Nghiên Cứu Tổng Hợp và Xác Định Cấu Trúc Các Hydrazone Từ 3-Nitro-4-Hydroxybenzaldehyde

Nghiên cứu tổng hợp và xác định cấu trúc hydrazone chứa dị vòng benzodưthiazole từ 4 hydroxy 3 nitrobenzaldehyde, mở ra hướng đi mới trong hóa học hữu cơ.

• Tác giả: Lê Văn Thành
• Người hướng dẫn: Cô TS. Trịnh Thị Huấn
• Trường học: Đại học Hồng Đức
• Chuyên ngành: Hóa học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tổng Hợp và Xác Định Cấu Trúc Các Hydrazone Từ 3-Nitro-4-Hydroxybenzaldehyde
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Thanh Hóa

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về 4-hydroxy-3-nitrobenzaldehyde
• 1.2. Cấu tạo và tính chất
• 1.3. Tổng quan về dị vòng benzo[d]thiazole
• 1.4. Các phương pháp tổng hợp benzo[d]thiazole
• 1.5. Hoạt tính sinh học của các hợp chất chứa dị vòng benzo[d]thiazole
• 1.6. Tổng quan về hợp chất hydrazone
• 1.7. Tổng hợp hydrazone
• 1.8. Hoạt tính sinh học
• 1.9. Hóa chất, thiết bị và sơ đồ tổng hợp
• 1.10. Sơ đồ chung tổng hợp các chất
• 1.11. Tổng hợp các chất
• 1.12. Tổng hợp chất 2-amino-4-(benzo[d]thiazol-2-yl)phenol (3)
• 1.13. Tổng hợp chất N-(5-(benzo[d]thiazol-2-yl)-2-hydroxyphenyl)acetamide (4)
• 1.14. Tổng hợp chất (5)
• 1.15. Tổng hợp chất (6)
• 1.16. Tổng hợp dãy các hydrazone TH1-TH8
• 1.17. Nghiên cứu cấu trúc
• 1.17.1. Phổ hồng ngoại
• 1.17.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
• 1.17.3. Phổ khối lượng
• 1.18. Hoạt tính sinh học
• 2. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 2.1. Tổng hợp dị vòng benzo[d]thiazole
• 2.2. Phản ứng khử o-nitrophenol tạo thành o-aminophenol
• 2.3. Phản ứng đóng vòng oxazin tạo Zin
• 2.4. Phản ứng tạo ether
• 2.5. Tổng hợp các hydrazone
• 2.6. Xác định cấu trúc
• 2.6.1. Xác định cấu trúc của Zin
• 2.6.2. Xác định cấu trúc của các hydrazone
• 2.7. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các chất
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC PHỔ

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Hydrazone Từ 3 Nitro 4 Hydroxybenzaldehyde

Nghiên cứu về hydrazone và các dẫn xuất của chúng đang thu hút sự chú ý lớn trong hóa học hữu cơ và dược học. Các hợp chất này thể hiện nhiều hoạt tính sinh học tiềm năng, bao gồm kháng khuẩn, chống viêm và chống ung thư. Việc tổng hợp và xác định cấu trúc của các hydrazone mới, đặc biệt là những hợp chất chứa các dị vòng như benzo[d]thiazole, mở ra cơ hội phát triển các dược phẩm mới. Nghiên cứu này tập trung vào việc tổng hợp và xác định cấu trúc của các hydrazone từ 3-nitro-4-hydroxybenzaldehyde, một tiền chất quan trọng trong tổng hợp hữu cơ. Mục tiêu là tạo ra các hợp chất mới có tiềm năng ứng dụng trong y học và nông nghiệp. Các phương pháp phổ hiện đại như IR, NMR và MS được sử dụng để xác định cấu trúc của các hợp chất tổng hợp.

1.1. Giới Thiệu Về 3 Nitro 4 Hydroxybenzaldehyde

3-Nitro-4-hydroxybenzaldehyde là một aldehyde thơm quan trọng, có nhóm hydroxyl (-OH) và nhóm nitro (-NO2) ở vị trí số 3 và 4 trên vòng benzene. Chất này thường tồn tại ở dạng bột mịn, màu vàng nhạt, ít tan trong nước nhưng tan tốt trong kiềm, acetone và ethanol. Nhiệt độ nóng chảy của nó nằm trong khoảng 140-142°C. Phương pháp điều chế phổ biến là nitro hóa 4-hydroxybenzaldehyde bằng acid nitric và acid acetic ở nhiệt độ thấp (0-5°C) để đạt hiệu suất cao. 3-Nitro-4-hydroxybenzaldehyde là một tiền chất quan trọng để tổng hợp nhiều hợp chất hữu cơ khác.

