Luận văn thạc sĩ vnu uet nghiên cứu thiết kế và cố định adn đầu dò ứng dụng trong cảm biến adn định hướng phát hiện vi khuẩn streptococcus suis gây bệnh viêm màng não

Luận văn thạc sĩ VNU UET nghiên cứu thiết kế ADN đầu dò ứng dụng trong cảm biến phát hiện vi khuẩn Streptococcus suis gây viêm màng não.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thùy Dung
• Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Hiên
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ Nano Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu thiết kế ADN đầu dò trong cảm biến phát hiện vi khuẩn Streptococcus suis
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
• 1.1. Cảm biến sinh học và xu thế
• 1.2. Tổng quan cảm biến sinh học
• 1.3. Cảm biến ADN
• 1.4. Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi quang
• 1.5. Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi điện hóa
• 1.6. Cảm biển ADN dựa trên bộ chuyển đổi từ
• 1.7. Cảm biến sử dụng một lần
• 1.8. Các phương pháp cố định đầu dò ADN
• 1.8.1. Phương pháp vật lý
• 1.8.2. Phương pháp hóa học
• 1.8.3. Phương pháp sinh học
• 1.9. Giới thiệu vi khuẩn Streptococcus suis
• 2. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị
• 2.2. Hóa chất và dung dịch
• 2.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
• 2.4. Phương pháp chế tạo
• 2.5. Phương pháp thiết kế đầu dò
• 2.6. Phương pháp thiết kế mồi cho phản ứng PCR
• 2.7. Chế tạo thẻ SPA sử dụng một lần
• 2.8. Lai ADN với đầu dò trên thẻ SPA
• 2.9. Đánh dấu ADN bằng hạt từ-streptavidin
• 2.10. Tách ADN từ khuẩn lạc
• 2.11. Phương pháp PCR
• 2.12. Phương pháp nghiên cứu mẫu
• 2.13. Điện di ADN
• 2.14. Khảo sát bằng góc thấm ướt của đế qua các bước biến đổi bề mặt
• 2.15. Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi chuỗi Fourier
• 2.16. Xác định nồng độ ADN bằng quang phổ kế. Phương pháp kính hiện vị quang học
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Chế tạo thẻ sử dụng một lần
• 3.2. Chế tạo đế thẻ
• 3.3. Thiết kế ADN đầu dò đặc hiệu cho vi khuẩn S.
• 3.4. Cố định đầu dò SPA lên bề mặt đế thẻ sử dụng một lần
• 3.5. Lựa chọn phương pháp cố định đầu dò SPA
• 3.6. Khảo sát thời gian cố định đầu dò SPA
• 3.7. Khảo sát lượng đầu dò SPA cố định trên đế thẻ
• 3.8. Khảo sát thẻ SPA với ADN
• 3.9. Lai đầu dò SPA với ADN đích
• 3.10. Lai đầu dò SPA với ADN đối chứng
• 3.11. Đánh dấu ADN bằng hạt từ và đánh giá kết quả bằng cảm biến AMR
• 3.12. Đánh dấu ADN bằng hạt từ
• 3.13. Đánh giá kết quả đánh dấu ADN bằng hạt từ bằng cảm biến AMR
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu thiết kế ADN đầu dò trong cảm biến

Nghiên cứu thiết kế ADN đầu dò trong cảm biến phát hiện vi khuẩn Streptococcus suis là một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học. Cảm biến ADN giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác các tác nhân gây bệnh, đặc biệt là vi khuẩn gây viêm màng não. Việc phát triển các cảm biến này không chỉ nâng cao khả năng chẩn đoán mà còn giảm thiểu thời gian và chi phí xét nghiệm.

1.1. Cảm biến ADN và vai trò trong y sinh

Cảm biến ADN là thiết bị phân tích sinh học, sử dụng đầu thu ADN để phát hiện các gen đặc hiệu. Chúng có khả năng cung cấp thông tin nhanh chóng và chính xác về sự hiện diện của vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm.

1.2. Tại sao cần phát hiện vi khuẩn Streptococcus suis

Vi khuẩn Streptococcus suis gây ra nhiều bệnh lý nghiêm trọng ở lợn và có thể lây sang người. Việc phát hiện sớm giúp kiểm soát dịch bệnh và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

II. Thách thức trong việc phát hiện vi khuẩn Streptococcus suis

Mặc dù có nhiều phương pháp phát hiện vi khuẩn, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc phát hiện Streptococcus suis. Các phương pháp truyền thống như nuôi cấy vi khuẩn thường tốn thời gian và không đảm bảo độ nhạy cao. Hơn nữa, việc phát hiện nhanh chóng và chính xác là rất cần thiết trong bối cảnh dịch bệnh gia tăng.

