MỞ ĐẦU Số lượng người mắc bệnh tiểu đường có xu hướng ngày càng gia tăng trong những năm gần đây. Một trong những liệu pháp điều trị bệnh tiểu đường là phát triển các chế phẩm có khả năng ức chế enzyme -glucosidase. Thuốc ức chế -glucosidase có công dụng làm chậm quá trình tiêu hóa carbohydrate, do đó làm giảm hàm lượng glucose trong máu. Vì lẽ đó, nhu cầu tìm ra và phát triển các chất có khả năng ức chế -glucosidase ngày càng cao và các hợp chất có hoạt tính này đã và đang được nghiên cứu.
Có nhiều hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase, trong đó điển hình là các chalconoid. Hiện nay có nhiều phản ứng được dùng để tổng hợp các dẫn xuất chalconoid, trong đó phản ứng ngưng tụ Claisen – Schmidt sử dụng phương pháp nghiền phi dung môi được sử dụng rộng rãi để tổng hợp các dẫn xuất chalconoid do có nhiều ưu điểm như thời gian phản ứng ngắn và hiệu suất phản ứng khá tốt. Từ đó hướng đến việc khảo sát hoạt tính kháng enzyme -glucosidase của các dẫn xuất chalconoid nhằm sàng lọc các hợp chất có hoạt tính tốt để đưa vào nghiên cứu và sản xuất. Vì những lý do trên, luận văn “Tổng hợp một số chalconoid và định hướng thử nghiệm hoạt tính kháng -glucosidase” được thực hiện với các nhiệm vụ chính như sau: ➢ Tổng hợp một số các dẫn xuất chalconoid với các nhóm thế khác nhau.
➢ Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase của các dẫn xuất tổng hợp được. ➢ Đánh giá mối liên hệ giữa cấu trúc-hoạt tính các dẫn xuất chalconoid. Từ đó giúp sàng lọc thêm các hợp chất có hoạt tính ức chế tốt enzyme -glucosidase. Tổng quan về chalconoid 1.
Sơ lược về chalconoid Chalconoid là nhóm phụ của flavonoid có tên gọi là benzylideneacetophenone gồm hai vòng thơm được liên kết bởi mạch 03 carbon α,β-carbonyl bất bão hòa (Hình 1. Các chalconoid cho thấy nhiều hoạt tính sinh học đa dạng như: hoạt tính kháng vi khuẩn, kháng virus, kháng oxi hóa, kháng ung thư, truyền nhiễm, giảm đau…. Chalconoid là một trong những phân nhóm đa dạng nhất của flavonoid và có thể dễ dàng thực hiện phản ứng đóng vòng để tạo thành các flavonoid. Tính chất hoá học của các chalconoid rất được quan tâm nghiên cứu từ rất lâu, nguyên nhân là do cấu trúc dạng mạch hở và khả năng biến đổi cấu trúc để tạo thành các nhóm hợp chất hữu cơ mới như azachalcone, isoxazole, pyrazole và indole.
Trong không gian, chalconoid có thể tồn tại ở cả 2 dạng đồng phân cis và trans, but đồng phân cis lại kém bền do có sự án ngữ không gian giữa vòng A và nhóm carbonyl. Trong các chalconoid, hai vòng thơm và hệ 03 carbon α,β-carbonyl bất bão hòa có sự liên hợp. Điều này lý giải cho khả năng oxy hoá – khử kém, tính ổn định, phản ứng chuyển vị electron và quan trọng hơn hết chính là hoạt tính sinh học đầy tiềm năng[1][2]. Các chalconoid được tổng hợp thông qua phản ứng ngưng tụ Claisen – Schmidt trong điều kiện sử dụng các xúc tác kiềm, dung môi alcohol, nhiệt độ từ 40-50oC và trong nhiều giờ phản ứng.
Để giảm thải lượng dung môi và tốn nhiều thời gian phản ứng, các chalconoid cũng có thể được tổng hợp trong điều điện phi dung môi dưới sự hỗ trợ của vi sóng hoặc bằng phương pháp nghiền. Trong nghiên cứu này, các chalconoid sẽ được tổng hợp trong điều kiện phi dung môi ở điều kiện nhiệt độ phòng bằng cách nghiền hỗn hợp các tác chất phản ứng, xúc tác NaOH rắn trong khoảng 20-30 phút hoặc sử dụng xúc tác đất sét MK10 dưới sự hỗ trợ của vi sóng[1]. Cấu trúc hóa học của các dẫn xuất chalconoid. Các chalconoid không chỉ được tìm thấy trong hoa mà còn có trong lá, quả, rễ và trong các bộ phận khác trong thực vật.