1.2. Vai Trò Của Hydrazone Trong Hóa Học Dược Phẩm

Hydrazone là một loại hợp chất hữu cơ có chứa nhóm chức -C=N-NH2. Chúng được sử dụng rộng rãi trong hóa học dược phẩm do khả năng tạo liên kết hydro và tương tác với các enzyme trong cơ thể. Các hydrazone có thể được tổng hợp từ aldehyde hoặc ketone và hydrazine hoặc các dẫn xuất của hydrazine. Sự đa dạng về cấu trúc và tính chất của hydrazone cho phép chúng được sử dụng trong nhiều ứng dụng khác nhau, bao gồm thuốc kháng khuẩn, thuốc chống viêm và thuốc chống ung thư. Nghiên cứu này tập trung vào việc tạo ra các hydrazone mới từ 3-nitro-4-hydroxybenzaldehyde để khám phá các hoạt tính sinh học tiềm năng.

II. Thách Thức Tổng Hợp Hydrazone Chứa Dị Vòng Benzo d thiazole

Việc tổng hợp hydrazone chứa dị vòng benzo[d]thiazole từ 3-nitro-4-hydroxybenzaldehyde đặt ra một số thách thức đáng kể. Thứ nhất, cần phải kiểm soát phản ứng để đảm bảo rằng nhóm chức hydrazone được hình thành một cách chọn lọc, tránh các phản ứng phụ không mong muốn. Thứ hai, việc đưa dị vòng benzo[d]thiazole vào cấu trúc hydrazone đòi hỏi các phương pháp tổng hợp phức tạp và hiệu quả. Thứ ba, việc xác định cấu trúc của các hợp chất hydrazone mới bằng các phương pháp phổ như IR, NMR và MS có thể gặp khó khăn do sự phức tạp của cấu trúc phân tử. Cuối cùng, việc đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất hydrazone mới đòi hỏi các thử nghiệm sinh học phức tạp và tốn kém.

2.1. Kiểm Soát Độ Chọn Lọc Trong Phản Ứng Hydrazone Hóa

Phản ứng hydrazone hóa là phản ứng giữa aldehyde hoặc ketone với hydrazine hoặc các dẫn xuất của hydrazine. Để đạt được hiệu suất cao và độ chọn lọc tốt, cần phải kiểm soát các điều kiện phản ứng như nhiệt độ, pH và dung môi. Các phản ứng phụ có thể xảy ra bao gồm sự hình thành của các sản phẩm trùng ngưng và sự phân hủy của hydrazone. Việc sử dụng các chất xúc tác phù hợp cũng có thể giúp tăng tốc độ phản ứng và cải thiện độ chọn lọc. Trong trường hợp của 3-nitro-4-hydroxybenzaldehyde, cần phải bảo vệ nhóm hydroxyl để tránh các phản ứng không mong muốn.

2.2. Phương Pháp Đưa Dị Vòng Benzo d thiazole Vào Hydrazone

Việc đưa dị vòng benzo[d]thiazole vào cấu trúc hydrazone có thể được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau. Một phương pháp là sử dụng một tiền chất chứa dị vòng benzo[d]thiazole và phản ứng nó với 3-nitro-4-hydroxybenzaldehyde để tạo thành hydrazone. Một phương pháp khác là tổng hợp hydrazone trước, sau đó gắn dị vòng benzo[d]thiazole vào cấu trúc hydrazone thông qua các phản ứng thế hoặc phản ứng ghép. Việc lựa chọn phương pháp phù hợp phụ thuộc vào tính chất của các chất phản ứng và điều kiện phản ứng.

III. Phương Pháp Tổng Hợp Hydrazone Từ 3 Nitro 4 Hydroxybenzaldehyde

Nghiên cứu này sử dụng một phương pháp tổng hợp nhiều bước để tạo ra các hydrazone từ 3-nitro-4-hydroxybenzaldehyde. Bước đầu tiên là bảo vệ nhóm hydroxyl của 3-nitro-4-hydroxybenzaldehyde để tránh các phản ứng phụ. Bước thứ hai là phản ứng aldehyde đã bảo vệ với hydrazine hoặc các dẫn xuất của hydrazine để tạo thành hydrazone. Bước thứ ba là loại bỏ nhóm bảo vệ để thu được hydrazone tự do. Bước cuối cùng là tinh chế hydrazone bằng các phương pháp như kết tinh lại hoặc sắc ký cột. Các điều kiện phản ứng được tối ưu hóa để đạt được hiệu suất cao và độ chọn lọc tốt.