2.1. Hạn chế của các phương pháp truyền thống

Các phương pháp như nuôi cấy vi khuẩn và phản ứng PCR thường yêu cầu thời gian dài và kỹ thuật phức tạp, dẫn đến việc chậm trễ trong chẩn đoán.

2.2. Nhu cầu về công nghệ cảm biến mới

Công nghệ cảm biến mới giúp cải thiện độ nhạy và độ chính xác trong việc phát hiện vi khuẩn, đồng thời giảm thiểu thời gian và chi phí xét nghiệm.

III. Phương pháp thiết kế ADN đầu dò cho cảm biến

Thiết kế ADN đầu dò là bước quan trọng trong việc phát triển cảm biến phát hiện vi khuẩn. Các phương pháp như kỹ thuật PCR và phân tích gen được áp dụng để tạo ra các đầu dò ADN đặc hiệu cho Streptococcus suis. Việc lựa chọn trình tự ADN phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu của cảm biến.

3.1. Kỹ thuật PCR trong thiết kế đầu dò

Kỹ thuật PCR cho phép nhân bản các đoạn ADN đặc hiệu, từ đó tạo ra các đầu dò có khả năng phát hiện chính xác vi khuẩn mục tiêu.

3.2. Phân tích gen để xác định trình tự ADN

Phân tích gen giúp xác định các trình tự ADN đặc trưng cho Streptococcus suis, từ đó thiết kế các đầu dò có độ nhạy cao.

IV. Ứng dụng thực tiễn của cảm biến ADN trong phát hiện vi khuẩn

Cảm biến ADN được ứng dụng rộng rãi trong việc phát hiện vi khuẩn Streptococcus suis. Chúng không chỉ giúp chẩn đoán nhanh chóng mà còn hỗ trợ trong việc theo dõi và kiểm soát dịch bệnh. Các thí nghiệm thực tế đã chứng minh hiệu quả của cảm biến trong việc phát hiện vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm.

4.1. Kết quả nghiên cứu từ các thí nghiệm

Nghiên cứu cho thấy cảm biến ADN có khả năng phát hiện vi khuẩn với độ nhạy và độ chính xác cao, giúp cải thiện quy trình chẩn đoán.

4.2. Tính khả thi trong ứng dụng công nghiệp

Cảm biến ADN có thể được áp dụng trong các phòng thí nghiệm và cơ sở y tế, giúp nâng cao hiệu quả trong việc phát hiện và kiểm soát dịch bệnh.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu cảm biến ADN

Nghiên cứu thiết kế ADN đầu dò trong cảm biến phát hiện vi khuẩn Streptococcus suis mở ra nhiều triển vọng cho công nghệ sinh học. Việc phát triển các cảm biến mới không chỉ giúp nâng cao khả năng chẩn đoán mà còn góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giải pháp hiệu quả hơn trong việc phát hiện và kiểm soát các bệnh truyền nhiễm.

5.1. Triển vọng phát triển công nghệ cảm biến

Công nghệ cảm biến ADN sẽ tiếp tục phát triển, với nhiều cải tiến về độ nhạy và độ chính xác, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao trong y sinh.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình thiết kế và chế tạo cảm biến, nhằm nâng cao hiệu quả phát hiện vi khuẩn trong các mẫu bệnh phẩm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong bối cảnh phát triển nhanh chóng của công nghệ sinh học và công nghệ nano, việc phát triển các cảm biến sinh học có độ nhạy cao, đặc hiệu và chi phí thấp đang là nhu cầu cấp thiết. Vi khuẩn Streptococcus suis (S. suis) là tác nhân gây bệnh viêm màng não nghiêm trọng ở lợn và người, với tỉ lệ tử vong từ 5% đến 20% theo báo cáo của Bộ Y tế năm 2014. Năm 2016, số ca bệnh do liên cầu lợn giảm 19.4% so với năm trước, tuy nhiên vẫn gây tổn thất kinh tế và nguy cơ sức khỏe cộng đồng cao. Các phương pháp xét nghiệm hiện tại như nuôi cấy, PCR, test Rapid Strep đều có hạn chế về chi phí, độ phức tạp và thời gian chờ kết quả.

