Luận văn nghiên cứu tính đa hình và tần suất các alen của 27 locus str trên nhiễm sắc thể thường bằng bộ kit forenseq ứng dụng trong giám định adn hình sự tại việt nam

Nghiên cứu đa hình và tần suất alen của 27 locus STR trên nhiễm sắc thể thường bằng bộ kit ForenSeq ứng dụng trong giám định ADN hình sự tại Việt Nam.

• Tác giả: Nguyễn Văn A
• Người hướng dẫn: PTS. Nguyễn Văn C
• Trường học: Trường Đại học Y Dược
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu tính đa hình và tần suất alen STR trên nhiễm sắc thể thường tại Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận án
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. KHÁI NIỆM VỀ CÁC LOCUS TRÌNH TỰ LẶP LẠI NGẮN (SORT TANDEM REPEAT - STR)
• 1.1.1. Khái niệm
• 1.2. CƠ SỞ DỮ LIỆU TẦN SUẤT CÁC ALEN
• 1.2.1. Khái niệm cơ sở dữ liệu tần suất các alen
• 1.2.2. Tần suất các alen
• 1.2.2.1. Alen có tần suất thấp
• 1.2.2.2. Alen có tần suất cao - Alen phổ biến
• 1.2.3. Ý nghĩa của cơ sở dữ liệu tần suất các alen
• 1.2.4. Cơ sở khoa học để xác định số lượng cá thể khảo sát
• 1.3. KHÁI QUÁT VỀ BỘ KÍT FORENSEQ DNA SIGNATURE PREP - MIX A
• 1.3.1. Bộ kít ForenSeqTM DNA Signature Prep
• 1.3.2. Các locus STR trên nhiễm sắc thể thường trong bộ kít ForenSeqTM DNA Signature Prep-Mix A

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu

Nghiên cứu này tập trung vào việc khảo sát tính đa hình và tần suất alen của các locus STR trên nhiễm sắc thể thường tại Việt Nam. Mục tiêu chính là xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất alen cho 27 locus STR, phục vụ cho công tác giám định ADN hình sự. Việc này là cần thiết vì tính đa hình và tần suất alen có thể khác nhau giữa các quần thể, do đó không thể áp dụng dữ liệu của một quần thể cho quần thể khác. Viện Khoa học hình sự đã tiên phong trong việc ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới MiSeq FGx với bộ kit ForenSeqTM DNA Signature Prep - Mix A. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp căn cứ khoa học cho việc ứng dụng công nghệ này trong giám định ADN tại Việt Nam.

II. Phương pháp nghiên cứu

Đề tài thực hiện khảo sát trên 200 mẫu máu của người dân tộc Kinh, chiếm gần 90% dân số Việt Nam. Các mẫu được thu thập ngẫu nhiên từ dự án “Tàng thư gen tội phạm quốc gia”. Phân tích ADN được thực hiện bằng bộ kit ForenSeqTM DNA Signature Prep - Mix A trên hệ thống giải trình tự MiSeq FGx. Kết quả sẽ được thống kê và tính toán tần suất alen của 27 locus STR, từ đó so sánh với các bộ kit hiện đang sử dụng trong giám định ADN hình sự tại Việt Nam. Phương pháp này đảm bảo tính chính xác và khách quan trong việc xác định tính đa hình của các locus STR.

III. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất alen cho người dân tộc Kinh tại Việt Nam. Đây là lần đầu tiên có một nghiên cứu chi tiết về tính đa hình và tần suất alen của 27 locus STR trên nhiễm sắc thể thường. Kết quả sẽ là căn cứ khoa học vững chắc để triển khai ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới trong giám định ADN hình sự. Hơn nữa, nghiên cứu cũng đóng góp vào hệ thống dữ liệu quốc tế về tần suất alen của người dân tộc Kinh, từ đó nâng cao độ tin cậy trong các kết luận giám định ADN.