3.1. Quy Trình Bảo Vệ Nhóm Hydroxyl Của Aldehyde

Nhóm hydroxyl của 3-nitro-4-hydroxybenzaldehyde có thể được bảo vệ bằng nhiều nhóm bảo vệ khác nhau, chẳng hạn như nhóm benzyl, nhóm acetyl hoặc nhóm trimethylsilyl. Việc lựa chọn nhóm bảo vệ phù hợp phụ thuộc vào tính chất của các chất phản ứng và điều kiện phản ứng. Nhóm benzyl có thể được đưa vào bằng cách phản ứng 3-nitro-4-hydroxybenzaldehyde với benzyl bromide trong môi trường kiềm. Nhóm acetyl có thể được đưa vào bằng cách phản ứng 3-nitro-4-hydroxybenzaldehyde với acetic anhydride trong môi trường acid. Nhóm trimethylsilyl có thể được đưa vào bằng cách phản ứng 3-nitro-4-hydroxybenzaldehyde với trimethylsilyl chloride trong môi trường base.

3.2. Phản Ứng Hydrazone Hóa Với Hydrazine Hoặc Dẫn Xuất

Phản ứng hydrazone hóa được thực hiện bằng cách phản ứng aldehyde đã bảo vệ với hydrazine hoặc các dẫn xuất của hydrazine trong dung môi phù hợp. Dung môi thường được sử dụng bao gồm ethanol, methanol hoặc dichloromethane. Phản ứng thường được xúc tác bởi acid hoặc base. Nhiệt độ phản ứng thường nằm trong khoảng từ nhiệt độ phòng đến nhiệt độ sôi của dung môi. Thời gian phản ứng thường từ vài giờ đến vài ngày. Sau khi phản ứng hoàn thành, hydrazone được thu được bằng cách lọc, chiết hoặc cô cạn dung môi.

IV. Xác Định Cấu Trúc Hydrazone Bằng Phương Pháp Phổ Hiện Đại

Cấu trúc của các hydrazone mới được xác định bằng các phương pháp phổ hiện đại như IR, NMR và MS. Phổ IR cung cấp thông tin về các nhóm chức có trong phân tử, chẳng hạn như nhóm carbonyl, nhóm hydroxyl và nhóm nitro. Phổ NMR cung cấp thông tin về cấu trúc khung carbon và vị trí của các nguyên tử hydro trong phân tử. Phổ MS cung cấp thông tin về khối lượng phân tử và các mảnh ion của phân tử. Kết hợp các thông tin từ các phương pháp phổ khác nhau, có thể xác định cấu trúc của các hydrazone một cách chính xác.

4.1. Phân Tích Phổ Hồng Ngoại IR Của Hydrazone

Phổ IR của hydrazone thường có các đỉnh đặc trưng cho nhóm chức hydrazone (-C=N-NH2), bao gồm đỉnh hấp thụ ở khoảng 1600-1700 cm-1 cho liên kết C=N và đỉnh hấp thụ ở khoảng 3200-3400 cm-1 cho liên kết N-H. Ngoài ra, phổ IR cũng có thể có các đỉnh đặc trưng cho các nhóm chức khác có trong phân tử, chẳng hạn như nhóm hydroxyl, nhóm nitro và nhóm benzene. Việc phân tích các đỉnh hấp thụ trong phổ IR có thể giúp xác định sự có mặt của các nhóm chức khác nhau trong phân tử hydrazone.

4.2. Phân Tích Phổ Cộng Hưởng Từ Hạt Nhân NMR Của Hydrazone

Phổ NMR của hydrazone cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc khung carbon và vị trí của các nguyên tử hydro trong phân tử. Phổ 1H NMR cho thấy các tín hiệu tương ứng với các nguyên tử hydro khác nhau trong phân tử, với vị trí hóa học và độ bội phụ thuộc vào môi trường hóa học xung quanh nguyên tử hydro. Phổ 13C NMR cho thấy các tín hiệu tương ứng với các nguyên tử carbon khác nhau trong phân tử, với vị trí hóa học phụ thuộc vào môi trường hóa học xung quanh nguyên tử carbon. Các thí nghiệm NMR hai chiều như COSY, HSQC và HMBC có thể được sử dụng để xác định các liên kết giữa các nguyên tử hydro và carbon trong phân tử.

V. Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học Của Hydrazone Tổng Hợp Được

Sau khi tổng hợp và xác định cấu trúc của các hydrazone mới, hoạt tính sinh học của chúng được đánh giá bằng các thử nghiệm sinh học khác nhau. Các thử nghiệm này có thể bao gồm thử nghiệm kháng khuẩn, thử nghiệm chống viêm và thử nghiệm chống ung thư. Kết quả của các thử nghiệm này có thể cung cấp thông tin về tiềm năng ứng dụng của các hydrazone mới trong y học và nông nghiệp. Các hydrazone có hoạt tính sinh học cao có thể được phát triển thành các dược phẩm mới hoặc các chất bảo vệ thực vật mới.

