Nghiên cứu thiết kế mẫu kiểm định giá trị xử lý DNA với bisulfite

• Người hướng dẫn: PGS. Võ Thị Thương Lan
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Khoa học tự nhiên
• Đề tài: Nghiên cứu thiết kế mẫu kiểm định giá trị xử lý DNA với bisulfite
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Giới thiệu về kỹ thuật PCR
• 1.2. Ứng dụng của kỹ thuật PCR định lượng
• 1.3. Mẫu nội kiểm
• 2. CHƯƠNG 2: ĐẶT BÀNG
• 2.1. Trình tự DNA và mồi sử dụng trong nghiên cứu
• 2.2. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR I và Uni
• 2.3. Thành phần phản ứng PCR I sau xử lý bisulfite với mồi
• 2.4. Thành phần phản ứng PCR gDNA sau xử lý bisulfite với mồi
• 2.5. Thành phần và điều kiện phản ứng Real-Time PCR khuếch đại mẫu nội kiểm sau xử lý bisulfite
• 2.6. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR kiểm tra khuẩn laze với mồi velector PTZ57
• 2.7. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR mở vòng plasmid bằng enzyme giới hạn
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả độ nồng độ của I và Uni sau khi tính sai số
• 3.2. Giá trị ΔCt trung bình của mẫu chuẩn
• 3.3. Giá trị ΔCt và tỷ lệ xử lý bisulfite của các nhóm PCR
• 3.4. Phối trộn DNA mẫu bệnh phẩm
• 3.5. Kết quả giải trình tự PCR ở một số mẫu sau xử lý bisulfite
• 3.6. Hình ảnh kết quả giải trình tự PCR
• 3.7. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR mẫu MT15 và MT15-XL
• 3.8. Đồ thị so sánh giá trị ΔCt của ba nhóm mẫu chuẩn
• 3.9. Đồ thị so sánh tỷ lệ xử lý bisulfite giữa ba nhóm PCR phối hợp
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Thiết Kế Mẫu Kiểm Định DNA Bisulfite

Các phương pháp sinh học phân tử ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng đòi hỏi độ chính xác, độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Một công cụ hữu hiệu giúp nâng cao độ tin cậy cho các thử nghiệm phân tử là sử dụng các mẫu đối chứng nội kiểm. Đối chứng nội kiểm tham gia kiểm soát các quy trình, phản ứng mà không ảnh hưởng đến bản chất phân tử đích, đảm bảo kết quả chính xác với độ tin cậy cao. Các mẫu nội kiểm được sử dụng nhiều cho các quy trình tách chiết và khuếch đại DNA/RNA góp phần xây dựng các hệ thống phát hiện những biến đổi di truyền hay chẩn đoán mầm bệnh hiệu quả. Các biến đổi di truyền ngoại sinh đã trở thành dấu chuẩn phân tử trong chẩn đoán bệnh. Trong đó, hiện tượng methyl hóa được nghiên cứu phổ biến hơn cả do sự methyl hóa quá mức của một số gen có liên quan chặt chẽ tới quá trình hình thành và phát sinh ung thư. Trong các phương pháp được sử dụng để nghiên cứu hiện tượng này, xử lý DNA với bisulfite có những ưu thế hơn hẳn các phương pháp khác. Tuy nhiên, hầu như chưa có một hệ thống nội kiểm nào thực sự hoàn thiện để kiểm soát quá trình xử lý bisulfite. Việc bổ sung mẫu nội kiểm cho phương pháp phân tích methyl hóa này sẽ góp phần kiểm định tính chính xác của kết quả, hỗ trợ chẩn đoán và tiên lượng đúng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Thiết kế mẫu nội kiểm đánh giá mức độ xử lý DNA với bisulfite” nhằm đưa ra một công cụ hỗ trợ việc kiểm soát quá trình xử lý bisulfite và đánh giá được mức độ xử lý DNA với bisulfite.

1.1. Giới thiệu về phương pháp xử lý DNA bằng Bisulfite

Xử lý DNA bằng bisulfite là một kỹ thuật quan trọng trong lĩnh vực epigenetics, cho phép phân tích DNA methylation. Quá trình này dựa trên việc chuyển đổi cytosine thành uracil khi cytosine không bị methyl hóa, trong khi 5-methylcytosine (5mC) thì không bị chuyển đổi. Điều này tạo ra sự khác biệt về trình tự DNA có thể được phát hiện bằng các phương pháp như bisulfite sequencing hoặc bisulfite PCR. Kỹ thuật này đóng vai trò quan trọng trong việc nghiên cứu các bệnh liên quan đến methyl hóa DNA và các quá trình phát triển.