Mục tiêu nghiên cứu là thiết kế và cố định ADN đầu dò đặc hiệu cho vi khuẩn S. suis trên thẻ sử dụng một lần, ứng dụng trong cảm biến ADN định hướng phát hiện vi khuẩn này. Nghiên cứu tập trung vào thiết kế đoạn ADN đầu dò đặc hiệu cho gen 16S rARN của S. suis, chế tạo thẻ SPA sử dụng một lần với bề mặt PDMS carboxyl được chức năng hóa, cố định ADN đầu dò bằng phương pháp hóa học và vật lý, đánh giá hiệu quả lai ADN đích với đầu dò trên thẻ, cũng như đánh dấu ADN đích bằng hạt từ để phát hiện bằng cảm biến từ AMR. Phạm vi nghiên cứu thực hiện tại Đại học Công nghệ - Đại học Quốc gia Hà Nội trong năm 2017, với các mẫu bệnh phẩm dịch não tủy và khuẩn lạc S. suis được cung cấp từ Bệnh viện Bạch Mai và Học viện Quân y.

Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển công nghệ cảm biến sinh học ứng dụng trong chẩn đoán nhanh, chính xác vi khuẩn gây bệnh, góp phần giảm thiểu chi phí xét nghiệm và nâng cao hiệu quả phòng chống dịch bệnh liên cầu lợn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cảm biến sinh học (Biosensor): Thiết bị tích hợp gồm phần cảm nhận sinh học (bioreceptor) và bộ chuyển đổi tín hiệu (transducer) để chuyển đổi tín hiệu sinh học thành tín hiệu điện, quang hoặc nhiệt. Cảm biến ADN sử dụng đoạn ADN đầu dò đặc hiệu để nhận biết ADN đích qua quá trình lai đặc hiệu.

• Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi từ: Phát hiện tín hiệu từ trường sinh ra từ các hạt siêu thuận từ được gắn lên ADN đích qua liên kết streptavidin-biotin, cho phép phát hiện định lượng ADN mục tiêu với độ nhạy cao.

• Phương pháp cố định ADN đầu dò: Bao gồm phương pháp vật lý (hấp phụ tĩnh điện), phương pháp hóa học (liên kết cộng hóa trị qua EDC/NHS giữa nhóm carboxyl trên bề mặt và nhóm amin trên ADN), và phương pháp sinh học (liên kết streptavidin-biotin). Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm riêng về độ bền, tính ổn định và chi phí.

• Khái niệm gen 16S rARN: Gen bảo thủ dùng để phân loại và định danh vi khuẩn, trong đó đoạn ADN đặc trưng được lựa chọn để thiết kế đầu dò đặc hiệu cho S. suis.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Trình tự gen 16S rARN của 10 chủng S. suis và 17 loài khác trong giống Streptococcus được thu thập từ ngân hàng gen NCBI. Mẫu bệnh phẩm dịch não tủy và khuẩn lạc S. suis được cung cấp từ Bệnh viện Bạch Mai và Học viện Quân y.

• Thiết kế đầu dò ADN: Sử dụng phần mềm ClustalX 2.11 để so sánh trình tự gen, chọn đoạn ADN đặc trưng thỏa mãn tiêu chí bảo thủ trong loài và khác biệt với các loài khác. Đầu dò oligonucleotide dài 43 nucleotide, tỉ lệ GC 40-60%, tránh cấu trúc kẹp tóc.

• Chế tạo thẻ SPA: Lớp PDMS phủ trên đế silic, xử lý bằng tia tử ngoại-ozon (UVO), chức năng hóa bằng APTES tạo nhóm amin, tiếp tục biến đổi nhóm amin thành nhóm carboxyl bằng Succinic acid anhydride (SAA). Đế PDMS carboxyl được dùng để cố định ADN đầu dò.

• Cố định ADN đầu dò: So sánh hai phương pháp vật lý (hấp phụ) và hóa học (EDC kích hoạt nhóm carboxyl liên kết với nhóm amin trên ADN). Định lượng lượng ADN cố định bằng quang phổ kế hấp thụ Nanodrop 2000 đo độ hấp thụ tại 260 nm.

• Lai ADN: Thực hiện lai ADN đích có gắn biotin với đầu dò cố định trên thẻ SPA ở 50°C trong 1 giờ, rửa sạch và thu dịch tan để đánh giá hiệu suất lai.

• Đánh dấu ADN đích: Sử dụng hạt từ streptavidin để đánh dấu ADN đích gắn biotin, quan sát bằng kính hiển vi quang học và đo tín hiệu bằng cảm biến từ AMR.