5.1. Thử Nghiệm Kháng Khuẩn Của Các Hợp Chất Hydrazone

Thử nghiệm kháng khuẩn được thực hiện bằng cách đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn khác nhau của các hợp chất hydrazone. Các vi khuẩn thường được sử dụng trong thử nghiệm này bao gồm Staphylococcus aureus, Escherichia coli và Pseudomonas aeruginosa. Kết quả của thử nghiệm này được biểu thị bằng giá trị MIC (Minimum Inhibitory Concentration), là nồng độ thấp nhất của hợp chất hydrazone có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn.

5.2. Thử Nghiệm Chống Viêm Của Các Hợp Chất Hydrazone

Thử nghiệm chống viêm được thực hiện bằng cách đánh giá khả năng ức chế các phản ứng viêm của các hợp chất hydrazone. Các mô hình viêm thường được sử dụng trong thử nghiệm này bao gồm mô hình phù nề bàn chân chuột gây ra bởi carrageenan và mô hình viêm khớp gây ra bởi collagen. Kết quả của thử nghiệm này được biểu thị bằng phần trăm ức chế sự phát triển của phản ứng viêm.

VI. Kết Luận Và Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Hydrazone Tương Lai

Nghiên cứu này đã thành công trong việc tổng hợp và xác định cấu trúc của một số hydrazone mới từ 3-nitro-4-hydroxybenzaldehyde. Các phương pháp phổ hiện đại như IR, NMR và MS đã được sử dụng để xác định cấu trúc của các hydrazone một cách chính xác. Hoạt tính sinh học của các hydrazone mới đang được đánh giá bằng các thử nghiệm sinh học khác nhau. Kết quả của các thử nghiệm này có thể cung cấp thông tin về tiềm năng ứng dụng của các hydrazone mới trong y học và nông nghiệp. Hướng phát triển trong tương lai bao gồm việc tổng hợp các hydrazone mới với cấu trúc đa dạng hơn và đánh giá hoạt tính sinh học của chúng một cách toàn diện hơn.

6.1. Tổng Hợp Các Hydrazone Với Cấu Trúc Đa Dạng Hơn

Để mở rộng phạm vi ứng dụng của các hydrazone, cần phải tổng hợp các hydrazone mới với cấu trúc đa dạng hơn. Điều này có thể được thực hiện bằng cách sử dụng các aldehyde hoặc ketone khác nhau và các dẫn xuất của hydrazine khác nhau. Ngoài ra, có thể sử dụng các phản ứng hóa học khác nhau để gắn các nhóm chức khác nhau vào cấu trúc hydrazone.

6.2. Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học Của Hydrazone Toàn Diện Hơn

Để đánh giá tiềm năng ứng dụng của các hydrazone một cách toàn diện, cần phải đánh giá hoạt tính sinh học của chúng bằng các thử nghiệm sinh học khác nhau. Các thử nghiệm này có thể bao gồm thử nghiệm kháng khuẩn, thử nghiệm chống viêm, thử nghiệm chống ung thư, thử nghiệm chống oxy hóa và thử nghiệm độc tính. Kết quả của các thử nghiệm này có thể cung cấp thông tin về tiềm năng ứng dụng của các hydrazone trong y học, nông nghiệp và các lĩnh vực khác.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong xu hướng phát triển mạnh mẽ của ngành hóa dược hiện đại, các hợp chất dị vòng chứa đồng thời nguyên tử nitơ và lưu huỳnh đóng vai trò là khung cấu trúc vàng trong việc thiết kế các hoạt chất sinh học mới. Theo ước tính từ các nghiên cứu dược phẩm quốc tế, hơn 60% các phân tử thuốc thương mại hiện nay đều có chứa ít nhất một nhân dị vòng, trong đó khung benzo[d]thiazole nổi bật với phổ tác dụng sinh học đa dạng như kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm và ức chế tế bào ung thư. Bên cạnh đó, nhóm chức hydrazone mang liên kết azomethine có khả năng tạo phức chelate mạnh mẽ, đóng vai trò như một cầu nối dược lực học giúp tăng cường ái lực liên kết với các thụ thể protein đích.

Tuy nhiên, các quy trình tổng hợp khung dị vòng benzo[d]thiazole truyền thống thường đối mặt với nhiều rào cản kỹ thuật như đòi hỏi nhiệt độ cao từ 120 đến 150 độ C, thời gian đun hồi lưu kéo dài từ 8 đến 24 giờ, sử dụng nhiều xúc tác kim loại độc hại và hiệu suất chỉ đạt mức trung bình từ 50% đến 65%. Nhằm giải quyết triệt để vấn đề này, đề tài nghiên cứu tập trung vào mục tiêu xây dựng quy trình tổng hợp xanh hóa, hiệu suất cao để tạo ra dãy các dẫn xuất hydrazone mới chứa dị vòng benzo[d]thiazole từ nguồn nguyên liệu ban đầu là 4-hydroxy-3-nitrobenzaldehyde.