Trong tự nhiên, chalconoid tồn tại ở dạng rắn và có các màu khác nhau gồm vàng, cam và nâu. Các chalconoid thường bền vững hơn so với các flavonoid và isoflavonoid Chalconoid hòa tan tốt trong alcohol, dung dịch acid và kiềm, trong dung môi hữu cơ như acetone, chloroform và dichloromethane. Trong dung dịch kiềm, chúng có màu đỏ đậm hoặc đỏ cam. Tất cả chalconoid đều dương tính với xét nghiệm Wilson, hoá hồng trong H2SO4 đặc.
Ngoài ra, các chalconoid khi được xử lý với dung dịch cồn của sắt chloride sẽ xuất hiện màu tím, điều này cho thấy có sự hiện diện của nhóm hydroxyl trong phenol. Chalconoid trải qua các phản ứng đồng phân hóa để cho flavonoid[3][4]. Sự đa dạng về cấu trúc của chalconoid tự nhiên Chalconoid mang các nhóm thế như hydroxy, methoxy, prenyl và glycoside rất phổ biến trong tự nhiên. Tuy nhiên, các cấu trúc đa dang khác cũng được phân lập từ nguồn gốc thực vật (Hình 1.2): galiposin, 2′-hydroxy-4′,6′-dimethoxy-3′- methylchalcone, triglycoside bisdesmosidic, rhuschalcone VI, azobechalcone[5][6][7][8][9].
4 Triglycoside bidesmosidic Azobechalcone 5 Rhuschalcone VI Hình 1.2: Cấu trúc một số chalconoid trong tự nhiên. Hoạt tính sinh học của chalconoid Chalconoid có hoạt tính sinh học đa dạng như kháng viêm, kháng oxy hóa, chống nhiễm trùng, kháng virus và kháng ung thư và ức chế enzyme α-glucosidase [10][11][12]. α-Glucosidase là enzyme liên kết màng ở phần đầu ruột non và đóng vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hoá carbohydrate. Quá trình ức chế enzyme α- glucosidase sẽ làm giảm hàm lượng glucose trong máu, acarbose là chất đáp ứng được yêu cầu này do đó thường được sử dụng làm chất chứng dương trong các thử nghiệm kháng α-glucosidase.
Cam thảo chứa các retrochalcone, licochalcone A-E, echinatin, các chất này đã được cô lập và cho thấy nhiều hoạt tính sinh học như kháng viêm, kháng oxy hoá và kháng tiểu đường[12]. Ngoài ra, các chalconoid tổng hợp cho thấy có khả năng kháng α-glucosidase hoặc α-amylase. Các chalconoid có trong tự nhiên như xanthohumol cho thấy hoạt tính kháng α-glucosidase, cơ chế tương tác của xathohumol với enzyme đã được nghiên cứu bằng phổ phát huỳnh quang của enzyme[13][14]. Woo và các cộng sự[15] đã tổng hợp thành công một số các chalconoid và thử nghiệm hoạt tính, trong đó sulfonamide chalcone có khả năng ức chế tốt enzyme α- glucosidase gấp 150 lần so với acarbose.
Các amine chalcone khác thì cho thấy hoạt tính kém hơn. 6 Ping Lin và cộng sự[16] cũng đã tổng hợp được 05 dẫn xuất chalconoid, trong đó 2 dẫn xuất (E)-1-(2-(2-bromoethoxy)phenyl)-3-phenylprop-2-en-1-one, (E)-1-(2- (3-bromopropoxy)phenyl)-3-phenylprop-2-en-1-one cho thấy hoạt tính kháng enzyme α-glucosidase trong khi các dẫn xuất còn lại thì lại không có hoạt tính này. Rocha và cộng sự[17] đã thử nghiệm hoạt tính kháng α-glucosidase với 41 dẫn xuất chalconoid với các nhóm thế khác nhau (hydroxy, methoxy, nitro, fluoro, bromo, chloro) và vị trí khác nhau, trong đó hợp chất (2E)-1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-(3,4- dihydroxyphenyl)prop-2-en-1-one (butein) cho thấy hoạt tính ức chế α-glucosidase tốt (IC50 = 21 ± 2 μM), cao gấp 17 lần so với chất chứng dương là acarbose (IC50 = 357 ± 25 μM). Phương pháp tổng hợp chalconoid Các chalconoid được tổng hợp thông qua phản ứng ngưng tụ, xúc tác acid hoặc base.
