depot. Do đó, công thức M8 được lựa chọn là công thức tối ưu.

Kết quả và đóng góp của khóa luận

Kết quả chính

  • Xác lập được mô hình giải phóng toán học đặc trưng cho từng hệ vi cầu: mô hình giải phóng Duvvuri là mô hình tối ưu mô tả vi cầu giải phóng 3 pha (mẫu M1, AIC = 51,95 và $R^2 = 0,9960$), trong khi mô hình Korsmeyer-Peppas là mô hình tối ưu cho vi cầu giải phóng 2 pha (mẫu M2, AIC = 61,01 và $R^2 = 0,9752$).
  • Thiết lập thành công hai phương trình hồi quy tuyến tính biểu diễn tương quan giữa phép thử dài hạn (37°C, môi trường PBS-TN) và phép thử cấp tốc (50°C, môi trường PBS-T):
    • Phương trình tương quan thời gian: $y = 2,1717x - 7,539$ với hệ số xác định cao $R^2 = 0,9675$.
    • Phương trình tương quan mức độ giải phóng: $y = 1,1055x - 4,8136$ với $R^2 = 0,9282$.
  • Ứng dụng thành công tương quan thực nghiệm để rút ngắn thời gian sàng lọc và tối ưu hóa công thức vi cầu từ 56 ngày xuống còn 72 giờ. Xác định được công thức vi cầu đông khô tối ưu M8 (phối hợp PLGA 75:25 4-15 kDa và PLGA 50:50 24-38 kDa theo tỷ lệ 7:3, phối hợp 20 mg amoni bicarbonat làm chất tạo xốp), đạt độ tương đồng động học vượt trội với biệt dược đối chiếu Lucrin® PDS Depot 3,75 mg ($f_1 = 4,34$ và $f_2 = 75,72$).

Đóng góp về mặt khoa học và phương pháp

  • Chứng minh rõ vai trò kiểm soát pH của môi trường hòa tan gia tốc: môi trường đệm phosphat duy trì pH trung tính (PBS-T) ở 50°C giúp bảo toàn bản chất động học giải phóng của vi cầu PLGA, khắc phục hiện tượng vỡ vỏ và tạo pha trễ giả tạo do acid phân hủy tích tụ khi dùng môi trường không đệm (Tween 80 0,02%).
  • Cung cấp phương pháp luận toán - tin ứng dụng trong bào chế dược phẩm: tích hợp công cụ DDSolver để lượng hóa chính xác các tham số động học và cơ chế chuyển khối của hệ phân phối thuốc vi cầu peptid, phục vụ công tác R&D dạng thuốc tiêm giải phóng kéo dài.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Hạn chế của đề tài: Do giới hạn về mặt thời gian thực hiện của một khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc đánh giá quá trình giải phóng in vitro ở điều kiện cấp tốc đối với mẫu công thức tối ưu (M8) và đối chiếu với dữ liệu cấp tốc lý thuyết của mẫu Lucrin Depot; chưa kịp thực hiện song song phép thử giải phóng in vitro ở điều kiện dài hạn thực tế kéo dài 56 ngày cho riêng lô vi cầu M8 này.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo: Tiến hành triển khai thử nghiệm giải phóng in vitro dài hạn thực nghiệm (37°C, PBS-TN, 56 ngày) đối với mẫu vi cầu tối ưu M8; sử dụng dữ liệu thực nghiệm thu được để kiểm chứng độc lập độ chính xác dự báo của phương trình tương quan đã xây dựng, đồng thời so sánh trực tiếp với đường cong giải phóng dài hạn thực tế của biệt dược Lucrin® PDS Depot 3,75 mg.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng tham khảo: Sinh viên đại học chuyên ngành Dược học, học viên cao học chuyên ngành Bào chế và Công nghệ dược phẩm, Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất, cùng các nghiên cứu viên tại các trung tâm R&D dược phẩm tham gia phát triển hệ mang thuốc giải phóng kéo dài đường tiêm chứa hoạt chất peptid/protein.
  • Nội dung giá trị nhất:
    • Quy trình chi tiết kỹ thuật nhũ hóa kép kết hợp đông khô để tạo vi cầu PLGA nạp hoạt chất peptid thân nước.
    • Bộ điều kiện phân tích thực nghiệm thẩm định định lượng leuprolid acetat bằng HPLC và quang phổ huỳnh quang.
    • Phương pháp xây dựng tương quan gia tốc nhiệt độ (50°C) kết hợp hệ thống đệm sinh học nhằm rút ngắn chu kỳ kiểm tra giải phóng từ 56 ngày xuống 72 giờ, ứng dụng hiệu quả cho hoạt động kiểm soát chất lượng quy mô phòng thí nghiệm và công nghiệp.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao môi trường Tween 80 0,02% không đệm lại không được lựa chọn để xây dựng tương quan thử giải phóng cấp tốc?

