Giới thiệu dự án

Hóa học dị vòng (heterocyclic chemistry) là lĩnh vực nghiên cứu cốt lõi trong hóa học hữu cơ hiện đại, đóng vai trò quyết định trong ngành dược phẩm toàn cầu — ước tính hơn 60% các loại thuốc được phê duyệt hiện nay chứa ít nhất một vòng dị vòng trong cấu trúc phân tử. Trong đó, các hợp chất lai ghép chứa đồng thời vòng pyrimidine, 1,2,4-triazole và 1,3,4-thiadiazepine đang được cộng đồng khoa học quốc tế đặc biệt quan tâm nhờ phổ hoạt tính sinh học rộng và tiềm năng ứng dụng lớn trong y học.

Vấn đề cốt lõi mà nghiên cứu này hướng đến giải quyết là: thiếu hụt các phương pháp tổng hợp hiệu quả cho hợp chất lai ghép pyrimidine–triazole–thiadiazepine với quy trình ngắn gọn, nguyên liệu dễ kiếm và hiệu suất ổn định, đồng thời chưa có đủ dữ liệu về hoạt tính sinh học của các dẫn xuất thiadiazepine mới từ khung triazole-thiol.

Mục tiêu cụ thể của đề tài:

  1. Tổng hợp hợp chất nền 4-amino-5-{[(4,6-dimethylpyrimidin-2-yl)sulfanyl]methyl}-1,2,4-triazole-3-thiol (N₄) qua chuỗi phản ứng 4 bước từ thiourea và acetylacetone.
  2. Chuyển hóa N₄ với các dẫn xuất 2-chloroquinoline-3-carbaldehyde (X = H, Cl, CH₃) tạo thành ba dẫn xuất thiadiazepine mới (N₅, N₆, N₇).
  3. Xác định cấu trúc phân tử bằng phổ IR (FTIR-8400S Shimadzu) và ¹H-NMR (Bruker AC 500MHz, DMSO-d₆).
  4. Thăm dò hoạt tính kháng khuẩn với Escherichia coli và Bacillus subtilis theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch.

Chiến lược tiếp cận được lựa chọn là tổng hợp hội tụ (convergent synthesis) — xây dựng song song hai phần cấu trúc (khung pyrimidine-thiol và vòng triazole-thiol), sau đó ghép nối và đóng vòng thiadiazepine trong một bước phản ứng đồng thời ở cả nhóm –NH₂ và –SH.

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

So sánh các phương pháp tổng hợp dị vòng thiadiazepine hiện có:

Phương pháp Nguyên liệu đầu Điều kiện Hiệu suất Hạn chế
Vi sóng (Tiwari et al.) 4-amino-5-mercapto-1,2,4-triazole + acetylacetone MW, montmorillonite K10, 15–20 phút 70–85% Thiết bị đặc biệt, khó scale-up
Đun hồi lưu ethanol/KOH (Tài liệu [20]) α-bromochalcone + triazole EtOH/KOH, hồi lưu 55–75% Yêu cầu bromochalcone chuẩn bị trước
Vi sóng + Basic Al₂O₃ (Tài liệu [12]) 1,2,4-triazole + chalcone MW, DMF/p-TsOH 60–80% Dung môi DMF độc hại
Phương pháp đề tài (đun hồi lưu EtOH/CH₃COONa) N₄ + 2-chloroquinoline-3-carbaldehyde EtOH, CH₃COONa, 8h 22–30% Đơn giản, không cần thiết bị đặc biệt

Phân tích yêu cầu theo ưu tiên (MoSCoW):

  • Must have: Xác nhận cấu trúc bằng phổ IR và ¹H-NMR; hiệu suất tổng hợp N₁ > 70%; độ tinh khiết qua điểm nóng chảy.
  • Should have: Hoạt tính kháng khuẩn dương tính với ít nhất một chủng vi khuẩn thử nghiệm.
  • Could have: Dữ liệu kháng nấm, so sánh với fluconazole chuẩn.
  • Won't have (giai đoạn này): Thử nghiệm in vivo, tối ưu hóa liều lượng lâm sàng.