• Phân tích dữ liệu: Điện di gel agarose 1% và gel polyacrylamide 15% để xác nhận sản phẩm PCR, phổ FTIR để khảo sát biến đổi bề mặt, đo góc thấm ướt để đánh giá tính chất bề mặt, sử dụng phần mềm ImageJ để phân tích hình ảnh.

• Timeline nghiên cứu: Thực hiện trong khoảng thời gian hơn một năm, từ thiết kế đầu dò, chế tạo thẻ, cố định ADN, lai ADN đến đánh dấu và đo tín hiệu cảm biến.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Thiết kế ADN đầu dò đặc hiệu: Đoạn ADN đặc trưng dài 43 nucleotide được xác định trên gen 16S rARN của S. suis, có trình tự bảo thủ cao trong các chủng S. suis và khác biệt rõ rệt với các loài Streptococcus khác. Kết quả phân tích ClustalX 2.11 cho thấy đoạn này đáp ứng tiêu chí đặc hiệu, giảm thiểu dương tính và âm tính giả.

2. Chế tạo thẻ SPA và biến đổi bề mặt: Phổ FTIR cho thấy sự xuất hiện các đỉnh đặc trưng của nhóm amin (-NH2) và nhóm carboxyl (-COOH) trên bề mặt PDMS sau các bước chức năng hóa. Góc thấm ướt thay đổi từ 110º (PDMS nguyên bản) xuống còn 72º sau xử lý UVO, tăng lên 90º sau amin hóa bằng APTES và giảm còn 83º sau biến đổi nhóm carboxyl bằng SAA, chứng tỏ sự biến đổi tính chất bề mặt thành công.

3. Hiệu quả cố định ADN đầu dò: Phương pháp hóa học sử dụng EDC cho hiệu suất cố định ADN cao hơn đáng kể so với phương pháp vật lý. Lượng ADN cố định trên thẻ SPA đạt khoảng 85% so với lượng đầu dò ban đầu, trong khi phương pháp vật lý chỉ đạt khoảng 50%. Điều này được xác nhận qua đo độ hấp thụ tại 260 nm của dung dịch sau cố định.

4. Lai ADN đích với đầu dò trên thẻ SPA: Hiệu suất lai ADN đích tăng theo nồng độ ADN đầu vào, với tỉ lệ phản ứng đạt trên 90% ở nồng độ 18 pmol. Lai với ADN đối chứng không bổ sung cho đầu dò cho kết quả âm tính, chứng tỏ tính đặc hiệu cao của đầu dò.

5. Đánh dấu ADN đích bằng hạt từ và phát hiện bằng cảm biến AMR: Tín hiệu từ cảm biến AMR tăng tỉ lệ thuận với lượng ADN đích lai trên thẻ SPA, trong khi mẫu đối chứng không có tín hiệu đáng kể. Quan sát kính hiển vi quang học cho thấy sự phân bố đồng đều của hạt từ trên bề mặt thẻ sau đánh dấu.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc thiết kế đoạn ADN đầu dò đặc hiệu trên gen 16S rARN của S. suis là khả thi và hiệu quả, phù hợp với các tiêu chuẩn về độ dài, tỉ lệ GC và tránh cấu trúc kẹp tóc. Việc sử dụng phương pháp hóa học với EDC để cố định ADN đầu dò lên bề mặt PDMS carboxyl giúp tăng độ bền và ổn định của lớp đầu dò, đồng thời đảm bảo định hướng phân tử tốt hơn so với phương pháp vật lý hấp phụ.

Sự biến đổi bề mặt PDMS qua các bước xử lý UVO, amin hóa và carboxyl hóa được xác nhận rõ ràng qua phổ FTIR và góc thấm ướt, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình cố định ADN. Hiệu suất lai ADN đích cao và tính đặc hiệu được đảm bảo nhờ thiết kế đầu dò chính xác, giảm thiểu sai số dương tính giả.

Việc đánh dấu ADN đích bằng hạt từ streptavidin và phát hiện bằng cảm biến AMR cho thấy tiềm năng ứng dụng trong phát hiện nhanh vi khuẩn S. suis với độ nhạy cao, chi phí thấp và khả năng sản xuất công nghiệp thẻ sử dụng một lần. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi từ và phương pháp cố định ADN bằng liên kết streptavidin-biotin.