1.2. Tầm quan trọng của kiểm định giá trị xử lý DNA Bisulfite

Việc kiểm định giá trị xử lý DNA bisulfite là rất quan trọng để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của các kết quả nghiên cứu. Nếu quá trình xử lý không hoàn toàn, các cytosine không methyl hóa có thể không được chuyển đổi thành uracil, dẫn đến kết quả sai lệch. Do đó, cần có các mẫu kiểm định để đánh giá hiệu quả xử lý bisulfite và đảm bảo rằng các kết quả thu được phản ánh đúng trạng thái methyl hóa DNA thực tế.

II. Kỹ Thuật PCR Định Lượng Nền Tảng Kiểm Định DNA Bisulfite

Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction – PCR) là một trong những phát minh quan trọng nhất trong lĩnh vực kỹ thuật sinh học phân tử. PCR là nền tảng cho một loạt các tiến bộ khoa học như giải trình tự hệ gen, biểu hiện gen trong hệ thống tái tổ hợp và các nghiên cứu di truyền phân tử như xác định huyết thống hay chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng [59]. Phương pháp này được Kary Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. Kể từ khi ra đời, kỹ thuật này đã gây ra một cuộc cách mạng thực sự trong nghiên cứu sinh học, có ý nghĩa lớn trong lĩnh vực chẩn đoán và cải tiến di truyền [48]. Kỹ thuật PCR là một phương pháp tổng hợp DNA trong ống nghiệm dựa trên hoạt động của enzyme DNA polymerase bền nhiệt, cho phép khuếch đại một sợi khuôn ban đầu thành hàng triệu bản sao. Cơ chế của quá trình này tương tự như quá trình sao chép DNA trong tế bào nhưng đoạn DNA khuếch đại được giới hạn bởi cặp mồi đặc hiệu. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ vào hoạt động của DNA polymerase, đoạn mồi này được kéo dài để hình thành mạch mới [45].

2.1. Tổng quan về kỹ thuật Real time PCR trong kiểm định

Real-time PCR đã trở thành một trong những phương pháp định lượng được sử dụng rộng rãi nhất bởi phổ phân tích rộng, có khả năng khuếch đại mẫu trong ống nghiệm lên hàng tỷ bản sao với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Đặc biệt, kết quả khuếch đại DNA đích được hiển thị sau mỗi chu kỳ của phản ứng nhiệt. Cơ sở của kỹ thuật này dựa trên cường độ phát màu huỳnh quang được máy ghi nhận tương quan với nồng độ sản phẩm PCR được khuếch đại tại thời điểm tương ứng [62]. Phản ứng Real-time PCR được đặc trưng bởi chu kỳ tại thời điểm bắt đầu phát hiện được tín hiệu khuếch đại của mẫu. Giá trị này được gọi là chu kỳ ngưỡng hay Ct, đây là thời điểm mà tín hiệu huỳnh quang của mẫu lớn hơn tín hiệu huỳnh quang nền. Các mẫu khác nhau sẽ có Ct khác nhau phụ thuộc vào số lượng phân tử DNA đích ban đầu [27].

2.2. Các ứng dụng của Real time PCR trong nghiên cứu DNA

Kỹ thuật Real-time PCR có nhiều ứng dụng quan trọng trong nghiên cứu DNA, bao gồm định lượng DNA, phát hiện biến đổi di truyền, và nghiên cứu biểu hiện gen. Trong lĩnh vực kiểm định giá trị xử lý DNA bisulfite, Real-time PCR được sử dụng để đo lường mức độ chuyển đổi cytosine thành uracil, từ đó đánh giá hiệu quả của quá trình xử lý. Kỹ thuật này cũng có thể được sử dụng để xác định tỷ lệ methylated cytosine và unmethylated cytosine trong mẫu DNA.