IV. Kết luận

Nghiên cứu về tính đa hình và tần suất alen của các locus STR trên nhiễm sắc thể thường tại Việt Nam không chỉ có giá trị khoa học mà còn có ứng dụng thực tiễn cao trong lĩnh vực giám định ADN hình sự. Việc xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất alen sẽ giúp nâng cao độ chính xác trong các kết luận giám định, đồng thời tạo điều kiện cho việc áp dụng công nghệ mới trong lĩnh vực này. Kết quả nghiên cứu sẽ là nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo và góp phần vào việc phát triển khoa học di truyền tại Việt Nam.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Giám định ADN hình sự là lĩnh vực khoa học quan trọng trong việc truy nguyên cá thể và xác định quan hệ huyết thống, đóng vai trò thiết yếu trong tố tụng hình sự và dân sự. Tại Việt Nam, dân tộc Kinh chiếm gần 90% dân số, do đó việc xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen của các locus STR trên nhiễm sắc thể thường trong quần thể này là cấp thiết để đảm bảo tính chính xác và khách quan trong kết luận giám định ADN. Nghiên cứu tập trung khảo sát 27 locus STR sử dụng bộ kit ForenSeqTM DNA Signature Prep - Mix A trên 200 mẫu máu của người dân tộc Kinh, thu thập ngẫu nhiên từ nhiều địa phương khác nhau trên toàn quốc.

Mục tiêu tổng quát của đề tài là xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất alen của 27 locus STR nhằm ứng dụng trong giám định ADN hình sự tại Việt Nam. Mục tiêu cụ thể bao gồm xác định tần suất các alen và đánh giá tính đa hình của các locus STR này, từ đó đề xuất khả năng ứng dụng bộ kit ForenSeqTM DNA Signature Prep - Mix A trong lĩnh vực giám định ADN. Phạm vi nghiên cứu giới hạn trong quần thể người dân tộc Kinh với 200 cá thể không có quan hệ huyết thống gần, thu thập trong dự án “Tàng thư gen tội phạm quốc gia”.

Ý nghĩa của nghiên cứu không chỉ nằm ở việc cung cấp cơ sở khoa học vững chắc cho việc ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới trong giám định ADN hình sự tại Việt Nam mà còn đóng góp vào hệ thống dữ liệu quốc tế về tần suất các alen của người dân tộc Kinh. Kết quả nghiên cứu sẽ hỗ trợ xây dựng cơ sở pháp lý và nâng cao độ tin cậy trong các kết luận giám định ADN hình sự.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên lý thuyết về các locus trình tự lặp lại ngắn (Short Tandem Repeat - STR), là các đoạn ADN có cấu trúc lặp lại từ 2 đến 6 base pairs, nằm chủ yếu ở vùng không mã hóa (intron) của ADN nhân tế bào người. STR có tính đa hình cao, mức độ dị hợp tử lớn, và được di truyền độc lập trên các nhiễm sắc thể khác nhau, đáp ứng các yêu cầu quan trọng trong giám định ADN hình sự.

Bộ kit ForenSeqTM DNA Signature Prep - Mix A bao gồm 27 locus STR trên 21 nhiễm sắc thể thường, được thiết kế để phân tích đồng thời nhiều locus với kích thước amplicon từ 60 đến 460 bp, phù hợp với các mẫu ADN bị phân hủy hoặc chất lượng kém. Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (Next Generation Sequencing - NGS) trên hệ thống MiSeq FGxTM của Illumina được sử dụng để giải trình tự các locus STR này, cho phép phân tích đồng thời 96 mẫu với độ chính xác cao, vượt trội so với công nghệ điện di mao quản truyền thống.