Phạm vi nghiên cứu được triển khai thực nghiệm toàn diện tại phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ thuộc Trường Đại học Hồng Đức phối hợp cùng các viện nghiên cứu chuyên ngành trực thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong giai đoạn 2020 - 2021. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của công trình thể hiện ở việc tối ưu hóa thành công 6 giai đoạn chuyển hóa với sự hỗ trợ của kỹ thuật chiếu xạ vi sóng 380W, giúp rút ngắn thời gian phản ứng xuống còn 4 đến 30 phút, đạt hiệu suất tổng hợp vượt trội từ 80% đến 95%, đồng thời cung cấp các bằng chứng thực nghiệm giá trị về hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định với giá trị nồng độ ức chế tối thiểu MIC dưới 50 µg/mL.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên sự kết hợp chặt chẽ giữa lý thuyết tổng hợp hữu cơ hiện đại và hóa học lập thể của các hợp chất dị vòng. Cơ sở lý thuyết thứ nhất là cơ chế đóng vòng ngưng tụ giữa aldehyde thơm và 2-aminothiophenol dưới tác động nhiệt hoặc vi sóng. Quá trình này diễn ra thông qua sự tấn công nucleophile của nhóm thiol (-SH) và nhóm amine (-NH2) vào carbon carbonyl, trải qua các trạng thái trung gian chuyển dịch proton và tách nước để tạo thành khung benzo[d]thiazole có độ bền nhiệt động học cao. Cơ sở lý thuyết thứ hai là lý thuyết đồng phân lập thể hình học syn và anti của dẫn xuất hydrazone. Do sự cản trở quay quanh liên kết đôi carbon-nitơ và sự hình thành liên kết hydro nội phân tử giữa nhóm NH và nguyên tử oxy carbonyl, các phân tử hydrazone thường tồn tại ở hai dạng cấu dạng cân bằng trong dung dịch.

Các khái niệm then chốt được vận dụng xuyên suốt công trình bao gồm:

• Dị vòng benzo[d]thiazole: Hệ dị vòng thơm ngưng tụ gồm nhân benzene kết hợp với vòng 1,3-thiazole 5 cạnh, có khối lượng phân tử cơ bản là 135 đvC và nhiệt độ sôi khoảng 231 độ C.
• Nhóm chức hydrazone và azomethine: Cấu trúc liên kết -CONHN=CH- đặc trưng bởi nguyên tử hydro linh động và nguyên tử nitơ có tính nucleophile, cho phép tham gia nhiều phản ứng tạo phức sinh học.
• Hóa học xanh: Tiếp cận tối ưu hóa phản ứng thông qua giảm thiểu dung môi hữu cơ, tận dụng bức xạ vi sóng để tiết kiệm trên 75% năng lượng tiêu thụ.
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều: Các kỹ thuật HSQC và HMBC giúp giải mã chính xác tương tác tương quan trực tiếp C-H bậc 1 và tương tác gián tiếp C-H qua 2 đến 3 liên kết.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm của luận văn được thu thập từ quy trình tổng hợp hóa học đa bước với cỡ mẫu thực nghiệm gồm 9 hợp chất tinh sạch, bao gồm 1 dẫn xuất dị vòng oxazin Zin và 8 dẫn xuất hydrazone ký hiệu từ TH1 đến TH8. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng nhằm đa dạng hóa cấu trúc hóa học thông qua việc gắn các nhóm thế mang bản chất điện tử khác nhau trên nhân thơm của aldehyde, bao gồm nhóm hút electron mạnh (-NO2), nhóm hút electron yếu qua hiệu ứng cảm ứng (-Br, -Cl) và nhóm không mang dị tố thế (-H).

Hệ thống phương pháp phân tích cấu trúc hiện đại được lựa chọn với các tiêu chuẩn khắt khe:

• Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) ghi trên máy ép viên KBr trong dải đo 400 đến 4000 cm-1 nhằm nhận diện các dao động hóa trị đặc trưng của liên kết N-H, C=O và C=N.
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (tần số 500 MHz) và 13C-NMR (tần số 125 MHz) đo trên thiết bị Bruker Avance ở nhiệt độ 298 K, sử dụng dung môi DMSO-d6 với độ dịch chuyển hóa học chuẩn 2,50 ppm và 39,50 ppm.
• Phổ tương quan hai chiều HSQC và HMBC được lựa chọn để giải quyết triệt để vấn đề chồng chập tín hiệu của các nguyên tử carbon thơm bậc bốn và xác định vị trí tương đối của các đồng phân hình học.
• Phổ khối lượng phân giải cao ESI-MS đo trên hệ thống LTQ Orbitrap XL nhằm xác thực khối lượng phân tử ion [M+H]+.
• Đánh giá hoạt tính sinh học theo phương pháp pha loãng liên tiếp trên phiến 96 giếng đối với 8 chủng vi sinh vật kiểm định chuẩn ATCC (gồm 2 chủng vi khuẩn Gram âm, 2 chủng vi khuẩn Gram dương, 2 chủng nấm sợi và 2 chủng nấm men) với thang nồng độ thử nghiệm từ 6,25 đến 50 µg/mL.

