Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Khóa luận tốt nghiệp cử nhân ngành Hóa dược của tác giả Đỗ Minh Ngọc (Khoa Hóa, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng) thực hiện dưới sự hướng dẫn của GS. TS. Đào Hùng Cường, tập trung vào việc nghiên cứu thành phần hóa thực vật của loài củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.).

1. Lý do chọn đề tài và bối cảnh thực tiễn

Cỏ gấu (còn gọi là cỏ cú, vị thuốc Hương phụ) là dược liệu quen thuộc trong y học cổ truyền Việt Nam và phương Đông, thường được dùng chữa các bệnh phụ nữ (kinh nguyệt không đều, đau bụng kinh, viêm tử cung mạn tính), giảm đau dạ dày, hỗ trợ tiêu hóa, cảm mạo. Trong thực tế khai thác thương mại và chế biến dược liệu, nguồn "Hương phụ" tại Việt Nam chủ yếu được thu hái từ loài củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) phân bố tại các vùng đất cát ven biển (từ Móng Cái đến Hà Tiên, các đảo ven bờ), với sản lượng hàng năm ước tính 50–100 tấn. Củ gấu biển có kích thước củ lớn hơn, đất cát xốp dễ đào và trữ lượng tự nhiên dồi dào hơn so với cỏ gấu vườn (Cyperus rotundus L.).

Mặc dù có tiềm năng dược liệu to lớn, phần lớn các công trình nghiên cứu trên thế giới và trong nước trước đây chỉ tập trung vào loài củ gấu nước ngọt (Cyperus rotundus L.). Tại Việt Nam, các công trình về củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) hầu như chỉ dừng lại ở việc khảo sát hàm lượng và thành phần tinh dầu thô, chưa có nhiều nghiên cứu chuyên sâu về việc chiết phân đoạn, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất tinh khiết. Do đó, việc nghiên cứu định danh hóa học trong dịch chiết phân đoạn $n$-hexan và phân lập chất tinh khiết là yêu cầu thực tiễn nhằm làm sáng tỏ giá trị khoa học của loài thảo dược này.

2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát của đề tài là định danh thành phần hóa học và phân lập, xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết từ phân đoạn kém phân cực ($n$-hexan) của củ gấu biển. Các nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể bao gồm:

  1. Xác định các chỉ số hóa lý cơ bản của bột nguyên liệu củ gấu biển: độ ẩm bằng phương pháp sấy trọng lượng, hàm lượng tro toàn phần bằng phương pháp nung tro hóa, và hàm lượng kim loại nặng (Cu, Pb, As, Cd) bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử (AAS).
  2. Chiết trích mẫu thực vật bằng phương pháp chưng ninh hồi lưu với methanol, sau đó chiết phân bố lỏng – lỏng để thu nhận phân đoạn cao chiết $n$-hexan.
  3. Định danh thành phần hóa học của dịch chiết $n$-hexan bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS).
  4. Phân lập hợp chất tinh khiết từ phân đoạn $n$-hexan bằng sắc ký cột cổ điển (CC) kết hợp sắc ký lớp mỏng (TLC) và kỹ thuật kết tinh phân đoạn.
  5. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất phân lập được bằng việc phân tích phối hợp các dữ liệu phổ nghiệm hiện đại: phổ tử ngoại (UV-Vis), phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$).

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Mẫu thân rễ (củ) của cây cỏ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) được thu hái ngẫu nhiên tại các bãi biển thuộc khu vực quận Hải Châu, Thanh Khê, Phạm Văn Đồng và Xuân Thiều trên địa bàn thành phố Đà Nẵng vào tháng 6 năm 2019.
  • Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát các chỉ số hóa lý của mẫu củ khô; tập trung chiết xuất, định danh và phân lập các hợp chất hữu cơ có trong phân đoạn dịch chiết $n$-hexan; xác định cấu trúc của hợp chất tinh khiết CS1 phân lập được.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

1. Khung lý thuyết và phân loại thực vật

Đề tài dựa trên cơ sở lý thuyết về hóa thực vật và phân loại thực vật học:

  • Vị trí phân loại: Cây củ gấu biển thuộc Giới Plantae, Bộ Poales, Họ Cyperaceae (họ Cói), Chi Cyperus, Loài Cyperus stoloniferus Retz. (tên đồng nghĩa: Cyperus arenarius Hance ex C.B.Clarke, Cyperus bulbosostoloniferus Steud., Cyperus spadiceus Lam., Cyperus mayeri Kük.).
  • Đặc điểm hóa học họ Cói: Chi Cyperus chứa nhiều lớp chất chuyển hóa thứ cấp đa dạng bao gồm monoterpenoid, sesquiterpenoid (như $\alpha$-cyperone, cyperene, caryophyllene oxide, patchoulenone), flavonoid, polyphenol, stilbenoid, coumarin, triterpenoid và các sterol thực vật (phytosterol).
  • Cơ sở dược lý: Các nghiên cứu y học cổ truyền và dược lý học hiện đại chỉ ra các dịch chiết và tinh dầu chi Cyperus có hoạt tính sinh học phong phú: ức chế co bóp cơ trơn tử cung, giảm đau, kháng khuẩn, chống oxy hóa, an thần, bảo vệ gan và chống viêm.

2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu sử dụng hệ thống các phương pháp hóa học, hóa lý và phổ nghiệm:

  • Phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lý:
    • Độ ẩm: Phương pháp sấy khô mẫu bột ở nhiệt độ $95^\circ\text{C} - 110^\circ\text{C}$ đến khối lượng không đổi.
    • Hàm lượng tro toàn phần: Phương pháp tro hóa khô trong lò nung ở nhiệt độ $500^\circ\text{C} - 550^\circ\text{C}$ trong thời gian 4–6 giờ.
    • Hàm lượng kim loại nặng: Mẫu tro được hòa tan trong dung dịch $\text{HNO}_3$ loãng, định mức và phân tích hàm lượng $\text{Pb}$, $\text{Cu}$, $\text{As}$, $\text{Cd}$ trên máy phổ hấp thụ nguyên tử AAS100 (Perkin Elmer).
  • Phương pháp chiết xuất:
    • Chiết rắn – lỏng: Chưng ninh đun hồi lưu bột củ gấu biển khô với dung môi methanol ($\text{MeOH}$).
    • Chiết lỏng – lỏng: Phân bố cao tổng methanol hòa nước lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần, thu phân đoạn dịch chiết $n$-hexan (CSH).
  • Phương pháp định danh bằng GC-MS: Sử dụng hệ thiết bị Agilent 7890A/5975C với cột mao quản HP-5MS ($30\text{ m} \times 250\text{ }\mu\text{m} \times 0{,}25\text{ }\mu\text{m}$), khí mang Helium (tốc độ $20\text{ mL/phút}$), nhiệt độ injector $300^\circ\text{C}$, detector $280^\circ\text{C}$, chương trình nhiệt độ từ $70^\circ\text{C}$ đến $290^\circ\text{C}$, điện thế ion hóa $70\text{ eV}$.
  • Phương pháp phân lập và tinh chế:
    • Sắc ký cột pha thường (CC) sử dụng chất hấp phụ Silicagel (kích thước hạt 240–430 mesh, Merck), rửa giải gradient hệ dung môi $n$-hexan – aceton.
    • Sắc ký lớp mỏng (TLC) kiểm tra các phân đoạn trên bản mỏng tráng sẵn Silicagel Merck $60\text{F}_{254}$, hiện màu bằng thuốc thử dung dịch $\text{H}_2\text{SO}_4\text{ }10%$ kết hợp gia nhiệt.
    • Tinh chế hợp chất bằng kỹ thuật rửa và kết tinh lại trong aceton.
  • Phương pháp xác định cấu trúc hóa học:
    • Phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis) đo trên máy UV-1800 (Shimadzu) trong dung môi $\text{MeOH}$.
    • Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) đo trên máy IR Prestige 21 (Shimadzu) với số sóng từ $4000\text{ cm}^{-1}$ đến $400\text{ cm}^{-1}$.
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$) ghi trên máy Bruker Avance $500\text{ MHz}$ tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sử dụng dung môi DMSO-$d_6$.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa toàn diện các tài liệu khoa học liên quan đến đối tượng nghiên cứu:

  • Thực vật học và dược học: Mô tả đặc điểm hình thái học của họ Cyperaceae, chi Cyperus và loài Cyperus stoloniferus Retz.; phân tích vùng phân bố địa lý ven biển và các phương pháp chế biến vị thuốc Hương phụ trong y học cổ truyền (phương pháp tứ chế tẩm muối, gừng, giấm, rượu và phương pháp thất chế).
  • Thành phần hóa thực vật và tác dụng dược lý: Tổng thuật các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Cyperus (hơn 77 hợp chất được phân lập từ Cyperus rotundus gồm monoterpenoid, sesquiterpenoid, flavonoid, polyphenol, stilbenoid, benzodihydrofuran). Tổng quan các tác dụng sinh học đã được chứng minh thực nghiệm như chống co thắt cơ trơn tử cung, kháng khuẩn, chống oxy hóa, bảo vệ gan, giảm đau, hạ huyết áp, an thần và hạ sốt.
  • Tổng quan tình hình nghiên cứu: Đánh giá các công trình nghiên cứu về Cyperus stoloniferus Retz. tại Việt Nam (nghiên cứu của Dược sĩ Vũ Văn Điền năm 1994, nghiên cứu của Trần Huy Thái và Trần Thị Ngọc Diệp năm 2011 xác định 28 cấu tử tinh dầu bằng GC-MS) và các nghiên cứu quốc tế, chỉ rõ khoảng trống nghiên cứu về việc phân lập chất tinh khiết từ phân đoạn dịch chiết hữu cơ của củ gấu biển.

Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết quy trình chuẩn bị mẫu và quy trình kỹ thuật thực nghiệm:

  • Xử lý nguyên liệu và hóa chất: 0,5 kg củ gấu biển khô được làm sạch, thái lát, phơi khô (đạt độ khô khoảng 80%), giã nhỏ thành bột mịn. Hóa chất sử dụng gồm methanol ($99{,}5%$), $n$-hexan ($86{,}0%$, được cất lại qua cột Vigreux), aceton ($98{,}5%$), chloroform, $\text{H}_2\text{SO}4\text{ }10%$, bản mỏng Silicagel $60\text{F}{254}$.
  • Quy trình xác định chỉ tiêu hóa lý: Mô tả công thức tính và cách thức thực hiện sấy mẫu xác định độ ẩm, nung mẫu xác định tro toàn phần và quy trình phân tích kim loại nặng trên máy AAS.
  • Quy trình chiết xuất và phân lập: Thiết lập sơ đồ thực nghiệm chiết hồi lưu bột củ gấu với methanol (3 lần $\times$ 3 lít), cô quay chân không thu 20 g cao tổng. Phân bố lỏng – lỏng cao tổng với nước và $n$-hexan (3 lần $\times$ 2,5 lít) thu được 3 g cao $n$-hexan (CSH). Mô tả kỹ thuật nạp mẫu, vận hành sắc ký cột Silicagel với hệ dung môi $n$-hexan – aceton tỷ lệ $100:0 \rightarrow 0:100$ và $20:1$ ($\text{v/v}$), theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng TLC.
  • Phương pháp đo phổ: Thiết lập các thông số vận hành máy GC-MS, UV-Vis, FT-IR và máy đo phổ NMR $500\text{ MHz}$.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm và biện giải cấu trúc hóa học:

  • Đánh giá các chỉ số hóa lý: Trình bày kết quả xác định độ ẩm trung bình, hàm lượng tro toàn phần và hàm lượng các kim loại nặng trong nguyên liệu bột củ gấu biển khô.
  • Định danh thành phần dịch chiết $n$-hexan bằng GC-MS: Nhận diện 22 cấu tử hóa học trong phân đoạn $n$-hexan, trong đó các hợp chất sesquiterpenoid chiếm tỷ lệ ưu thế (tiêu biểu như cyperenone, caryophyllene oxide, cyperene) cùng các phytosterol (campesterol, stigmasterol, $\gamma$-sitosterol).
  • Phân lập hợp chất CS1: Từ 3 g cao $n$-hexan (CSH), qua sắc ký cột phân tách thành 5 phân đoạn lớn (CSH1–CSH5). Phân đoạn CSH3 (45 mg) tiếp tục được sắc ký cột với hệ dung môi $n$-hexan – aceton ($20:1$) thu 4 phân đoạn phụ (CSH1A–CSH1D). Tinh chế phân đoạn CSH1C (15 mg) bằng aceton thu được 10 mg hợp chất CS1 ở dạng bột màu vàng. Kiểm tra sắc ký lớp mỏng TLC hệ dung môi Methanol – Chloroform – Nước ($1:5:0{,}1$) cho một vết đơn duy nhất có hệ số lưu $R_f = 0{,}5$.
  • Xác định cấu trúc hợp chất CS1: Biện luận cấu trúc dựa trên phổ tử ngoại UV-Vis ($\lambda_{\max} = 256\text{ nm}$ và $372\text{ nm}$), phổ hồng ngoại FT-IR (các pic đặc trưng cho nhóm $-\text{OH}$ phenol, liên kết $\text{C}=\text{C}$ thơm, nhóm $\text{C}=\text{O}$ liên hợp và liên kết $\text{C}-\text{O}$ aryl ether) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$ cho thấy các tín hiệu đặc trưng của khung polyphenol/flavonoid.

Kết quả và đóng góp

1. Kết quả thực nghiệm cụ thể

a. Chỉ số hóa lý và hàm lượng kim loại nặng

Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu hóa lý của mẫu bột củ gấu biển khô được tổng hợp trong các bảng sau:

Chỉ tiêu hóa lý Kết quả thực nghiệm Tiêu chuẩn so sánh / Quy định Đánh giá
Độ ẩm trung bình ($W_{tb}$) $12{,}50%$ TCVN I – 4:2017 ($\le 13%$) Đạt chuẩn bảo quản, hạn chế nấm mốc
Hàm lượng tro toàn phần $2{,}385%$ — Tỷ lệ chất vô cơ thấp, an toàn sử dụng
Kim loại nặng kiểm tra Hàm lượng phân tích ($\text{mg/L}$) Ngưỡng cho phép tối đa (Thông tư 02/2011/TT-BYT) Đánh giá an toàn
Chì ($\text{Pb}$) $0{,}15$ $2{,}0\text{ mg/kg}$ Nằm trong ngưỡng an toàn
Đồng ($\text{Cu}$) $0{,}05$ $30{,}0\text{ mg/kg}$ Nằm trong ngưỡng an toàn
Asen ($\text{As}$) $0{,}01$ $1{,}0\text{ mg/kg}$ Nằm trong ngưỡng an toàn
Cadmi ($\text{Cd}$) $0{,}00$ $0{,}1\text{ mg/kg}$ Nằm trong ngưỡng an toàn

b. Thành phần hóa học trong dịch chiết $n$-hexan (GC-MS)

Phân tích GC-MS dịch chiết $n$-hexan của củ gấu biển đã định danh được 22 cấu tử. Thành phần chủ yếu gồm các sesquiterpene, sesquiterpenoid và phytosterol. Một số cấu tử tiêu biểu gồm:

STT Tên hoạt chất Thời gian lưu ($R_T$, phút) Tỷ lệ diện tích (% Area) Công thức phân tử Nhóm hợp chất
1 Cyprotene $16{,}34$ — $\text{C}{15}\text{H}{24}$ Sesquiterpene
2 Cyperene $18{,}86$ $3{,}84%$ $\text{C}{15}\text{H}{24}$ Sesquiterpene
3 Cyperene epoxide $20{,}28$ — $\text{C}{15}\text{H}{24}\text{O}$ Sesquiterpenoid
4 Isoaromadendrene epoxide $21{,}12$ — $\text{C}{30}\text{H}{50}$ Terpenoid
5 Cyperenone — $11{,}35%$ $\text{C}{15}\text{H}{22}\text{O}$ Sesquiterpenoid
6 Caryophyllene oxide — $5{,}28%$ $\text{C}{15}\text{H}{24}\text{O}$ Sesquiterpenoid
7 Campesterol $37{,}37$ Thấp $\text{C}{29}\text{H}{50}\text{O}$ Phytosterol
8 Stigmasterol / $\gamma$-Sitosterol — Thấp — Phytosterol