Thách thức kỹ thuật chính:

  • Phản ứng tautomer hóa thiol–thione của các trung gian làm phức tạp phân tích phổ.
  • Hiệu suất bước đóng vòng triazole thấp (~21%) do hydrazine dễ bay hơi và hiện tượng lưu huỳnh hóa phụ.
  • Độ tan khác biệt lớn giữa các trung gian phản ứng đòi hỏi điều chỉnh dung môi cho từng giai đoạn.

Thiết kế hệ thống tổng hợp

Sơ đồ tổng hợp 4 giai đoạn:

Thiourea + Acetylacetone
    → [HCl/EtOH, Al₂O₃, 150°C, 2h] →
N₁: 4,6-dimethylpyrimidin-2-thiol (hiệu suất 76%)
    → [ClCH₂COOEt, K₂CO₃, acetone, 150°C, 12h] →
N₂: Ethyl [(4,6-dimethylpyrimidin-2-yl)sulfanyl]acetate (hiệu suất 80%)
    → [N₂H₄·H₂O 50%, EtOH, hồi lưu 6h] →
N₃: 2-[(4,6-dimethylpyrimidin-2-yl)sulfanyl]acetohydrazide (hiệu suất 63%)
    → [CS₂/KOH/EtOH → N₄' → N₂H₄, hồi lưu 4h, CH₃COOH] →
N₄: 4-amino-5-{[(4,6-dimethylpyrimidin-2-yl)sulfanyl]methyl}-1,2,4-triazole-3-thiol (hiệu suất 21%)
    → [2-chloroquinoline-3-carbaldehyde, CH₃COONa, EtOH, 8h] →
N₅/N₆/N₇: Dẫn xuất thiadiazepine (hiệu suất 22–30%)

Thiết bị và hóa chất chủ chốt:

  • Máy đo nhiệt độ nóng chảy: FP62 Mettler Toledo
  • Máy đo phổ IR: FTIR-8400S Shimadzu (viên nén KBr)
  • Máy đo ¹H-NMR: Bruker AC 500MHz (DMSO-d₆, Viện Hóa học Việt Nam, Hà Nội)
  • Xúc tác: Al₂O₃ (1g/mol thiourea), K₂CO₃, CH₃COONa

Yêu cầu an toàn: Ethyl chloroacetate gây kích ứng giác mạc nghiêm trọng — bắt buộc đeo kính bảo hộ. CS₂ độc hại và dễ cháy — thao tác trong tủ hốt.

Methodology

Nghiên cứu áp dụng phương pháp tổng hợp hữu cơ cổ điển kết hợp phân tích phổ hiện đại:

  • Giai đoạn 1 (Tháng 1–2): Tối ưu quy trình tổng hợp N₁, xác nhận cấu trúc qua IR và điểm nóng chảy.
  • Giai đoạn 2 (Tháng 2–3): Tổng hợp chuỗi N₂ → N₃ → N₄, theo dõi qua TLC và IR sau mỗi bước.
  • Giai đoạn 3 (Tháng 3–4): Chuyển hóa N₄ → N₅/N₆/N₇, tối ưu dung môi kết tinh (dioxane:ethanol = 1:1).
  • Giai đoạn 4 (Tháng 4–5): Phân tích ¹H-NMR tại Hà Nội, thử nghiệm hoạt tính sinh học tại Khoa Sinh học ĐHSP TP.HCM.

Implementation và kết quả

Development process — Các phản ứng then chốt

Bước 1: Đóng vòng pyrimidine (N₁)

Cơ chế gồm hai giai đoạn cộng hợp nucleophile và tách loại nước. Hai nguyên tử N của thiourea đóng vai tác nhân nucleophile tấn công lần lượt vào hai nhóm carbonyl của acetylacetone:

H₂N-C(=S)-NH₂ + CH₃COCH₂COCH₃
    --[HCl, Al₂O₃, EtOH, 150°C]--> 4,6-dimethylpyrimidine-2(1H)-thione (N₁·HCl)
    --[K₂CO₃, H₂O]--> N₁ (dạng tự do)

Cải tiến quan trọng: Sử dụng Al₂O₃ làm xúc tác và K₂CO₃ bột thay cho KOH để trung hòa HCl, tránh phản ứng tỏa nhiệt mạnh làm biến chất sản phẩm (theo cải tiến của Trần Quốc Sơn và Phạm Quốc Toản). Thời gian phản ứng rút ngắn từ 16 ngày (phương pháp cũ) xuống còn 2 giờ.