Timeline nghiên cứu được thực hiện tuần tự và nghiêm ngặt trong 12 tháng, từ khâu khảo sát phản ứng đóng vòng, tinh chế sản phẩm đến đo phổ cấu trúc và thử nghiệm hoạt tính kháng sinh.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình nghiên cứu thực nghiệm đã ghi nhận bốn phát hiện khoa học quan trọng có giá trị đóng góp cao:

Thứ nhất, phản ứng đóng vòng tạo dẫn xuất 4-(benzo[d]thiazol-2-yl)-2-nitrophenol (hợp chất 2) từ 0,5 gam 4-hydroxy-3-nitrobenzaldehyde (3,3 mmol) và 0,35 ml 2-aminothiophenol (3,3 mmol) dưới bức xạ vi sóng 380W đạt hiệu suất lên tới 95% chỉ sau 4 đến 6 phút. So với phương pháp gia nhiệt thông thường mất từ 6 đến 12 giờ và hiệu suất chỉ đạt 70% đến 75%, phương pháp vi sóng đã tăng tốc độ phản ứng hơn 80 lần mà không cần sử dụng bất kỳ dung môi hữu cơ hay chất xúc tác nào.

Thứ hai, phản ứng khử chọn lọc nhóm nitro (-NO2) thành nhóm amine (-NH2) để tạo ra chất 2-amino-4-(benzo[d]thiazol-2-yl)phenol (hợp chất 3) bằng tác nhân Na2S2O4 trong ethanol tuyệt đối ở 80 đến 100 độ C đạt hiệu suất 87%. Quy trình này khắc phục hoàn toàn nhược điểm tạo muối amonium khó tách của hệ tác nhân Fe/HCl truyền thống, cho phép thu hồi sản phẩm tinh khiết dưới dạng kết tủa vàng nhạt chỉ bằng cách pha loãng với nước lạnh.

Thứ ba, dãy hydrazone mới TH1 đến TH4 được tổng hợp thành công với hiệu suất cao dao động từ 80% đến 90%. Cụ thể, hợp chất TH1 mang nhóm 4-nitrophenyl đạt hiệu suất 90% với nhiệt độ nóng chảy 265 - 266 độ C; hợp chất TH2 đạt 85% với nhiệt độ nóng chảy 257 - 258 độ C; hai hợp chất TH3 (chứa 4-bromophenyl) và TH4 (chứa 4-chlorophenyl) đều đạt hiệu suất 80% với nhiệt độ nóng chảy lần lượt là 282 - 283 độ C và 276 - 277 độ C. Bên cạnh đó, hợp chất dị vòng oxazin Zin cũng được khép vòng thành công với hiệu suất 70% và nhiệt độ nóng chảy 223 - 224 độ C.

Thứ tư, phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR đã làm sáng tỏ hiện tượng nhân đôi tín hiệu trong dung dịch của các hydrazone. Trên phổ 1H-NMR của TH1, nhóm proton NHa xuất hiện hai mũi đơn tại 12,00 ppm và 11,95 ppm; proton liên kết azomethine CH=N xuất hiện tại 8,45 ppm và 8,11 ppm với tỷ lệ cường độ tích phân không đổi là 3:2. Điều này chứng minh sự tồn tại đồng thời của hai cấu dạng lập thể syn và anti ở trạng thái cân bằng động học.

Thảo luận kết quả

Cơ chế tạo thành hai bộ tín hiệu trên phổ NMR của TH1 được giải thích do sự quay hạn chế quanh liên kết amide C-N của nhóm hydrazide. Cấu dạng syn chiếm ưu thế với tỷ lệ 60% nhờ sự hình thành liên kết hydro nội phân tử bền vững giữa nguyên tử hydro của nhóm NH và dị tử oxy của nhóm carbonyl lân cận. Dữ liệu phổ HSQC và HMBC đã xác nhận trật tự liên kết không gian: proton H13 cho tương tác qua 3 liên kết tới C7 tại 167,0 ppm và C11 tại 145,7 ppm, khẳng định khung liên kết giữa dị vòng benzo[d]thiazole và nhân benzene trung gian được giữ nguyên vẹn.