Dữ liệu có thể được trình bày qua các biểu đồ thể hiện sự thay đổi góc thấm ướt sau từng bước xử lý bề mặt, biểu đồ hiệu suất cố định ADN so sánh hai phương pháp, đồ thị tín hiệu cảm biến AMR theo nồng độ ADN đích, và ảnh kính hiển vi quang học minh họa sự phân bố hạt từ trên thẻ SPA.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Ứng dụng phương pháp hóa học EDC/NHS trong cố định ADN đầu dò: Khuyến nghị sử dụng phương pháp này để tăng độ bền và hiệu suất cố định ADN trên bề mặt cảm biến, nhằm nâng cao độ nhạy và độ ổn định của cảm biến ADN trong phát hiện vi khuẩn S. suis. Thời gian thực hiện: 1-2 tháng để tối ưu quy trình.

2. Phát triển thẻ SPA sử dụng một lần với bề mặt PDMS carboxyl: Đề xuất sản xuất thẻ SPA quy mô công nghiệp để giảm chi phí xét nghiệm, tăng tính tiện dụng và khả năng tái sử dụng cảm biến chính. Chủ thể thực hiện: các doanh nghiệp công nghệ sinh học, thời gian triển khai 6-12 tháng.

3. Tích hợp cảm biến AMR với hệ thống đánh dấu hạt từ: Đề xuất phát triển hệ thống cảm biến từ kết hợp với đánh dấu hạt từ để nâng cao độ nhạy và khả năng phát hiện định lượng ADN đích trong mẫu bệnh phẩm. Thời gian nghiên cứu và phát triển: 12 tháng.

4. Mở rộng nghiên cứu thiết kế đầu dò cho các chủng S. suis khác và các vi khuẩn gây bệnh liên quan: Đề xuất thiết kế thêm các đầu dò đặc hiệu cho các typ huyết thanh khác của S. suis và các vi khuẩn liên quan để tăng phạm vi ứng dụng của cảm biến. Thời gian thực hiện: 6-9 tháng.

5. Đào tạo và chuyển giao công nghệ: Khuyến nghị tổ chức các khóa đào tạo kỹ thuật cho các phòng xét nghiệm và doanh nghiệp để ứng dụng công nghệ cảm biến ADN trong chẩn đoán nhanh vi khuẩn S. suis. Chủ thể: các trường đại học, viện nghiên cứu, thời gian 3-6 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu công nghệ sinh học và công nghệ nano: Luận văn cung cấp phương pháp thiết kế đầu dò ADN đặc hiệu, kỹ thuật cố định ADN và ứng dụng cảm biến từ, giúp phát triển các cảm biến sinh học mới.

2. Phòng xét nghiệm chẩn đoán vi sinh vật: Nghiên cứu cung cấp giải pháp xét nghiệm nhanh, chính xác vi khuẩn S. suis với chi phí thấp, phù hợp cho các phòng xét nghiệm bệnh viện và trung tâm y tế.

3. Doanh nghiệp sản xuất thiết bị y sinh và cảm biến sinh học: Thông tin về quy trình chế tạo thẻ SPA sử dụng một lần và tích hợp cảm biến AMR giúp phát triển sản phẩm thương mại có tính cạnh tranh cao.

4. Cơ quan quản lý y tế và thú y: Luận văn cung cấp cơ sở khoa học cho việc áp dụng công nghệ mới trong giám sát và phòng chống bệnh liên cầu lợn, góp phần nâng cao hiệu quả quản lý dịch bệnh.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chọn gen 16S rARN để thiết kế đầu dò ADN?
   Gen 16S rARN là gen bảo thủ, phổ biến trong phân loại vi khuẩn, giúp xác định đặc hiệu loài S. suis nhờ các vùng biến đổi đặc trưng, giảm thiểu sai số trong phát hiện.

2. Phương pháp cố định ADN nào hiệu quả nhất?
   Phương pháp hóa học sử dụng EDC/NHS cho hiệu suất cố định cao hơn, liên kết bền vững hơn so với phương pháp vật lý hấp phụ, phù hợp với điều kiện môi trường thay đổi.

3. Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi từ có ưu điểm gì?
   Cảm biến từ có độ nhạy cao, khả năng phát hiện định lượng ADN đích, chi phí thấp và dễ dàng tích hợp trong hệ thống cảm biến mini, phù hợp với sản xuất công nghiệp.

4. Làm thế nào để đánh giá hiệu quả lai ADN trên thẻ SPA?
   Hiệu quả lai được đánh giá bằng đo lượng ADN còn lại trong dung dịch sau lai qua quang phổ kế hấp thụ, đồng thời quan sát sự hiện diện của hạt từ đánh dấu trên bề mặt thẻ.

5. Ứng dụng thực tế của cảm biến này trong chẩn đoán bệnh?
   Cảm biến cho phép phát hiện nhanh vi khuẩn S. suis trong mẫu bệnh phẩm dịch não tủy, giúp chẩn đoán sớm và chính xác bệnh viêm màng não do liên cầu lợn, giảm thiểu thời gian và chi phí xét nghiệm.