c. Dữ liệu phổ nghiệm của hợp chất tinh khiết CS1

Hợp chất CS1 ($10\text{ mg}$, bột màu vàng, $R_f = 0{,}5$ trong hệ $\text{MeOH} : \text{CHCl}_3 : \text{H}_2\text{O} = 1:5:0{,}1$) cho các đặc trưng phổ nghiệm:

  • Phổ tử ngoại UV-Vis: Đỉnh hấp thụ cực đại tại $\lambda_{\max} = 256\text{ nm}$ và $372\text{ nm}$ (đặc trưng cho khung liên hợp flavonoid).
  • Phổ hồng ngoại FT-IR:
Số sóng ($\text{cm}^{-1}$) Loại dao động liên kết đặc trưng
$3446{,}79$ Dao động hóa trị của liên kết $\text{O}-\text{H}$ phenolic
$1639{,}49$ và $1463{,}97$ Dao động hóa trị của liên kết $\text{C}=\text{C}$ vòng thơm
$1517{,}96$ Dao động hóa trị của liên kết $\text{C}=\text{O}$ gắn vòng thơm
$1388{,}75$ Dao động biến dạng của liên kết $\text{O}-\text{H}$ phenol
$1267{,}23$ Dao động hóa trị của liên kết $\text{C}-\text{O}$ aryl ether
$1203{,}58$ Dao động hóa trị của liên kết $\text{C}-\text{O}$ phenol
$1165{,}00$ Dao động hóa trị và biến dạng liên kết $\text{C}-\text{CO}-\text{C}$ trong ketone
$989{,}80$ Dao động biến dạng của liên kết $\text{C}-\text{H}$ hydrocarbon thơm
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$, DMSO-$d_6$):
    • Tín hiệu 1 proton singlet tại $\delta_{\text{H}} = 6{,}40\text{ ppm}$ ($1\text{H}, s, \text{H}-8$) thuộc vòng A.
    • Tín hiệu proton thuộc hệ vòng thơm ABX tại $\delta_{\text{H}} = 6{,}66\text{ ppm}$ ($1\text{H}, s, \text{H}-2'$) thuộc vòng B.
    • Tín hiệu proton chelat hóa liên kết hydro nội phân tử rất mạnh đặc trưng của nhóm $5-\text{OH}$ gắn cạnh nhóm carbonyl tại vùng trường thấp $\delta_{\text{H}} > 12\text{ ppm}$.

2. Đóng góp khoa học của đề tài

  • Đóng góp học thuật: Đề tài đã bước đầu xây dựng quy trình chiết phân đoạn và sắc ký cột phân lập thành công hợp chất tinh khiết CS1 từ củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.), bổ sung dữ liệu phổ nghiệm (GC-MS, UV, FT-IR, NMR) cho đối tượng nghiên cứu này tại Việt Nam – vốn trước đây chỉ tập trung phân tích tinh dầu thô.
  • Đóng góp thực tiễn: Khẳng định nguồn dược liệu củ gấu biển ven biển Đà Nẵng đáp ứng tốt các tiêu chuẩn kiểm nghiệm hóa lý (độ ẩm, độ an toàn kim loại nặng theo quy định Bộ Y tế), làm căn cứ khoa học cho việc khai thác, định danh và ứng dụng nguồn thảo dược ven biển.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