2.3. Các loại hóa chất phát hiện tín hiệu huỳnh quang trong Real time PCR

Hiện nay có nhiều loại hóa chất khác nhau có khả năng phát hiện tín hiệu huỳnh quang dùng trong phản ứng Real-time PCR. Một số hóa chất được dùng phổ biến có thể kể đến như: đầu dò đánh dấu huỳnh quang Taqman, đầu dò phân tử Beacons, đầu dò lai, mồi Scorpion, thuốc nhuộm huỳnh quang SYBR Green [23]. Đầu dò TaqMan là những oligo nucleotide có trình tự bổ sung đặc hiệu trên phân tử DNA đích. Đầu 5’ của đầu dò có gắn chất phát huỳnh quang (reporter), đầu 3’ gắn chất hấp thụ (quencher) để hấp thụ ánh sáng huỳnh quang phát ra từ reporter. Trong quá trình PCR, khi Taq polymerase kéo dài chuỗi đến vị trí đầu dò Taqman gắn trên sợi khuôn, Taq polymerase sẽ cắt bỏ đầu dò nhờ hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease. Khi đó reporter của đầu dò Taqman sẽ được giải phóng rời xa quencher và có khả năng phát huỳnh quang khi nhận nguồn sáng kích thích [52].

III. Thiết Kế Mẫu Nội Kiểm Đánh Giá Xử Lý DNA Bisulfite

Việc thiết kế mẫu nội kiểm (Internal Control - IC) là một bước quan trọng để đảm bảo chất lượng và độ tin cậy của quá trình xử lý DNA bằng bisulfite. Mẫu nội kiểm giúp theo dõi hiệu quả chuyển đổi cytosine thành uracil và phát hiện các sai sót có thể xảy ra trong quá trình này. Một mẫu nội kiểm lý tưởng nên có các đặc điểm sau: (1) Có trình tự DNA đã biết và có thể được khuếch đại bằng PCR; (2) Chứa các vị trí cytosine có thể bị methyl hóa hoặc không methyl hóa; (3) Có thể được phân biệt với DNA mục tiêu bằng kích thước hoặc trình tự; (4) Ổn định và dễ dàng sử dụng.

3.1. Tiêu chí lựa chọn trình tự DNA cho mẫu nội kiểm

Việc lựa chọn trình tự DNA cho mẫu nội kiểm cần tuân thủ một số tiêu chí quan trọng. Trình tự nên có độ phức tạp vừa phải, không chứa các đoạn lặp lại quá nhiều hoặc các cấu trúc bậc hai phức tạp có thể gây khó khăn cho quá trình khuếch đại PCR. Ngoài ra, trình tự nên có độ tương đồng thấp với các trình tự DNA khác trong hệ gen để tránh khuếch đại không đặc hiệu. Số lượng vị trí cytosine trong trình tự cũng cần được cân nhắc để đảm bảo khả năng đánh giá hiệu quả chuyển đổi bisulfite một cách chính xác.

3.2. Phương pháp tạo mẫu nội kiểm DNA Bisulfite

Có nhiều phương pháp để tạo mẫu nội kiểm DNA bisulfite, bao gồm tổng hợp DNA từ đầu, sử dụng plasmid chứa trình tự mục tiêu, hoặc sử dụng DNA hệ gen đã được methyl hóa hoặc không methyl hóa. Mỗi phương pháp có những ưu điểm và nhược điểm riêng, tùy thuộc vào mục đích sử dụng và nguồn lực có sẵn. Ví dụ, tổng hợp DNA từ đầu cho phép kiểm soát hoàn toàn trình tự và mức độ methyl hóa, nhưng có thể tốn kém và mất thời gian. Sử dụng plasmid hoặc DNA hệ gen có thể nhanh chóng và tiết kiệm chi phí hơn, nhưng cần đảm bảo tính đồng nhất và độ tinh khiết của mẫu.

3.3. Thiết kế mồi PCR đặc hiệu cho mẫu nội kiểm

Thiết kế mồi PCR đặc hiệu cho mẫu nội kiểm là rất quan trọng để đảm bảo khuếch đại chỉ xảy ra trên mẫu nội kiểm và không khuếch đại các trình tự DNA khác. Mồi nên được thiết kế sao cho có nhiệt độ nóng chảy (Tm) tương đồng và không tạo thành dimer hoặc cấu trúc kẹp tóc. Ngoài ra, cần kiểm tra tính đặc hiệu của mồi bằng các công cụ tin sinh học để đảm bảo không có sự bắt cặp không mong muốn với các trình tự DNA khác trong hệ gen.