Kết luận

• Đã thiết kế thành công đoạn ADN đầu dò đặc hiệu cho gen 16S rARN của S. suis, đảm bảo tính đặc hiệu và hiệu quả lai cao.
• Chế tạo thẻ SPA sử dụng một lần với bề mặt PDMS carboxyl được chức năng hóa thành công, phù hợp cho cố định ADN đầu dò bằng phương pháp hóa học.
• Phương pháp cố định ADN bằng EDC/NHS cho hiệu suất và độ bền cao hơn so với phương pháp vật lý hấp phụ.
• Đánh dấu ADN đích bằng hạt từ streptavidin kết hợp cảm biến AMR cho phép phát hiện định lượng ADN đích với độ nhạy cao.
• Nghiên cứu mở ra hướng phát triển cảm biến sinh học ứng dụng trong chẩn đoán nhanh vi khuẩn gây bệnh, có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong y tế và thú y.

Next steps: Triển khai sản xuất thẻ SPA quy mô công nghiệp, tối ưu hóa hệ thống cảm biến AMR, mở rộng nghiên cứu đầu dò cho các chủng khác và đào tạo chuyển giao công nghệ.

Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp trong lĩnh vực công nghệ sinh học được khuyến khích hợp tác phát triển và ứng dụng công nghệ cảm biến ADN này để nâng cao hiệu quả chẩn đoán và phòng chống bệnh liên cầu lợn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1. Cảm biến sinh học và xu thế 1. Tổng quan cảm biến sinh học Cảm biến sinh học (biosensor viết tắt của biological sensor) là loại thiết bị phân tích bao gồm phần cảm nhận sinh học kết hợp với bộ chuyển đổi tín hiệu (hình 1.1) chuyển một tín hiệu sinh học thành một tín hiệu điện, nhiệt hoặc quang. Theo IUPAC (International Union of Pure ADN Applied Chemistry) “Cảm biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm phân tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi”.

Cấu tạo cảm biến sinh học (internet) Cấu tạo của một cảm biến sinh học gồm 3 phần chính: 1. Đầu thu sinh học (bioreceptors/sensitive biological elements) là các nhân tố sinh học hoặc giả sinh học như các thụ thể tế bào, enzymes, kháng thể, tế bào, ADN, ARN. được cố định trên bề mặt của cảm biến sinh học có tác dụng tương tác đặc hiệu với chất cần phân tích; 2. Bộ phận chuyển đổi tín hiệu (transducer/detector element): làm việc dựa trên một số nguyên lý như quang, điện hóa, lý hóa, điện áp.giúp chuyển các biến đổi sinh học giữa đầu thu sinh học và các chất cần phân tích thành các tín hiệu có thể đo đạc được; 3.

Bộ phận xử lý, đọc tín hiệu ra (electronic system/biosensor reader device): bộ phận này có tác dụng chuyển thành các tín hiệu điện để máy tính và các thiết bị khác có thể xử lý, được đánh giá mà bộ phận có giá thành cao nhất cấu tạo nên một cảm biến sinh học. Ngoài ra, còn cần có một vài bộ phận phụ khác để cấu thành nên một thiết bị cảm biến sinh học đầy đủ như tác nhân cố định (recognition), giúp gắn các đầu thu có bản chất sinh học lên giá đỡ hoặc bề mặt đế - bản chất vô cơ. Cảm biến sinh học được phân loại dựa vào bản chất các đầu thu sinh học, gồm các loại chính như cảm biến sinh học có đầu thu làm từ enzyme, các kháng LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 4 nguyên/kháng thể, protein, axit nucleic, đầu thu kết hợp và đầu thu làm từ tế bào. Ngoài ra, cảm biến sinh học còn được phân loại dựa vào nguyên lý hoạt động của bộ chuyển đổi tín hiệu.