Các chỉ số đánh giá tính đa hình và giá trị giám định của các locus STR bao gồm tần suất dị hợp tử quan sát (H(ob)), tần suất dị hợp tử lý thuyết (H(exp)), chỉ số đa hình (PIC), khả năng phân biệt (PD), khả năng loại trừ (PE) và chỉ số quan hệ huyết thống (PI). Định luật Hardy-Weinberg (HWE) được áp dụng để kiểm định sự phù hợp của tần suất alen với quần thể cân bằng lý thuyết.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu gồm 200 mẫu máu của người dân tộc Kinh, thu thập ngẫu nhiên không có quan hệ huyết thống gần, thuộc dự án “Tàng thư gen tội phạm quốc gia”. Mẫu máu được thu trên giấy FTA®, bảo quản ở nhiệt độ phòng. ADN được tách chiết bằng phương pháp vô cơ sử dụng dung dịch Chelex 5%, tinh sạch bằng bộ kit DNA Clean & Concentrator™-5, và định lượng bằng phương pháp Real-time PCR với bộ kit Quantifiler™ Human DNA Quantification Kit.

Chuẩn bị thư viện mẫu theo quy trình của bộ kit ForenSeqTM DNA Signature Prep - Mix A, khuếch đại 27 locus STR, gắn adapter và index để phân biệt mẫu, sau đó giải trình tự trên hệ thống MiSeq FGxTM. Phân tích dữ liệu sử dụng phần mềm chuyên dụng của Illumina và Microsoft Excel để tính toán tần suất alen, kiểm định Hardy-Weinberg bằng phương pháp khi bình phương (χ2), và tính các chỉ số đa hình.

Timeline nghiên cứu bao gồm thu thập mẫu, tách chiết và tinh sạch ADN, định lượng, chuẩn bị thư viện, giải trình tự, xử lý và phân tích số liệu, kéo dài trong khoảng thời gian phù hợp với tiến độ dự án “Tàng thư gen tội phạm quốc gia”.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tần suất alen và đa hình của 27 locus STR: Từ 200 mẫu, thu được tổng cộng 10.800 alen, gồm 61 loại alen với số lượng alen mỗi locus dao động từ 5 đến 34. Tất cả các locus đều tuân theo định luật Hardy-Weinberg với độ tin cậy 95% (χ2 < χ2 lý thuyết), cho thấy mẫu nghiên cứu phù hợp với quần thể cân bằng lý thuyết.

2. Tính đa hình của các locus trùng với hệ Identifiler: Trong 15 locus trùng với hệ Identifiler, locus D8S1179 có 11 alen, locus D21S11 có 14 alen, locus D7S820 có 9 alen, locus CSF1PO có 8 alen, locus D3S1358 có 7 alen, locus TH01 có 6 alen, locus D13S317 có 8 alen, locus D16S539 có 8 alen, locus D2S1338 có 11 alen, locus D19S433 có 10 alen, locus vWA có 8 alen, locus TPOX có 5 alen. Một số locus thiếu một vài alen so với thang chuẩn của bộ kit Identifiler nhưng lại phát hiện thêm các alen mới với tần suất thấp.

3. Tần suất dị hợp tử và khả năng phân biệt: Các locus có tần suất dị hợp tử quan sát (H(ob)) cao, ví dụ locus D8S1179 có 176 cá thể dị hợp tử trên 200 mẫu (88%), locus D21S11 có 175 cá thể dị hợp tử (87.5%), locus D7S820 có 148 cá thể dị hợp tử (74%). Locus TPOX có tính đa hình thấp nhất với 115 cá thể dị hợp tử (57.5%) và alen 8 chiếm gần 60% quần thể, làm giảm giá trị truy nguyên cá thể.

4. So sánh với các quần thể khác: So sánh với dữ liệu của người Mỹ gốc Châu Á và người dân tộc Kinh khảo sát bằng bộ kit Identifiler, quần thể người dân tộc Kinh trong nghiên cứu có sự khác biệt về loại alen và tần suất phân bố, phản ánh đặc trưng di truyền riêng biệt của quần thể này.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy bộ kit ForenSeqTM DNA Signature Prep - Mix A phù hợp để khảo sát tần suất alen của 27 locus STR trên quần thể người dân tộc Kinh tại Việt Nam, với số lượng mẫu 200 đảm bảo độ tin cậy khoa học. Việc phát hiện các alen mới và sự khác biệt về tần suất alen so với các bộ kit và quần thể khác minh chứng cho tính đa dạng di truyền đặc thù của quần thể Kinh, đồng thời nhấn mạnh tầm quan trọng của việc xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất alen riêng biệt cho từng quần thể.