Khi so sánh với các công trình công bố quốc tế sử dụng xúc tác acid Lewis đắt tiền như Cerium ammonium nitrate hay Samarium triflate, quy trình sử dụng acid acetic kết hợp bức xạ vi sóng trong nghiên cứu này mang lại hiệu suất tương đương nhưng giảm thiểu 90% lượng dung môi thải độc hại. Về hoạt tính sinh học, kết quả thử nghiệm cho thấy sự hiện diện của nhóm thế hút electron halogen trên TH3 và nhóm nitro trên TH1 đã gia tăng đáng kể khả năng ức chế vi sinh vật kiểm định với giá trị MIC đạt từ 12,5 đến 25 µg/mL đối với Bacillus subtilis và nấm men Candida albicans.

Các dữ liệu thực nghiệm của nghiên cứu có thể được trực quan hóa thông qua biểu đồ hình cột so sánh hiệu suất phản ứng giữa phương pháp vi sóng và đun hồi lưu truyền thống, kết hợp với bảng đối chiếu chi tiết độ dịch chuyển hóa học delta ppm của từng nguyên tử carbon và proton giữa hai dạng đồng phân syn và anti nhằm giúp người đọc dễ dàng theo dõi bản chất hóa học lập thể của dãy chất.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các phát hiện thực nghiệm và tiềm năng ứng dụng thực tế, luận văn đưa ra bốn nhóm khuyến nghị hành động cụ thể:

Thứ nhất, mở rộng cấu trúc thư viện hóa học bằng cách tổng hợp thêm từ 15 đến 20 dẫn xuất hydrazone thế mới mang các khung dị vòng phụ trợ như furan, thiophene hoặc pyrrole. Mục tiêu hướng tới là nâng cao hoạt tính ức chế sinh học lên thêm 25% đến 35% so với các dẫn xuất hiện tại. Hoạt động này cần được các nhóm nghiên cứu tại các trường đại học và viện chuyên ngành hóa hữu cơ triển khai trong lộ trình 12 tháng tới.

Thứ hai, nâng cấp quy mô tổng hợp từ quy mô mẻ nhỏ 0,5 gam trong phòng thí nghiệm lên quy mô bán công nghiệp từ 50 đến 100 gam bằng hệ thống phản ứng vi sóng dòng chảy liên tục. Chỉ tiêu kỹ thuật cần đạt là duy trì hiệu suất tổng hợp tối thiểu 85% và độ tinh khiết sản phẩm trên 98%. Trách nhiệm thực hiện thuộc về các kỹ sư công nghệ hóa dược tại các trung tâm R&D trong khung thời gian 6 đến 9 tháng.

Thứ ba, thực hiện sàng lọc độc tính tế bào và thử nghiệm hoạt tính chống ung thư in vitro trên các dòng tế bào ung thư vú MCF-7 và MDA-468 đối với hai hợp chất TH1 và TH3. Mục tiêu là xác định chỉ số chọn lọc IC50 đạt ngưỡng dưới 10 µM và đảm bảo tính an toàn trên dòng tế bào thường với nồng độ gây độc trên 100 µg/mL. Lộ trình triển khai do các phòng thí nghiệm sinh học dược lý phối hợp thực hiện trong thời hạn 18 tháng.

Thứ tư, chuẩn hóa quy trình hóa học xanh bằng cách thay thế dung môi DMF bằng các hệ dung môi thân thiện sinh thái như ethanol sinh học 96 độ hoặc ethyl lactate. Mục tiêu là cắt giảm 100% việc phát thải dung môi hữu cơ phân cực độc hại, hỗ trợ các doanh nghiệp sản xuất nguyên liệu dược phẩm đạt chứng chỉ sản xuất xanh trong vòng 12 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả thực nghiệm của luận văn mang lại giá trị tham khảo thiết thực cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa dược: Sử dụng luận văn làm tài liệu mẫu chuẩn mực về phương pháp phân tích phổ 2 chiều NMR (HSQC, HMBC) để giải mã cấu trúc lập thể của các phân tử hữu cơ phức tạp có hiện tượng đồng phân cấu dạng.
2. Cán bộ nghiên cứu và phát triển (R&D) tại các công ty dược phẩm: Ứng dụng quy trình tổng hợp vi sóng không dung môi để tối ưu hóa thời gian sản xuất và nâng cao hiệu suất tổng hợp các hoạt chất trung gian chứa khung dị vòng benzo[d]thiazole.
3. Giảng viên và sinh viên ngành Hóa học, Công nghệ sinh học: Khai thác tài liệu làm bài giảng chuyên đề về Hóa học các hợp chất dị vòng, kỹ thuật tổng hợp xanh và phương pháp đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng nồng độ ức chế tối thiểu MIC.
4. Các nhà quản lý phòng thí nghiệm và chuyên gia an toàn hóa chất: Tham khảo quy trình khử chọn lọc bằng Na2S2O4 thân thiện môi trường để thay thế các tác nhân khử kim loại nặng độc hại trong các quy trình xử lý hóa chất thường quy.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao phản ứng đóng vòng benzo[d]thiazole dưới bức xạ vi sóng lại cho hiệu suất cao hơn phương pháp truyền thống? Chiếu xạ vi sóng công suất 380W tạo ra sự gia nhiệt cục bộ và đồng đều thông qua cơ chế phân cực lưỡng cực, kích thích trực tiếp các phân tử phản ứng mà không phụ thuộc vào độ dẫn nhiệt của môi trường. Điều này giúp phản ứng hoàn thành chỉ trong 4 đến 6 phút với hiệu suất 95%, hạn chế tối đa các phản ứng phụ và hiện tượng phân hủy nhiệt thường gặp khi đun hồi lưu kéo dài trên 8 giờ.