Bước 2: Phản ứng S-alkyl hóa (N₁ → N₂)

Cơ chế S_N2 — K₂CO₃ chuyển N₁ thành thiolate anion (4,6-dimethylpyrimidine-2-thiolate). Chọn K₂CO₃ thay Na₂CO₃ vì bán kính K⁺ lớn hơn Na⁺ → mật độ điện tích nhỏ hơn → ion thiolate phân ly dễ hơn → nồng độ tác nhân nucleophile cao hơn. Acetone được chọn làm dung môi aprotic để tránh thủy phân ester sản phẩm.

Bước 3: Đóng vòng triazole (N₄' → N₄)

Cơ chế đóng vòng 1,2,4-triazole-3-thiol qua trung gian kali thiosemicarbazate (N₄'):

  1. N₃ phản ứng với CS₂/KOH tạo N₄' (muối kali dithiocarbazate)
  2. N₄' phản ứng với hydrazine hydrate (dư 3–4 lần, thêm từng đợt) → đóng vòng triazole
  3. Acid hóa bằng CH₃COOH đến pH 6–7 để tách sản phẩm N₄

Bước 4: Đóng vòng thiadiazepine (N₄ → N₅/N₆/N₇)

Phản ứng đồng thời ở cả hai nhóm chức –NH₂ và –SH của N₄ với 2-chloroquinoline-3-carbaldehyde trong môi trường CH₃COONa/EtOH, đun hồi lưu 8 giờ:

N₄ + ArCHO (X = H, Cl, CH₃)
    --[CH₃COONa, EtOH, hồi lưu 8h]-->
    N₅ (X=H), N₆ (X=Cl), N₇ (X=CH₃)  [dẫn xuất thiadiazepine]

Testing và validation

Phân tích phổ IR — dữ liệu xác nhận cấu trúc:

Hợp chất Dao động đặc trưng (cm⁻¹) Nhóm chức xác nhận
N₁ 2548–3188 (tù, rộng) S–H và N–H (liên kết H, tautomer thiol/thione)
N₃ 3277, 3161 (mạnh); 1690 (mạnh) N–H; C=O (hydrazide)
N₄ 3238, 3120 (mạnh); 2773 (trung bình) N–H; S–H (mất C=O so với N₃)
N₅/N₆/N₇ Mất S–H; xuất hiện C=N thiadiazepine Đóng vòng thiadiazepine thành công

Xác nhận bằng ¹H-NMR (500MHz, DMSO-d₆):

Trên phổ ¹H-NMR của N₄ xuất hiện tín hiệu rộng đặc trưng của proton nhóm –SH tại δ 10,9–11,1 ppm, chứng minh sự cùng tồn tại của hai dạng tautomer thiol (S–H) và thione (N–H) — phù hợp với kết quả trên phổ IR.

Kết quả nhiệt độ nóng chảy — kiểm tra độ tinh khiết:

Hợp chất Tnc đo được (°C) Tnc tài liệu (°C) Đánh giá
N₁ 213 212–214 ✅ Phù hợp
N₃ 168–169 167–168 ✅ Phù hợp
N₄ 197–198 197–198 ✅ Phù hợp

Kết quả đạt được

Hợp chất Trạng thái Dung môi kết tinh Hiệu suất Tnc (°C)
N₁ Tinh thể hình kim, vàng sáng H₂O 76% 213
N₃ Bột trắng EtOH 63% 168,5
N₄ Rắn trắng EtOH 21% 197,5
N₅ Bột vàng Dioxane:EtOH (1:1) 26% 237
N₆ Bột vàng nâu Dioxane:EtOH (1:1) 30% 240
N₇ Bột vàng nhạt Dioxane:EtOH (1:1) 22% 245

Đổi mới và đóng góp

1. Chuỗi tổng hợp 4 bước tích hợp từ nguyên liệu cơ bản: Đây là chuỗi hội tụ ít bước nhất được ghi nhận cho việc xây dựng khung lai ghép pyrimidine–triazole–thiadiazepine, không yêu cầu thiết bị vi sóng chuyên dụng (so với các phương pháp của Tiwari et al. và Tài liệu [12] đòi hỏi lò vi sóng và Al₂O₃ kiềm tính).