Tính đa hình cao của phần lớn các locus STR cho thấy khả năng phân biệt cá thể và xác định huyết thống cha mẹ con đạt hiệu quả cao, góp phần nâng cao độ chính xác trong giám định ADN hình sự. Tuy nhiên, một số locus như TPOX có tính đa hình thấp, hạn chế giá trị truy nguyên cá thể, cần được cân nhắc khi sử dụng trong phân tích.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế và trong nước cho thấy công nghệ giải trình tự thế hệ mới MiSeq FGxTM kết hợp bộ kit ForenSeqTM DNA Signature Prep mang lại ưu thế vượt trội về khả năng phân tích đồng thời nhiều locus, độ chính xác cao và khả năng xử lý các mẫu ADN chất lượng kém, phù hợp với yêu cầu giám định ADN hiện đại.

Dữ liệu tần suất alen thu được có thể được trình bày qua biểu đồ phân bố tần suất alen từng locus, bảng so sánh tần suất alen giữa các quần thể, và biểu đồ tần suất dị hợp tử để minh họa tính đa hình và giá trị giám định của từng locus.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Xây dựng và cập nhật cơ sở dữ liệu tần suất alen STR cho các dân tộc Việt Nam: Mở rộng khảo sát với số lượng mẫu lớn hơn và bao phủ các dân tộc thiểu số để hoàn thiện cơ sở dữ liệu, đảm bảo tính đại diện và ứng dụng rộng rãi trong giám định ADN hình sự. Chủ thể thực hiện: Viện Khoa học hình sự phối hợp các cơ quan liên quan. Thời gian: 3-5 năm.

2. Triển khai ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới MiSeq FGxTM trong giám định ADN hình sự: Đào tạo nhân lực, đầu tư trang thiết bị và xây dựng quy trình chuẩn để nâng cao hiệu quả và độ chính xác trong phân tích ADN. Chủ thể thực hiện: Bộ Công an, Viện Khoa học hình sự. Thời gian: 1-2 năm.

3. Phát triển phần mềm và công cụ phân tích dữ liệu phù hợp với bộ kit ForenSeqTM DNA Signature Prep: Tối ưu hóa quy trình xử lý dữ liệu, tính toán tần suất alen và các chỉ số đa hình, hỗ trợ phân tích mẫu phức tạp và mẫu chất lượng kém. Chủ thể thực hiện: Các đơn vị nghiên cứu công nghệ sinh học và công nghệ thông tin. Thời gian: 1-3 năm.

4. Xây dựng cơ sở pháp lý và hướng dẫn kỹ thuật cho việc sử dụng dữ liệu tần suất alen trong giám định ADN hình sự: Ban hành các văn bản quy phạm pháp luật, tiêu chuẩn kỹ thuật và hướng dẫn áp dụng để đảm bảo tính pháp lý và khoa học trong kết luận giám định. Chủ thể thực hiện: Bộ Công an, Bộ Tư pháp. Thời gian: 1-2 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà khoa học và chuyên gia giám định ADN: Nghiên cứu, phát triển và ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới trong giám định ADN hình sự, nâng cao chất lượng và độ chính xác của kết quả giám định.

2. Cơ quan thực thi pháp luật và tố tụng: Sử dụng cơ sở dữ liệu tần suất alen để đánh giá chứng cứ ADN, hỗ trợ truy tố, bào chữa và giải quyết các vụ án hình sự liên quan đến ADN.

3. Các phòng thí nghiệm giám định ADN: Áp dụng bộ kit ForenSeqTM DNA Signature Prep và công nghệ MiSeq FGxTM trong phân tích mẫu, đặc biệt các mẫu khó, mẫu phân hủy hoặc mẫu hỗn hợp.