IV. Ứng Dụng Mẫu Nội Kiểm Đánh Giá Mức Độ Xử Lý Bisulfite

Mẫu nội kiểm được thiết kế có thể được sử dụng để đánh giá mức độ xử lý bisulfite trong các mẫu DNA khác nhau. Bằng cách so sánh kết quả PCR của mẫu nội kiểm với các mẫu DNA khác, có thể xác định được mức độ chuyển đổi cytosine thành uracil và đánh giá hiệu quả của quá trình xử lý bisulfite. Điều này giúp đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của các kết quả nghiên cứu liên quan đến methyl hóa DNA.

4.1. Quy trình kiểm tra hiệu quả xử lý Bisulfite bằng mẫu nội kiểm

Quy trình kiểm tra hiệu quả xử lý bisulfite bằng mẫu nội kiểm bao gồm các bước sau: (1) Thêm mẫu nội kiểm vào các mẫu DNA cần xử lý; (2) Tiến hành xử lý bisulfite theo quy trình chuẩn; (3) Khuếch đại mẫu nội kiểm và các mẫu DNA khác bằng PCR sử dụng mồi đặc hiệu; (4) Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di hoặc Real-time PCR để xác định mức độ chuyển đổi cytosine thành uracil; (5) So sánh kết quả của mẫu nội kiểm với các mẫu DNA khác để đánh giá hiệu quả xử lý bisulfite.

4.2. Phân tích kết quả và đánh giá độ tin cậy của dữ liệu

Phân tích kết quả và đánh giá độ tin cậy của dữ liệu là bước quan trọng để đảm bảo tính chính xác của các kết luận rút ra từ nghiên cứu. Cần xem xét các yếu tố như độ lặp lại của kết quả, sự phù hợp giữa kết quả của mẫu nội kiểm và các mẫu DNA khác, và sự nhất quán với các nghiên cứu trước đó. Nếu có bất kỳ sai sót hoặc không nhất quán nào, cần xem xét lại quy trình xử lý bisulfite và phân tích dữ liệu để xác định nguyên nhân và khắc phục.

4.3. Ứng dụng thực tiễn của mẫu nội kiểm trong nghiên cứu

Mẫu nội kiểm có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau, bao gồm nghiên cứu ung thư, bệnh di truyền, và phát triển. Ví dụ, trong nghiên cứu ung thư, mẫu nội kiểm có thể được sử dụng để xác định các thay đổi về methyl hóa DNA liên quan đến sự phát triển và tiến triển của bệnh. Trong nghiên cứu bệnh di truyền, mẫu nội kiểm có thể được sử dụng để xác định các đột biến hoặc biến thể di truyền ảnh hưởng đến quá trình methyl hóa DNA.

V. Kết Luận và Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Kiểm Định DNA

Việc thiết kế và sử dụng mẫu nội kiểm đánh giá mức độ xử lý DNA với bisulfite là một công cụ hữu hiệu để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của các kết quả nghiên cứu liên quan đến methyl hóa DNA. Nghiên cứu này đã cung cấp một phương pháp tiếp cận mới để kiểm soát quá trình xử lý bisulfite và đánh giá hiệu quả của quá trình này. Trong tương lai, có thể tiếp tục nghiên cứu và phát triển các mẫu nội kiểm phức tạp hơn, có khả năng đánh giá nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử lý bisulfite.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu và ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu đã thành công trong việc thiết kế và thử nghiệm một mẫu nội kiểm có khả năng đánh giá mức độ xử lý DNA với bisulfite. Kết quả cho thấy mẫu nội kiểm có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể được sử dụng để kiểm soát quá trình xử lý bisulfite và đánh giá hiệu quả của quá trình này. Ý nghĩa khoa học của nghiên cứu là cung cấp một công cụ hữu hiệu cho các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực methyl hóa DNA, giúp đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của các kết quả nghiên cứu.

5.2. Hướng phát triển và mở rộng ứng dụng của nghiên cứu

Trong tương lai, có thể tiếp tục nghiên cứu và phát triển các mẫu nội kiểm phức tạp hơn, có khả năng đánh giá nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử lý bisulfite, chẳng hạn như nhiệt độ, thời gian, và nồng độ bisulfite. Ngoài ra, có thể mở rộng ứng dụng của mẫu nội kiểm trong các lĩnh vực nghiên cứu khác, chẳng hạn như nghiên cứu ung thư, bệnh di truyền, và phát triển. Việc phát triển các mẫu nội kiểm đa năng và dễ sử dụng sẽ giúp nâng cao chất lượng và độ tin cậy của các nghiên cứu liên quan đến methyl hóa DNA.