Khi đó cảm biến sinh học có thể được chia ra thành các loại chính sau: cảm biến sinh học điện hóa (electrochemical biosensor), cảm biến sinh học quang (optical/visual biosensor), cảm biến sinh học nhiệt (calorrimetric/thermal biosensor), cảm biến sinh học áp điện (piezo-electric biosensor). Bên cạnh đó, theo xu hướng hiện nay hướng tới việc ứng dụng công nghệ cao vào cảm biến sinh học nhằm cải thiện cảm biến sinh học theo hướng tiện dụng cũng như có độ nhạy và độ chính xác cao hơn đã cho ra đời các loại cảm biến mới như cảm biến sinh học silica, thạch anh, thủy tinh (silica, quartz/crystal, glass biosensor) và cảm biến sinh học dựa trên vật liệu nano (nanomaterials-based biosensor) [35]. Các ưu điểm của cảm biến sinh học là tính đặc hiệu (do đầu thu sinh học liên kết đặc hiệu với chất cần phân tích), thời gian phân tích ngắn, cho kết quả nhanh, dễ sử dụng, độ chính xác và độ nhạy cao… Bên cạnh đó, cảm biến sinh học có một số điểm yếu như đầu thu sinh học là enzyme, tế bào, kháng thể, mô. nên có thể bị biến tính dưới điều kiện khắc nghiệt của môi trường ngoài (pH, nhiệt độ, ion.); cảm biến không thể được tiệt trùng bằng nhiệt do các vật liệu sinh học có thể bị biến tính; các tế bào được sử dụng trong cảm biến sinh học có thể bị giảm chức năng khi tiếp xúc với các phân tử khác.

Cảm biến sinh học đã được đưa vào ứng dụng trong nhiều lĩnh vực đời sống như y học, nha khoa, chẩn đoán bệnh, kiểm định chất lượng (đất, thức ăn, nước), nông nghiệp, thú y hay trong kiểm soát nước thải công nghiệp, khai khoáng và cả quân sự. Để định lượng, cảm biến sinh học phải đáp ứng yêu cầu liên quan đến đo lường như khả năng lặp lại, khả năng tái sử dụng cao, tính chọn lọc, tính nhạy cảm, vùng trả lời tuyến tính và thời gian đáp ứng tín hiệu tốt.2 dưới đây là biểu đồ biểu thị nhu cầu sử dụng cảm biến sinh học từ năm 1996 tới nay và dự đoán tới năm 2018 được tính trên đơn vị triệu đô la. Trong đó, hơn 80% nhu cầu sử dụng cảm biến để đo nồng độ glucose [34]. Có thể thấy rằng nhu cầu sử dụng cảm biến sinh học ngày càng gia tăng trong những năm gần đây và nó sẽ còn gia tăng mạnh hơn trong những năm tiếp theo, với hi vọng cảm biến sinh học đóng một vai trò quan trọng giúp ích cuộc sống hơn trong tương lai gần.

LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 5 Triệu đô la Năm Hình 1. Biểu đồ nhu cầu sử dụng cảm biến sinh học từ năm 1996 tới 2018 [34] 1. Cảm biến ADN Cảm biến ADN là cảm biến sinh học sử dụng đầu thu sinh học là các đoạn ADN. Phân tử ADN là một chuỗi xoắn kép gồm hai sợi đơn ADN có trình tự bổ sung với nhau, mỗi sợi đơn ADN là một chuỗi nucleotide (hình 1.

Mỗi nucleotide gồm ba thành phần nhóm photphat, đường deoxyribose và một trong bốn bazơ (A, C, G và T). Hai sợi đơn kết hợp với nhau nhờ các liên kết hydro hình thành giữa các bazơ bổ sung nằm trên hai sợi, A bổ sung cho T và C bổ sung cho G. Mỗi sợi đơn có một trình tự định hướng với một đầu 5’ photphat tự do, đầu kia là 3’ hydroxyl tự do (quy ước là 5’- 3’) (hình 1. Hướng của hai sợi đơn trong chuỗi xoắn kép ngược nhau, nên được gọi là hai sợi đối song song.

LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 6 Đầu 5’ Liên kết hydro Đầu 3’ Đầu 3’ a) b) Đầu 5’ Hình 1. Cấu trúc một đoạn phân tử ADN. Liên kết hydro giữa các bazơ của 2 mạch ADN sợi đơn trong một xoắn kép AND (internet). Trong cảm biến sinh học ADN, một đoạn ADN ngắn đặc hiệu cho một gen của một loài sinh vật nào đó được cố định trực tiếp lên bề mặt đế của cảm biến, được gọi là đầu dò (probe).

Đoạn đầu dò này sẽ được dùng để bắt cặp/lai với đoạn ADN bổ sung (có trình tự các nucleotide bổ sung với đầu dò). Đoạn ADN bổ sung này còn được gọi là ADN đích. ADN đích là các trình tự ADN đặc hiệu ở một gen đặc trưng cho một loài sinh vật nào đó đang mong muốn được phát hiện. ADN đầu dò có khả năng bắt cặp với các ADN có trình tự không bổ sung hoàn toàn với nó, tuy nhiên sợi đôi tạo thành đó có độ bền nhiệt kém hơn so với sợi đôi có trình tự bổ sung hoàn toàn.