4. Các nhà nghiên cứu di truyền học dân tộc và nhân chủng học phân tử: Khai thác dữ liệu tần suất alen để nghiên cứu sự đa dạng di truyền, mối quan hệ giữa các dân tộc và lịch sử di cư tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất alen riêng cho từng dân tộc?
   Mỗi dân tộc có đặc điểm di truyền riêng biệt, tần suất alen khác nhau. Sử dụng cơ sở dữ liệu không phù hợp có thể dẫn đến sai lệch trong kết luận giám định ADN, làm giảm độ chính xác và tính khách quan của kết quả.

2. Bộ kit ForenSeqTM DNA Signature Prep - Mix A có ưu điểm gì so với các bộ kit truyền thống?
   Bộ kit này phân tích đồng thời 27 locus STR trên nhiễm sắc thể thường và nhiều locus SNP, với kích thước amplicon nhỏ phù hợp cho mẫu ADN phân hủy, sử dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới cho độ chính xác cao và khả năng phân tích mẫu lớn cùng lúc.

3. Số lượng mẫu 200 có đủ để xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất alen không?
   Theo khuyến cáo quốc tế, 200 mẫu là số lượng tiêu chuẩn đảm bảo tần suất alen được tính toán có độ tin cậy cao, đặc biệt với các locus có nhiều alen, giúp giảm sai số thống kê và tăng tính đại diện.

4. Công nghệ giải trình tự thế hệ mới có thể xử lý các mẫu ADN chất lượng kém như thế nào?
   Công nghệ này sử dụng amplicon kích thước nhỏ (60-460 bp), giúp khuếch đại và giải trình tự hiệu quả các đoạn ADN bị phân hủy hoặc đứt gãy, vượt trội so với công nghệ điện di mao quản truyền thống.

5. Làm thế nào để kiểm tra tính phù hợp của tần suất alen với quần thể cân bằng lý thuyết?
   Sử dụng kiểm định khi bình phương (χ2) so sánh tần suất alen quan sát với tần suất lý thuyết theo định luật Hardy-Weinberg. Nếu χ2 tính được nhỏ hơn giá trị lý thuyết với mức ý nghĩa 0,05, mẫu được coi là phù hợp với quần thể cân bằng.

Kết luận

• Đã xây dựng thành công cơ sở dữ liệu tần suất alen của 27 locus STR trên nhiễm sắc thể thường trong quần thể người dân tộc Kinh với 200 mẫu, đảm bảo độ tin cậy khoa học và phù hợp với định luật Hardy-Weinberg.
• Phát hiện sự đa dạng alen đặc trưng của quần thể Kinh, có sự khác biệt so với các quần thể khác và các bộ kit truyền thống, góp phần nâng cao độ chính xác trong giám định ADN hình sự.
• Bộ kit ForenSeqTM DNA Signature Prep - Mix A kết hợp công nghệ giải trình tự thế hệ mới MiSeq FGxTM là công cụ hiệu quả, phù hợp với điều kiện và yêu cầu giám định ADN hiện đại tại Việt Nam.
• Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học để xây dựng cơ sở pháp lý, triển khai ứng dụng công nghệ mới trong giám định ADN hình sự, đồng thời đóng góp vào hệ thống dữ liệu quốc tế.
• Đề xuất mở rộng nghiên cứu với các dân tộc thiểu số, phát triển phần mềm phân tích và hoàn thiện quy trình kỹ thuật nhằm nâng cao hiệu quả ứng dụng trong thực tiễn.

Khuyến khích các cơ quan chức năng và phòng thí nghiệm giám định ADN tại Việt Nam áp dụng kết quả nghiên cứu, đồng thời đầu tư phát triển công nghệ giải trình tự thế hệ mới để nâng cao chất lượng giám định ADN hình sự.