Hiện nay, có nhiều phương pháp và quy trình tổng hợp chalconoid bao gồm: phản ứng ngưng tụ Claisen – Schmidt bằng phương pháp nghiền[18], chiếu xạ vi sóng[19] và siêu âm[20], phản ứng Heck[21], phản ứng Sonogashira[22], phản ứng Suzuki – Miyaura[23], phản ứng Julia – Kocienski[24], phản ứng Witting[25], phản ứng acyl hóa Friedel – Crafts[26], phản ứng chuyển vị quang hóa Fries[27], tổng hợp cis – chalconoid[28]. Phương pháp ngưng tụ Claisen – Schmidt Phản ứng ngưng tụ Claisen – Schmidt là phương pháp thường được sử dụng trong quá trình tổng hợp chalconoid vì tính đơn giản hơn so với các phương pháp khác. Tuy nhiên, phản ứng này tạo ra nhiều sản phẩm phụ. Trong phương pháp này, acetophenone và các dẫn xuất aldehyde trải qua phản ứng ghép cặp C-C, xúc tác acid hoặc base trong dung môi phân cực ở 50 – 100 oC trong vài giờ [29][30].
Nhược điểm của phương pháp này là tạo nhiều sản phẩm phụ, thời gian phản dài. Tuy nhiên, ngưng tụ Claisen – Schmidt là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để tổng hợp chalconoid do quy trình đơn giản hơn so với các phương pháp khác [29]. Năm 2009, Nora và cộng sự[31] đã tổng hợp thành công 17 dẫn xuất của chalcone dựa trên phản ứng ngưng tụ Claisen – Schmidt dưới điều kiện nghiền bằng 7 cối, chày, không dung môi và xúc tác NaOH rắn. Trong nghiên cứu của Nora đã chỉ ra được hiệu quả của phương pháp này so với phương pháp tổng hợp cổ điển về thời gian phản ứng và hiệu suất tổng hợp.
Kết quả đạt được từ phương pháp này là thời gian phản ứng trung bình từ 10 – 15 phút cho hiệu suất từ 70-96%. Ngoài việc sử dụng xúc tác NaOH rắn, xúc tác MK10 cũng được sử dụng. MK10 là xúc tác dị thể trong phản ứng ngưng tụ Claisen – Schmidt phi dung môi trong điều kiện vi sóng và đóng vai trò là một acid Lewis. Xúc tác MK10 được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp và hoá dược và đóng vai trò quan trọng đối sự phát triển các quy trình tổng hợp xanh.
MK10 có nhiều ưu điểm như thân thiện với môi trường, không độc hại, giá thành rẻ và quan trọng là dễ thu hồi sau khi sử dụng. Xúc tác MK10 có diện tích bề mặt lớn chứa hai tâm xúc tác là Bronsted và Lewis. MK10 thuộc nhóm smectite, có cơ cấu lớp 2:1 bao gồm hai tấm tứ diện và một tấm bát diện, mỗi lớp có độ dày khoảng 1 nm và có thể mở rộng theo hai hướng khác nhau đến vài trăm nm[32]. Cấu trúc của MK10 (Hình 1.3) được minh họa như sau: Hình 1.3: Cấu trúc không gian của MK10 1.
Cơ chế phản ứng ngưng tụ Claisen – Schmidt ❖ Cơ chế phản ứng trong môi trường base được diễn ra theo các giai đoạn sau[18] (Hình 1.4): 8 Giai đoạn 1: quá trình tách proton H của acetophenone bởi xúc tác NaOH để hình thành carbanion. Giai đoạn 2: phản ứng cộng ái nhân của carbanion với nhóm carbonyl của dẫn xuất aldehyde thơm để tạo chất trung gian hydroxy ketone. Giai đoạn 3: Giai đoạn tách nước của hydroxy ketone tạo thành chalconoid.4: Cơ chế phản ứng ngưng tụ Claisen – Schmidt trong môi trường base. Bản chất các nhóm thế của dẫn xuất benzaldehyde sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng phản ứng và hiệu suất tạo thành sản phẩm.
Trong môi trường base, sự hiện diện của nhóm ortho, para-hydroxy trên vòng thơm của benzaldehyde làm giảm tính ái điện tử của nhóm aldehyde do cộng hưởng, từ đó làm giảm hiệu suất tổng hợp các sản phẩm chalconoid. ❖ Cơ chế phản ứng sử dụng xúc tác đất sét MK10[32] (Hình 1.5: Cơ chế phản ứng ngưng tụ Claisen – Schmidt sử dụng MK10. 9 MK10 là một acid Lewis, tạo liên kết với nguyên tử oxygen của dẫn xuất benzaldehyde. Lúc này tác nhân electrophile là dẫn xuất benzalehyde đã được hoạt hoá nên tác nhân nucleophile dễ dàng tấn công hơn, sau đó xảy ra sự chuyển vị proton và cuối cùng là tách nước tạo thành sản phẩm.