2. Cải tiến quy trình tổng hợp N₁: Áp dụng cải tiến Al₂O₃/K₂CO₃ giúp rút ngắn thời gian phản ứng từ 16 ngày xuống 2 giờ (cải thiện >99% về mặt thời gian) so với phương pháp nguyên thủy trong tài liệu [27], trong khi duy trì hiệu suất 76%.

3. Tổng hợp thành công ba dẫn xuất thiadiazepine mới (N₅, N₆, N₇) mang nhóm thế X = H, Cl và CH₃ trên vòng quinoline, mở rộng thư viện hợp chất từ khung N₄ chưa được báo cáo trong tài liệu trước đó với cụm cấu trúc pyrimidine-thioether đặc trưng này.

4. So sánh với tài liệu [3]: Hợp chất N₄ (tương tự hợp chất 26 trong tài liệu [3]) có vùng ức chế kháng khuẩn đạt >80% so với ceftriaxone và vượt trội hơn amoxicillin trên cả bốn chủng vi khuẩn thử nghiệm, xác nhận khung triazole-thiol là pharmacophore tiềm năng.

Ứng dụng thực tế và triển khai

Kịch bản ứng dụng thực tế:

  • Dược phẩm: Các dẫn xuất thiadiazepine (N₅, N₆, N₇) là ứng viên cấu trúc cho phát triển chất dẫn dược (lead compound) kháng khuẩn phổ rộng, kháng nấm (đặc biệt Candida albicans), và tiềm năng kháng HIV, chống co giật, chống trầm cảm dựa trên bằng chứng từ tài liệu [6, 7, 13].
  • Nông dược: Khung pyrimidine-thioether có tiềm năng phát triển thành chất trừ nấm trong bảo vệ thực vật.

Yêu cầu triển khai quy mô lớn hơn:

  • Hệ thống hồi lưu dung môi để thu hồi EtOH và acetone
  • Tủ hốt tiêu chuẩn (CS₂, hydrazine, ethyl chloroacetate đều độc/dễ cháy)
  • Thiết bị phân tích tại chỗ: máy IR (FTIR) và hệ thống TLC tự động

Lộ trình phát triển:

  • 6 tháng: Tối ưu hiệu suất bước N₄ (hiện 21%) bằng cách cải tiến điều kiện đóng vòng.
  • 12 tháng: Mở rộng thư viện dẫn xuất thiadiazepine với các aldehyde dị vòng khác.
  • 24 tháng: Thử nghiệm in vitro đầy đủ (MIC, IC₅₀) và đánh giá độc tính sơ bộ.

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật:

  • Hiệu suất thấp ở bước đóng vòng triazole (N₄: 21%) do hydrazine dễ bay hơi ở nhiệt độ hồi lưu và phản ứng lưu huỳnh hóa phụ cạnh tranh.
  • Hiệu suất thấp ở bước đóng vòng thiadiazepine (22–30%) — cần khảo sát thêm ảnh hưởng của tỉ lệ mol, nhiệt độ và loại base.
  • Phân tích cấu trúc chỉ dựa trên IR và ¹H-NMR; chưa có dữ liệu ¹³C-NMR, MS (khối phổ) để xác nhận tuyệt đối.
  • Thử nghiệm kháng khuẩn mới dừng ở thăm dò định tính với 2 chủng; chưa xác định MIC (nồng độ ức chế tối thiểu).

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

  1. Sử dụng vi sóng để cải thiện hiệu suất bước đóng vòng triazole và thiadiazepine.
  2. Mở rộng sang các aldehyde dị vòng khác: benzaldehyde thế, furan-2-carbaldehyde, thiophene-2-carbaldehyde.
  3. Thực hiện docking phân tử để dự đoán tương tác với các đích enzyme (DHFR, topoisomerase II).
  4. Xác định đầy đủ cấu trúc bằng phổ HMBC, HSQC, MS-ESI.

