Tổng quan luận án
Công trình nghiên cứu "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx K. Schum) và cây Cát sâm (Millettia speciosa Champ) ở Việt Nam" do nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Hường thực hiện dưới sự hướng dẫn của GS. Trần Đình Thắng và PGS. TS. Ngô Xuân Lương tại Trường Đại học Vinh (bảo vệ năm 2022). Luận án thuộc chuyên ngành Hóa hữu cơ, mã số 9440114. Toàn văn luận án gồm 126 trang, 38 bảng số liệu, 17 hình vẽ, 6 sơ đồ, 135 tài liệu tham khảo và phần phụ lục tập hợp 208 phổ cộng hưởng từ hạt nhân và khối phổ của các hợp chất phân lập.
Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu
Việt Nam là quốc gia có tính đa dạng sinh học cao (xếp thứ 16 trong số 25 quốc gia có mức độ đa dạng sinh học cao trên thế giới), sở hữu nguồn tài nguyên dược liệu tự nhiên phong phú dùng trong y học cổ truyền và làm nguyên liệu cho công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm. Cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx K. Schum), thuộc chi Riềng (Alpinia), họ Gừng (Zingiberaceae), là cây thảo mọc tự nhiên ở vùng núi ẩm, được đồng bào dân tộc Thái sử dụng theo kinh nghiệm dân gian làm thuốc điều trị thấp khớp, đau lưng, đau tức ngực và đau dạ dày. Cây Cát sâm (Millettia speciosa Champ), thuộc chi Millettia, họ Đậu (Fabaceae), là dược liệu quý dùng để bồi bổ cơ thể, bảo vệ gan, điều trị thiếu máu, giảm ho, giảm đau nhức xương khớp và chống mệt mỏi.
Mặc dù các nghiên cứu quốc tế đã ghi nhận nhiều nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học từ hai chi này, tại Việt Nam, các nghiên cứu trước đây về cây Bon bo và Cát sâm chủ yếu mới dừng lại ở bước điều tra đa dạng sinh học thực vật và khảo sát thành phần tinh dầu. Chưa có công trình khoa học nào trong nước nghiên cứu một cách hệ thống về phân lập, xác định cấu trúc hóa học chi tiết cũng như đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ hạt và thân rễ cây Bon bo cũng như từ rễ củ cây Cát sâm.
Mục tiêu nghiên cứu
Luận án xác định 3 mục tiêu nghiên cứu cụ thể được đánh số theo văn bản:
- Sử dụng các dung môi thích hợp để chiết chọn lọc, thu được hỗn hợp các hợp chất từ thân rễ, hạt cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx) và từ thân rễ cây Cát sâm (Millettia speciosa Champ).
- Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất trong hạt, thân rễ cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx) và thân rễ cây Cát sâm (Millettia speciosa Champ).
- Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Mẫu hạt và rễ cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx K. Schum) thu hái tại Khu bảo tồn Thiên nhiên Pù Hoạt, huyện Quế Phong, tỉnh Nghệ An vào tháng 9 năm 2018 (mẫu hạt mang ký hiệu tiêu bản AB092018VN, mẫu rễ mang ký hiệu tiêu bản AB-DHV092018). Mẫu rễ cây Cát sâm (Millettia speciosa Champ) thu hái tại Vườn Quốc gia Pù Mát, huyện Con Cuông, tỉnh Nghệ An vào tháng 10 năm 2019 (ký hiệu tiêu bản MS-1019-DHV). Toàn bộ mẫu thực vật do TS. Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) giám định tên khoa học; các tiêu bản thực vật được lưu giữ tại Khoa Hóa học, Trường Đại học Vinh.
- Phạm vi nghiên cứu:
- Khảo sát thành phần hóa học hữu cơ qua quy trình chiết phân đoạn và tinh chế sắc ký từ hạt cây Bon bo, thân rễ cây Bon bo và thân rễ cây Cát sâm.
- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất tinh khiết bằng các phương pháp phổ hiện đại (HR-ESI-MS, ESI-MS, 1D-NMR, 2D-NMR).
- Khảo sát hoạt tính sinh học in vitro gồm: hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sản sinh nitric oxide (NO) trên dòng tế bào đại thực bào RAW264.7 được kích thích bởi lipopolysaccharide (LPS); hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase; hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase (AchE).
- Nghiên cứu mô phỏng tương tác phân tử (molecular docking) giữa các hợp chất phân lập từ Cát sâm với enzyme α-glucosidase (in silico).
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Trong Chương 1, tác giả đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai đối tượng nghiên cứu.
Các hướng nghiên cứu về cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx)
Chi Alpinia có hơn 230 loài trên thế giới, thuộc họ Zingiberaceae. Tác giả điểm lại các nghiên cứu chủ yếu ở Nhật Bản và Trung Quốc đã phân lập được các nhóm chất chính từ loài A. blepharocalyx:
- Nhóm terpenoid: Tinh dầu chứa các monoterpene; các diterpenoid khung labdan và sesquiterpenoid khung eudesmane, bisabolan được phân lập từ các bộ phận của cây.
- Nhóm diarylheptanoid: Tác giả thống kê 40 hợp chất diarylheptanoid (đánh số từ 1 đến 40 trong tài liệu) được phân lập từ quả và hạt cây Bon bo thu hái tại Nhật Bản theo các công bố của Kadota và cộng sự, Prasain và cộng sự, Ali và cộng sự (các tài liệu [6], [47], [84], [97]). Điển hình gồm: blepharocalyxin A–E (1–5), các diarylheptanoid chứa vòng tetrahydropyran (6–9), calyxin B–D, I, J, K, L, M và các epimer tương ứng như epicalyxin B–D, F, K, I, J, M (10–26), neocalyxin A–B (27–28).