Quá trình nhận biết ADN đích dựa trên sự bắt cặp/lai đặc hiệu giữa ADN đầu dò được gắn trên bề mặt của cảm biến và ADN đích (ADN cần phát hiện) được minh họa trên hình 1. Trong quá trình này, ADN đích và ADN đầu dò đều ở dạng sợi đơn. ADN đầu dò Bắt cặp/lai Tín hiệu ADN đích Hình 1. Sự bắt cặp của ADN đích và ADN đầu dò trên cảm biến ADN (internet) LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 7 Người ta phân chia đầu dò làm hai loại phụ thuộc vào chiều dài của chúng là đầu dò gen (gene probe) (dài hơn 500 nucleotide chứa toàn bộ hay phần lớn trình tự gen đích, thường được tạo ra bằng phương pháp PCR từ các gen đích) và đầu dò oligonucleotide (oligonucleotide probe) (được tổng hợp nhân tạo bằng thiết bị tổng hợp với chiều dài nhỏ hơn 100 nucleotide).

Trong cảm biến ADN, người ta thường dùng các đầu dò oligonucleotide với chiều dài từ 18 đến 50 nucleotide để nhận biết gen đích. Quá trình lựa chọn đầu dò oligonucleotide cho cảm biến ADN có thể thực hiện sử dụng những trình tự gen đã biết, với các điều kiện chú ý sau. Chiều dài đầu dò thường dao động trong khoảng 18 – 50 nucleotide, kích thước dài hơn sẽ khiến thời gian lai lâu hơn và hiệu suất tổng hợp thấp, kích thước ngắn hơn sẽ làm giảm độ đặc hiệu của đầu dò. Thành phần G – C nên từ 40 – 60%, nguy cơ lai không đặc hiệu tăng khi tỉ lệ G – C nằm ngoài khoảng trên.

Tránh sự có mặt của các vùng bổ sung bên trong mẫu dò vì chúng có thể tạo cấu trúc “kẹp tóc” (hair-pin) và ngăn cản quá trình lai (hình 1. Tránh các trình tự chứa các đoạn nucleotide đơn liên tiếp (ví dụ như AAAA). Một khi trình tự đạt những yêu cầu trên, vẫn cần thiết phân tích trình tự trên máy tính. Nên so sánh trình tự đầu dò với các vùng trình tự nguồn hay hệ gen nguồn cũng như so sánh với các trình tự bổ sung của các trình tự nguồn đó.

Nếu độ tương đồng với các vùng (không phải đích) > 70% hoặc >=8 nucleotide trong một hàng được quan sát, mẫu dò đó không đủ điều kiện sử dụng. Tuy nhiên, để xác định điều kiện lai tối ưu, nên tiến hành lai đầu dò với các ADN đích và ADN đối chứng trong các điều kiện lai được tối ưu. Cấu trúc kẹp tóc (hair pin) (internet) Cảm biến sử dụng đầu dò ADN có thể kết hợp với các bộ chuyển đổi khác nhau: bộ chuyển đổi quang, bộ chuyển đổi điện hóa, bộ chuyện đổi từ. Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi quang Cảm biến dựa trên bộ chuyển đổi quang là loại phổ biến nhất cho cảm biến nói chung và cảm biến ADN nói riêng, với các ưu điểm như độ chính xác cao, độ nhạy cao LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 8 … Trong suốt một thập kỷ vừa qua việc nghiên cứu cũng như công nghệ cho cảm biến dựa trên bộ chuyển đổi quang đã phát triển một cách vượt trội [8].

Cảm biến hoạt động dựa trên các tính chất vật lý của ánh sáng để định lượng chất cần phân tích. Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi quang có thể chia ra làm hai loại: đánh dấu và không đánh dấu. Với phương pháp đánh dấu, người ta sử dụng những vật liệu có khả năng phát quang hoặc hấp thụ ánh sáng để đánh dấu ADN đích. Chất đánh dấu thường được sử dụng là chất phát huỳnh quang như Cy3, Cy5, ethidium bromide, picogreen hoặc các vật liệu nano như chấm lượng tử/QD, hạt nano vàng.

Ví dụ như người ta có thể dùng cặp đầu dò bắt (capture probe) và đầu dò phát hiện (reporter probe) mang chất nhuộm Cy5 có trình tự bổ sung với đầu 5’ và đầu 3’ của ADN đích tạo tổ hợp [30] (hình 1.