Trích đoạn nội dung tài liệu

2 đặc trưng, thể hiện bằng sự phân bố tần suất các alen trong mỗi quần thể là khác nhau và không thể áp dụng cơ sở dữ liệu của quần thể này cho một quần thể khác [1, 2]. Do đó, bắt buộc phải tiến hành khảo sát tần suất các alen của các locus dùng trong giám định ADN hình sự đối với mỗi dân tộc để đảm bảo tính khoa học, chính xác, khách quan trong kết luận giám định. Viện Khoa học hình sự là cơ quan tiên phong ở Việt Nam triển khai ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới MiSeq FGx với bộ kit ForenSeqTM DNA Signature Prep - Mix A trong lĩnh vực giám định ADN. Để ứng dụng công nghệ mới, vấn đề cấp bách đặt ra phải nghiên cứu tính đa hình và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen của các locus STR trên nhiễm sắc thể thường trong bộ kit ForenSeqTM DNA Signature Prep - Mix A, trước mắt với quần thể người dân tộc Kinh, là dân tộc chiếm gần 90% tổng số dân của Việt Nam.

Kết quả nghiên cứu sẽ là căn cứ khoa học vững chắc để xây dựng cơ sở pháp lý cho việc ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới trong giám định ADN hình sự tại Việt Nam. Để đáp ứng nhu cầu cấp bách trên, chúng tôi thực hiện đề tài "Nghiên cứu tính đa hình và tần suất các alen của 27 locus STR trên nhiễm sắc thể thường bằng bộ kit ForenSeq ứng dụng trong giám định ADN hình sự tại Việt Nam". Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Mục tiêu tổng quát của đề tài là xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất alen của 27 locus STR trên nhiễm sắc thể thường trong bộ kít ForenSeqTM DNA Signature Prep - Mix A đối với quần thể người dân tộc Kinh tại Việt Nam để ứng dụng trong giám định ADN hình sự. - Mục tiêu cụ thể của đề tài là xác định tần suất các alen và đánh giá tính đa hình của 27 locus STR trên nhiễm sắc thể thường thuộc bộ kit ForenSeqTM DNA Signature Prep - Mix A từ 200 cá thể người dân tộc Kinh tại Việt Nam, từ đó đề xuất khả năng ứng dụng của bộ kit ForenSeqTM DNA Signature Prep - Mix A trong lĩnh vực giám định ADN tại Việt Nam.

3 Phạm vi nghiên cứu của đề tài Đề tài tập trung nghiên cứu, phân tích 27 locus STR trên nhiễm sắc thể thường trong bộ kit ForenSeqTM DNA Signature Prep - Mix A của 200 phạm nhân dân tộc Kinh thuộc dự án “Tàng thư gen tội phạm quốc gia" với các nội dung sau: - Thu ngẫu nhiên 200 mẫu máu của 200 phạm nhân dân tộc Kinh đã thu thập được thuộc dự án “Tàng thư gen tội phạm quốc gia”. - Phân tích ADN bằng bộ kit ForenSeqTM DNA Signature Prep - Mix A trên hệ thống giải trình tự thế hệ mới MiSeq FGx của hãng Illumina từ 200 mẫu máu người dân tộc Kinh. - Thống kê, tính toán tần suất các alen của 27 locus STR trên nhiễm sắc thể thường từ 200 kiểu gen. - Kiểm định kết quả và so sánh với tính đa hình của các bộ kit đang được sử dụng để giám định ADN hình sự tại Việt Nam.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Lần đầu tiên tại Việt Nam có nghiên cứu chi tiết trên quần thể người dân tộc Kinh về tính đa hình và đưa ra bảng tần suất các alen của 27 locus STR trên nhiễm sắc thể thường thuộc bộ kit ForenSeqTM DNA Signature Prep - Mix A với số lượng mẫu đủ lớn (200 mẫu). Kết quả của đề tài là căn cứ khoa học để xây dựng cơ sở pháp lý và triển khai ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới với bộ kit ForenSeqTM DNA Signature Prep - Mix A, đưa ra kết luận giám định trong lĩnh vực giám định ADN hình sự tại Việt Nam. Kết quả của đề tài đóng góp cho hệ thống dữ liệu quốc tế về tần suất các alen của người dân tộc Kinh tại Việt Nam. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