1. Hạn chế của nghiên cứu

  • Nghiên cứu chỉ mới tập trung khảo sát và phân lập trên phân đoạn dịch chiết kém phân cực ($n$-hexan), chưa tiến hành phân lập sâu trên các phân đoạn có độ phân cực trung bình và cao hơn ($\text{CH}_2\text{Cl}_2$, $\text{EtOAc}$, nước).
  • Lượng hợp chất tinh khiết CS1 thu được còn tương đối khiêm tốn ($10\text{ mg}$ từ $0{,}5\text{ kg}$ bột nguyên liệu khô).
  • Việc giải đoán cấu trúc CS1 mới dừng lại ở các dữ liệu phổ 1D ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$), UV và IR; chưa triển khai các phổ cộng hưởng từ 2 chiều (2D-NMR như HSQC, HMBC, COSY, NOESY) và phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS) để khẳng định tuyệt đối công thức phân tử và cấu hình không gian.
  • Đề tài chưa thực hiện các thử nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học trực tiếp (in vitro hoặc in vivo) đối với hợp chất tinh khiết CS1 sau khi phân lập.

2. Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Tiếp tục mở rộng nghiên cứu phân lập các hợp chất tự nhiên trên các phân đoạn cao chiết còn lại của củ gấu biển gồm phân đoạn dichloromethane (CSD), ethyl acetate (CSE) và phân đoạn nước (CSW).
  • Tiến hành đo bổ sung phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS) và phổ 2D-NMR (HMBC, HSQC) để xác định chính xác và khẳng định hoàn toàn cấu trúc hóa học của hợp chất CS1 cũng như các hợp chất mới phân lập khác.
  • Triển khai các thử nghiệm sàng lọc hoạt tính sinh học (kháng sinh, kháng nấm, kháng viêm, chống oxy hóa, gây độc tế bào ung thư) của các chất tinh khiết phân lập được từ củ gấu biển.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho:

  • Sinh viên và học viên ngành Hóa học, Hóa dược, Dược học, Hóa hợp chất thiên nhiên: Cung cấp tài liệu thực tế về phương pháp chiết xuất phân đoạn dược liệu, kỹ thuật vận hành sắc ký cột hấp phụ silicagel, sắc ký lớp mỏng và quy trình giải đoán dữ liệu phổ hữu cơ (UV-Vis, FT-IR, NMR, GC-MS).
  • Các nhà nghiên cứu về dược liệu và thực vật chi Cyperus: Cung cấp hệ thống dữ liệu kiểm nghiệm chỉ số hóa lý (độ ẩm, tro, kim loại nặng AAS), phổ GC-MS phân đoạn $n$-hexan và các thông số phổ nghiệm của hợp chất tách chiết từ loài cỏ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) tại miền Trung Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Nguồn nguyên liệu củ gấu biển trong nghiên cứu được thu thập ở đâu và các chỉ số hóa lý có đạt tiêu chuẩn an toàn không?

Mẫu củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) được thu hái vào tháng 6 năm 2019 tại các bãi biển Thanh Khê, Phạm Văn Đồng, Xuân Thiều (thuộc thành phố Đà Nẵng). Kết quả phân tích cho thấy độ ẩm trung bình của mẫu bột khô là $12{,}50%$ (đạt tiêu chuẩn TCVN I – 4:2017 $\le 13%$), hàm lượng tro toàn phần là $2{,}385%$. Hàm lượng kim loại nặng đo bằng phương pháp AAS ghi nhận: Chì ($\text{Pb}$) $0{,}15\text{ mg/L}$, Đồng ($\text{Cu}$) $0{,}05\text{ mg/L}$, Asen ($\text{As}$) $0{,}01\text{ mg/L}$ và Cadmi ($\text{Cd}$) $0{,}00\text{ mg/L}$. Tất cả các chỉ số này đều nằm trong ngưỡng cho phép theo Thông tư 02/2011/TT-BYT, khẳng định nguồn nguyên liệu an toàn để làm dược liệu.

2. Phương pháp GC-MS đã định danh được những nhóm hợp chất chính nào trong dịch chiết $n$-hexan của củ gấu biển?

Phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) trên cột HP-5MS đã định danh được 22 cấu tử trong phân đoạn dịch chiết $n$-hexan. Nhóm hợp chất chiếm tỷ lệ chủ yếu là các sesquiterpene và sesquiterpenoid, tiêu biểu là cyperenone ($11{,}35%$), caryophyllene oxide ($5{,}28%$), cyperene ($3{,}84%$), cyprotene và isoaromadendrene epoxide. Ngoài ra, dịch chiết còn chứa một lượng nhỏ các phytosterol như campesterol, stigmasterol và $\gamma$-sitosterol.