Đối tượng hưởng lợi

  • Sinh viên Hóa hữu cơ: Tài liệu thực hành tổng hợp dị vòng đa bước với đầy đủ quy trình, cơ chế và phân tích phổ — bộ tài liệu học tập hoàn chỉnh từ thiourea đến hợp chất sinh học.
  • Nhà nghiên cứu hóa dược: Quy trình tổng hợp khung pyrimidine–triazole–thiadiazepine có thể làm nền tảng xây dựng thư viện hợp chất sàng lọc hoạt tính.
  • Ngành dược phẩm: Bộ dữ liệu cấu trúc và hoạt tính sinh học sơ bộ là điểm khởi đầu cho phát triển chất dẫn dược kháng khuẩn và kháng nấm mới.
  • Giảng viên, hướng dẫn khóa luận: Mô hình nghiên cứu chuẩn mực kết hợp tổng hợp, phân tích cấu trúc và thử nghiệm hoạt tính — ví dụ điển hình cho đào tạo phương pháp nghiên cứu khoa học.

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu thiết bị tối thiểu để tái lập quy trình? Hệ thống hồi lưu, bếp khuấy từ gia nhiệt, tủ hốt, máy đo điểm nóng chảy (FP62 hoặc tương đương), máy FTIR để xác nhận cấu trúc sau mỗi bước. Không yêu cầu lò vi sóng hay thiết bị đặc biệt.

2. Tại sao hiệu suất N₄ chỉ đạt 21%? Nguyên nhân chính: hydrazine dễ bay hơi ở nhiệt độ hồi lưu (~78°C), phản ứng lưu huỳnh hóa phụ cạnh tranh, và N₄ có nhóm –NH₂ và –SH dễ tan trong môi trường có pH không tối ưu. Giải pháp: kiểm soát pH chặt (6–7), thêm hydrazine từng đợt, làm lạnh đủ thời gian.

3. Làm thế nào xác nhận vòng thiadiazepine đã được tạo thành? Trên phổ IR: mất pic –SH (~2773 cm⁻¹) và –NH₂ tự do; xuất hiện các pic đặc trưng C=N của vòng thiadiazepine. Trên ¹H-NMR: mất tín hiệu proton –SH (δ 10,9–11,1 ppm) và –NH₂ tự do; xuất hiện tín hiệu proton vinylic/imine mới.

4. Các hợp chất tổng hợp có bền theo thời gian không? N₁ bền tốt (Tnc 213°C). N₄' (muối kali thiosemicarbazate) không bền, cần sử dụng ngay. N₅, N₆, N₇ ở dạng rắn, kết tinh, bền ở điều kiện thường.

5. Chi phí tổng hợp và khả năng scale-up? Nguyên liệu hoàn toàn thương mại (thiourea, acetylacetone, ethyl chloroacetate, hydrazine, CS₂, 2-chloroquinoline-3-carbaldehyde). Chi phí nguyên liệu thô ở quy mô phòng thí nghiệm (~1mmol/mẻ) ước tính dưới 500.000 VNĐ/mẻ. Scale-up cần giải quyết vấn đề xử lý CS₂ và hydrazine ở quy mô lớn.

Kết luận

Khóa luận đã hoàn thành thành công chuỗi tổng hợp 4 bước từ thiourea và acetylacetone đến hợp chất mục tiêu N₄ — 4-amino-5-{[(4,6-dimethylpyrimidin-2-yl)sulfanyl]methyl}-1,2,4-triazole-3-thiol — với tổng hiệu suất lý thuyết tích lũy khoảng 6,4% qua bốn bước (76% × 80% × 63% × 21%). Ba dẫn xuất thiadiazepine mới (N₅, N₆, N₇) đã được tổng hợp và xác nhận cấu trúc bằng phổ IR và ¹H-NMR 500MHz.

Điểm đóng góp kỹ thuật nổi bật nhất là cải tiến quy trình tổng hợp N₁ giúp rút ngắn thời gian phản ứng hơn 99% so với phương pháp truyền thống, đồng thời toàn bộ quy trình chỉ sử dụng thiết bị phòng thí nghiệm phổ thông — đây là ưu điểm lớn cho các cơ sở đào tạo tại Việt Nam.

Với khung phân tử lai ghép pyrimidine–triazole–thiadiazepine mang đặc tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống HIV và tiềm năng dược lý rộng, các hợp chất N₅–N₇ là cơ sở vững chắc để tiếp tục nghiên cứu sâu hơn ở cấp độ thử nghiệm in vitro đầy đủ và phát triển chất dẫn dược trong tương lai. Nhà nghiên cứu và sinh viên quan tâm đến hóa dược dị vòng có thể sử dụng trực tiếp quy trình này như điểm khởi đầu cho các đề tài mở rộng.