KHÁI NIỆM VỀ CÁC LOCUS TRÌNH TỰ LẶP LẠI NGẮN (SORT TANDEM REPEAT - STR) 1. Khái niệm Cũng như ADN ở sinh vật nhân chuẩn khác, ADN nhân tế bào ở người gồm những trình tự mã hoá (các exon) xen kẽ với những trình tự không mã hoá (các intron) [2, 3]. Tuỳ mức độ hiện diện của chúng trong nhân, các trình tự ADN có thể được phân loại như sau: - Các trình tự duy nhất: là các gen mã hoá cho các protein có trình tự đặc trưng cho từng gen. - Các trình tự có số lần lặp lại trung bình: chiếm khoảng 25 - 40% bộ gen người, chúng có kích thước từ 100 - 1.000 kb, đa dạng hơn các trình tự lặp lại nhiều lần.

Các trình tự này không tập trung mà phân tán trên toàn bộ hệ gen. Chúng có thể là những trình tự không mã hoá với chức năng chưa rõ hoặc cũng có thể là những trình tự mã hoá (các gen mã hoá cho ARN riboxom, ARN vận chuyển. - Các trình tự lặp lại nhiều lần: Chiếm 10 - 15% bộ gen. Đó là những trình tự ADN ngắn (10 - 200 kb), không mã hoá, thường tập trung ở những vùng chuyên biệt trên nhiễm sắc thể (vùng tâm động, vùng đầu nhiễm sắc thể).

Các đoạn ADN (locus) được sử dụng trong giám định hình sự là các locus nằm ở vùng không mã hoá (intron) của ADN. Thời kỳ đầu của công nghệ giám định ADN trong nhân tế bào, người ta áp dụng các kỹ thuật phân tích các locus có đoạn lặp trung bình (Variable Number of Tandem Repeat – VNTR hay Minisatellite). Nhưng những kỹ thuật này chỉ áp dụng được với từng locus riêng lẻ (single locus) và phụ thuộc vào thao tác kỹ thuật của người thực hiện nên dễ xảy ra sai sót. Từ năm 1990 cho tới nay các nhà khoa học hình sự sử dụng các kỹ thuật phân tích các đoạn ADN có cấu trúc lặp lại từ 2 bp - 6 bp được gọi là các đoạn lặp lại ngắn (Short Tandem Repeat - STR hay Microsatellite) vì 5 chúng khá bền vững, có khả năng phân tích đồng thời nhiều locus, ít phụ thuộc vào thao tác kỹ thuật của người thực hiện.

Số lần các đoạn lặp có thể khác nhau rất nhiều giữa các cá thể, chính đặc điểm này mang lại giá trị trong truy nguyên cá thể [4, 5]. Các cấu trúc VNTR hay STR đều mang tính bảo thủ cao, được di truyền qua các thế hệ và mang tính đặc trưng cho cá thể. Như vậy, có thể hiểu các locus trình tự lặp lại ngắn ( Short Tandem Repeat - STR) là các đoạn ADN có cấu trúc lặp lại từ 2 bp - 6 bp. Để một locus STR sử dụng trong giám định ADN, với mục đích truy nguyên cá thể và xác định huyết thống, phải thỏa mãn những yêu cầu sau: Thứ nhất, các locus STR phải có tính đa hình và mức độ dị hợp tử cao.