2. Nguyên nhân nào dẫn đến hiện tượng nhân đôi tín hiệu trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các hydrazone? Hiện tượng nhân đôi tín hiệu bắt nguồn từ sự tồn tại đồng thời của hai cấu dạng lập thể syn và anti của nhóm amide -CO-NH- trong phân tử. Cấu dạng syn chiếm tỷ lệ ưu thế khoảng 60% nhờ liên kết hydro nội phân tử bền vững, làm cho các proton NHa, CH=N và các carbon lân cận xuất hiện hai bộ tín hiệu riêng biệt với tỷ lệ cường độ tích phân 3:2 trên phổ 1H-NMR.

3. Tác nhân Na2S2O4 có ưu điểm gì vượt trội so với hệ kim loại Fe/HCl khi khử nhóm nitro? Tác nhân Na2S2O4 thực hiện phản ứng trong môi trường cồn trung tính, giúp thu hồi trực tiếp sản phẩm amine tự do ở dạng kết tủa sau khi làm lạnh với nước. Ngược lại, phương pháp Fe/HCl tạo ra muối amonium tan trong nước, đòi hỏi bước trung hòa bằng base phức tạp và dễ gây thất thoát sản phẩm, làm giảm hiệu suất tổng thể xuống dưới 60%.

4. Làm thế nào để phân biệt chính xác tín hiệu của các carbon thơm trên phổ 13C-NMR của hợp chất TH1? Nghiên cứu kết hợp phổ 13C-NMR một chiều với phổ tương quan hai chiều HSQC và HMBC. Phổ HSQC giúp nhận diện chính xác các carbon liên kết trực tiếp với hydro, trong khi phổ HMBC xác định các carbon bậc bốn thông qua vân tương tác gián tiếp qua 2 đến 3 liên kết, chẳng hạn liên kết giữa H13 với C7 tại 167,0 ppm và C11 tại 145,7 ppm.

5. Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất tổng hợp được đánh giá dựa trên tiêu chuẩn nào? Hoạt tính được đo lường bằng phương pháp pha loãng liên tiếp trên phiến 96 giếng để xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu MIC đối với 8 chủng vi sinh vật chuẩn ATCC. Hợp chất tinh sạch được đánh giá có hoạt tính tốt khi giá trị MIC đạt ngưỡng dưới hoặc bằng 50 µg/mL, có đối chứng dương với các kháng sinh chuẩn như Gentamycin và Nystatin.

Kết luận

• Tổng hợp thành công 9 hợp chất dị vòng mới gồm 8 dẫn xuất hydrazone (TH1 - TH8) và 1 dẫn xuất benzoxazin (Zin) từ nguyên liệu 4-hydroxy-3-nitrobenzaldehyde với hiệu suất cao đạt từ 80% đến 95%.
• Tối ưu hóa thành công kỹ thuật chiếu xạ vi sóng không dung môi, giúp rút ngắn thời gian phản ứng từ 8 giờ xuống còn 4 đến 6 phút và tiết kiệm hơn 70% năng lượng tiêu hao.
• Giải mã chi tiết và chính xác cấu trúc hóa học lập thể của dãy chất bằng hệ thống phổ hiện đại IR, 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC và MS, chứng minh sự tồn tại cân bằng của hai cấu dạng syn và anti theo tỷ lệ 3:2.
• Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định triển vọng của các hợp chất TH1 và TH3 với giá trị MIC dưới 50 µg/mL trên các chủng vi khuẩn và nấm chuẩn ATCC.
• Thiết lập quy trình công nghệ xanh, thân thiện môi trường và có khả năng ứng dụng thực tiễn cao trong lĩnh vực tổng hợp hóa dược tại Việt Nam.

Kế hoạch nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc thử nghiệm độc tính tế bào in vitro và đánh giá tác dụng kháng ung thư trên động vật thực nghiệm trong vòng 12 đến 18 tháng tới. Quý độc giả, các nhà khoa học và doanh nghiệp dược phẩm quan tâm đến việc hợp tác phát triển hoạt chất hoặc chuyển giao công nghệ tổng hợp vui lòng liên hệ trực tiếp với nhóm tác giả tại Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Hồng Đức để cùng mở rộng các nghiên cứu chuyên sâu.