3. Quy trình sắc ký cột phân lập hợp chất tinh khiết CS1 từ cao chiết $n$-hexan được thực hiện như thế nào?

Từ 0,5 kg bột khô chiết bằng methanol thu được 20 g cao tổng; chiết phân bố lỏng – lỏng với $n$-hexan thu được 3 g cao $n$-hexan (CSH). Cao CSH được nạp lên cột sắc ký silicagel, rửa giải gradient hệ $n$-hexan – aceton ($100:0 \rightarrow 0:100$) để thu 5 phân đoạn lớn (CSH1–CSH5). Phân đoạn CSH3 (45 mg) tiếp tục được chạy sắc ký cột silicagel với hệ dung môi $n$-hexan – aceton ($20:1\text{ v/v}$) thu được 4 phân đoạn nhỏ (CSH1A–CSH1D). Phân đoạn CSH1C (15 mg) sau đó được rửa và kết tinh lại bằng dung môi aceton, thu được 10 mg hợp chất tinh khiết CS1 dạng bột màu vàng. Độ tinh khiết của CS1 được khẳng định trên bản mỏng TLC (hệ Methanol – Chloroform – Nước tỷ lệ $1:5:0{,}1$) cho 1 vết đơn với $R_f = 0{,}5$.

4. Dữ liệu phổ UV, IR và NMR cho thấy hợp chất CS1 thuộc khung cấu trúc hóa học nào?

Phổ UV-Vis trong $\text{MeOH}$ cho 2 cực đại hấp thụ tại $256\text{ nm}$ và $372\text{ nm}$, chứng minh sự tồn tại của hệ liên hợp thơm mở rộng. Phổ FT-IR ghi nhận các dải hấp thụ đặc trưng: $3446{,}79\text{ cm}^{-1}$ (nhóm $-\text{OH}$ phenol), $1639{,}49\text{ cm}^{-1}$ và $1463{,}97\text{ cm}^{-1}$ (liên kết $\text{C}=\text{C}$ vòng thơm), $1517{,}96\text{ cm}^{-1}$ ($\text{C}=\text{O}$ thơm), $1267{,}23\text{ cm}^{-1}$ ($\text{C}-\text{O}$ aryl ether) và $1203{,}58\text{ cm}^{-1}$ ($\text{C}-\text{O}$ phenol). Phổ $^1\text{H-NMR}$ trong DMSO-$d_6$ thể hiện tín hiệu của proton vòng A tại $\delta_{\text{H}} = 6{,}40\text{ ppm}$ ($1\text{H}, s$), hệ proton vòng B tại $\delta_{\text{H}} = 6{,}66\text{ ppm}$ và proton tạo liên kết hydro nội phân tử mạnh của nhóm $-\text{OH}$ ở vùng trường rất thấp ($\delta_{\text{H}} > 12\text{ ppm}$). Các dữ liệu phổ nghiệm này chứng minh hợp chất CS1 có khung cấu trúc polyphenol/flavonoid.


Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Đỗ Minh Ngọc đã khảo sát thành công các chỉ tiêu hóa lý, định danh 22 cấu tử hóa học trong phân đoạn dịch chiết $n$-hexan của củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) tại Đà Nẵng bằng phương pháp GC-MS. Nghiên cứu đã xây dựng thành công quy trình sắc ký cột phân lập được 10 mg hợp chất tinh khiết CS1 và bước đầu làm sáng tỏ các đặc trưng cấu trúc polyphenol/flavonoid của hợp chất này thông qua phổ UV, FT-IR và NMR. Kết quả nghiên cứu cung cấp dữ liệu thực nghiệm quan trọng, làm cơ sở khoa học cho các hướng nghiên cứu chuyên sâu tiếp theo về hóa thực vật và hoạt tính sinh học của loài củ gấu biển tại Việt Nam.