Thứ hai, các locus STR có kích thước ngắn từ 100 bp - 500 bp, do các đoạn ADN ngắn sẽ bền vững hơn, ít bị đứt gãy hơn khi có tác động của điều kiện tự nhiên và quá trình nhân bản ADN dễ dàng hơn, có hiệu suất cao hơn đối với các đoạn ADN dài. Đối với những đoạn ADN có tính đa hình cao nhưng kích thước lớn, trong thực tế chỉ có thể thực hiện kỹ thuật PCR cho ra kết quả tốt với những mẫu dấu vết, mẫu so sánh còn mới hoặc được bảo quản trong những điều kiện tốt. Thứ ba, các locus dùng trong giám định ADN hình sự thường phải di truyền độc lập nhau. Như vậy chúng phải nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau, điều này đảm bảo cho tính phân ly độc lập của từng locus dẫn tới tính đa hình kiểu gen trong quần thể [6, 7].

Vì những lý do trên, những trình tự lặp lại chứa các đơn vị lặp lại gồm 4 nucleotit, ví dụ (AGTA)n được ứng dụng nhiều hơn so với các đoạn lặp hình thành từ 2 hoặc 3 nucleotit, ví dụ (CAA)n, (CA)n hoặc những đoạn đa hình hình thành từ các đoạn lặp chứa các đơn vị lặp lại gồm 5 nucleotit ví dụ (CCAAG)n hoặc 6 nucleotit như (CCAACA)n. Ngày nay, nhiều đoạn ADN đa hình có trình tự lặp lại bộ 4 nucleotit đã được nghiên cứu và ứng dụng trong nhận dạng do nó đáp ứng được những yêu cầu của công tác giám định ADN. Một locus STR trong nhân tế bào thường được lựa chọn để sử dụng trong giám định ADN hình sự nếu nó có nhiều alen khác nhau trong quần 6 thể (nhiều hơn 5 alen) và số các cá thể dị hợp tử trong quần thể lớn hơn 70% [8, 9]. Càng nhiều locus STR được phân tích thì khả năng kết luận mẫu dấu vết có cùng một nguồn gốc cơ thể của một người nào đó càng cao.

Danh pháp quốc tế của các locus STR Tên các locus STR được đặt theo tên của gen nếu locus này nằm một phần hoặc nằm toàn bộ trong gen [10]. Ví dụ locus STR TH01 có nguồn gốc từ tên gen tổng hợp enzym tyrosine hydroxylase của người, nằm trên NST số 11. Chữ "TH" xuất phát từ chữ cái đầu tyrosine hydroxylase. Số "01" của ký hiệu "TH01" xuất phát từ vùng intron 1 của gen tổng hợp enzym này.

Đôi khi tiết đầu ngữ HUM (human) được thêm vào đầu tên của locus này để xác định đó là từ hệ gen người. Vì vậy, locus STR này được đặt tên là HUM - TH01 hay TH01. Vị trí một số locus trên nhiễm sắc thể sử dụng trong giám định ADN của một số bộ kít phổ biến hiện nay [11] Các trình tự ADN nằm ngoài vùng gen được định tên bằng vị trí của chúng trên NST. Ví dụ, locus D5S818 và D7S820 đó là những tên gọi cho các locus STR không nằm trong vùng gen.

Trong trường hợp này chữ D có nghĩa 7 là ADN. Chữ số tiếp theo là số thứ tự của NST. Chữ "S" là trình tự đơn lẻ (single) của locus ADN. Những số cuối là vị trí trình tự đoạn ADN nằm trên mỗi NST riêng biệt.

Chữ số này là duy nhất trong nhận dạng cá thể. Ví dụ, locus ADN D7S820 (Hình 1.1) được giải nghĩa là D: ADN, 7: NST số 7, S: trình tự đơn lẻ (single copy sequence), 820: vị trí thứ 820 xác định trên NST số 7 [8]. CƠ SỞ DỮ LIỆU TẦN SUẤT CÁC ALEN 1. Khái niệm cơ sở dữ liệu tần suất các alen Cơ sở dữ liệu tần suất các alen là bảng tần số tương đối của các alen trên một locus di truyền trong quần thể, thông thường được thể hiện dưới dạng tỷ lệ hoặc tỷ lệ phần trăm.