Trong môi trường nước hoặc dung dịch Tween 80 không có hệ đệm, chuỗi polyme PLGA ở nhiệt độ cao (50°C) bị thủy phân giải phóng acid lactic và acid glycolic, làm pH môi trường giảm mạnh. Môi trường acid này đóng vai trò chất xúc tác tự thân làm tăng tốc độ cắt mạch polyme, gây vỡ vi cầu sớm và giải phóng ồ ạt giả tạo trong giai đoạn đầu (ở mẫu M1 lên tới 49,92%, gấp 1,8 lần thực tế), sau đó tạo ra một khoảng dừng giải phóng nhân tạo kéo dài từ 7 đến 24 giờ. Điều này làm sai lệch bản chất động học so với điều kiện thực tế (37°C, pH 7,4). Ngược lại, môi trường PBS-T duy trì pH ổn định nên giữ nguyên được bản chất giải phóng 2 pha hoặc 3 pha của hệ.

2. Mô hình toán học nào mô tả chính xác nhất động học giải phóng dài hạn của mẫu vi cầu M1 và M2?

Mẫu M1 (giải phóng 3 pha) phù hợp nhất với mô hình giải phóng Duvvuri, đạt hệ số xác định $R^2 = 0,9960$ và chỉ số tiêu chuẩn thông tin Akaike nhỏ nhất ($\text{AIC} = 51,9525$). Mô hình này giải thích được cơ chế giải phóng gồm hai giai đoạn phối hợp: giải phóng khuếch tán bậc 1 của thuốc ở lớp ngoài vi cầu và giải phóng dạng sigmoid theo hàm logit khi polyme bị ăn mòn và hydrat hóa. Đối với mẫu M2 (giải phóng 2 pha), mô hình Korsmeyer-Peppas là phù hợp nhất với $R^2 = 0,9752$ và $\text{AIC} = 61,0129$.

3. Việc bổ sung amoni bicarbonat vào công thức vi cầu nhằm mục đích gì và ảnh hưởng như thế nào đến động học giải phóng?

Amoni bicarbonat đóng vai trò là chất tạo lỗ xốp. Dưới tác động cơ học của quá trình nhũ hóa lần 1, muối này phân hủy thành khí $NH_3$ và $CO_2$ thoát ra ngoài, hình thành hệ thống vi mao quản và lỗ xốp dày đặc trên bề mặt và trong lòng vi cầu (được xác nhận qua ảnh chụp SEM). Cấu trúc lỗ xốp này thúc đẩy quá trình khuếch tán dược chất ra ngoài ngay từ giai đoạn đầu, giúp triệt tiêu hoặc rút ngắn pha giải phóng chậm (lag phase), từ đó chuyển đổi đường cong giải phóng sang dạng 2 pha liên tục, giúp công thức M8 đạt độ tương đồng rất cao với mẫu đối chiếu Lucrin Depot ($f_1 = 4,34$ và $f_2 = 75,72$).

4. Phương trình tương quan thiết lập được có ý nghĩa chuyển đổi thời gian và mức độ giải phóng như thế nào?

Hai phương trình tương quan thực nghiệm gồm:

  • Tương quan thời gian: $y = 2,1717x - 7,539$ ($R^2 = 0,9675$) cho phép quy đổi thời gian thử nghiệm cấp tốc ở 50°C ($y$, tính bằng giờ) tương đương với thời gian thử dài hạn ở 37°C ($x$, tính bằng ngày).
  • Tương quan mức độ giải phóng: $y = 1,1055x - 4,8136$ ($R^2 = 0,9282$) cho phép dự báo phần trăm dược chất giải phóng ở điều kiện thực ($x$, %) thông qua kết quả đo nhanh ở điều kiện cấp tốc ($y$, %), giúp dự đoán toàn bộ chu kỳ phóng thích 56 ngày chỉ sau 72 giờ thực nghiệm.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Ngô Giao Thông đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu mô hình hóa động học và thiết lập mối tương quan giải phóng in vitro ở điều kiện dài hạn (37°C, PBS-TN, 56 ngày) và cấp tốc (50°C, PBS-T, 72 giờ) của hệ vi cầu PLGA nạp leuprolid acetat với độ tin cậy thống kê cao ($R^2 > 0,92$). Nghiên cứu đã chứng minh cơ chế ảnh hưởng của môi trường đệm, bản chất phân tử lượng và tỷ lệ monome L/G của PLGA, cũng như vai trò của chất tạo lỗ xốp amoni bicarbonat đối với động học giải phóng peptid. Kết quả sàng lọc thực nghiệm đã xác định được công thức vi cầu M8 có profin giải phóng tương đương cao với biệt dược đối chiếu Lucrin® PDS Depot 3,75 mg ($f_1 = 4,34; f_2 = 75,72$), đóng góp một phương pháp luận thực nghiệm giá trị giúp đẩy nhanh quy trình nghiên cứu, phát triển và kiểm soát chất lượng các dạng thuốc tiêm giải phóng kéo dài tại Việt Nam.