- Nhóm flavonoid và hợp chất phenolic khác: Các nghiên cứu tại Trung Quốc của Liu và cộng sự, Zhou và cộng sự ([26], [90]) đã phân lập từ hạt A. blepharocalyx các dẫn xuất chalcone (cardamonin 41, helichrysetin 42, 2',6'-dimethoxy-4,4'-dihydroxychalcone 43, 4,4'-dihydroxychalcone 44), flavanone (5-O-methyl naringenin 45), dẫn xuất α-pyrone (5,6-dehydrokawain 46, 4'-hydroxy-5,6-dehydrokawain 47), các dẫn xuất của cinnamic acid (48–50) và hợp chất phenolic đơn giản (p-hydroxybenzaldehyde 51, phloroglucinol 52).
- Hoạt tính sinh học của Bon bo: Các công bố quốc tế ghi nhận dịch chiết và các diarylheptanoid từ hạt Bon bo có khả năng ức chế sự kết tập tiểu cầu gây bởi collagen và arachidonic acid (AA), chống dị ứng, chống đông máu, kháng u trên các dòng tế bào u xơ HT-1080 (chất calyxin B có $IC_{50} = 0{,}7\ \mu\text{M}$ theo [48]) và ung thư biểu mô 26-L5, ức chế sản sinh NO trên đại thực bào do LPS kích thích (chất blepharocalyxin B có $IC_{50} = 36\ \mu\text{M}$ theo [48], [84], [97], [98]).
Các hướng nghiên cứu về cây Cát sâm (Millettia speciosa)
Chi Millettia (họ Fabaceae) có hơn 200 loài trên thế giới, riêng Việt Nam có 25 loài. Cát sâm phân bố ở Trung Quốc, Việt Nam và một số nước châu Á khác. Luận án điểm lại hơn 50 hợp chất đã được phát hiện từ loài này trên thế giới, phân loại thành các nhóm:
- Alkaloid: N-methylcytisine (53), sanguinarine (54), erythroidine (55) phân lập từ củ và lá theo nghiên cứu [46], [128], [130].
- Flavonoid và polyphenol: 12 hợp chất chính gồm bisdemethoxycurcumin (56), isoliquiritigenin (57), maackiain (58), perocarpine (59), medicarpin (60), homopterocarpin (61), formononetin (62), millettiaspecoside D (63), khaephuoside B (64), seguinoside K (65), albibrissinoside B (66), $\psi$-baptigenin (67) theo [124], [130].
- Coumarin và lignan: Psoralen (68), syringaresinol (69), dihydrodehydrodiconiferyl alcohol (70), syringin (71) theo [130].
- Terpenoid và steroid: 25 hợp chất gồm nardosinone (72), millettiasaponin A–B (73–74), 7-carbonyl-$\beta$-sitosterol (75), 7$\beta$-hydroxylathyrol (76), stigmasterol (77), daucosterol (78), stigmasterol 3-O-$\beta$-D-glucoside (79), phytol (80), lupeolcaffeate (81), aurantiamide acetate (82), phytadiene (83), shionone (84), pedunculoside (85), stilbene (86), schisandrol B (87), 5-hydroxymethylfurfural (88), các ester acid béo (89–92), hydrocarbon (93–94), butein (95), $\beta$-sitosterol acetate (96) theo [25], [50], [107].
- Acid hữu cơ: Maleic acid (97), vanillic acid (98), syringic acid (99), glycyrrhizic acid (100), pyracrenic acid (101), gentisic acid (102), linoleic acid (103), rotundic acid (104), docosanoic acid (105), hexacosanoic acid (106) theo [114], [125], [130].
- Rotenoid: Millettiaosas A (107) và millettiaosas B (108) phân lập từ củ Cát sâm, có hoạt tính độc tế bào đối với MCF-7, HCT-116, A549, HepG-2 với $IC_{50}$ dao động từ 10–26 $\mu\text{M}$ theo [16], [108].
- Polysaccharide: Có tác dụng tăng cường miễn dịch, kháng viêm, chống oxy hóa và ức chế tế bào HeLa, chống phù tai do xylene theo [113], [127], [133].
Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết
Dù các công bố quốc tế đã xác định nhiều thành phần hóa học từ hai loài trên ở nước ngoài, nguồn mẫu sinh trưởng tại hệ sinh thái rừng nhiệt đới của Việt Nam (đặc thù tại Pù Hoạt và Pù Mát, Nghệ An) chưa từng được nghiên cứu chiết tách và phân lập các cấu tử tinh khiết. Luận án lựa chọn giải quyết khoảng trống:
- Khảo sát thành phần hóa học từ mẫu hạt và thân rễ cây Bon bo thu hái tại Pù Hoạt (Nghệ An), phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất thứ cấp, đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất thu được từ rễ Bon bo.
- Khảo sát thành phần hóa học rễ cây Cát sâm thu hái tại Pù Mát (Nghệ An), tìm kiếm các hợp chất mới đối với loài này, đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO, ức chế enzyme α-glucosidase, enzyme acetylcholinesterase và khảo sát cơ chế docking phân tử với enzyme α-glucosidase.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Luận án được triển khai dựa trên cơ sở lý thuyết hóa học các hợp chất thiên nhiên (natural products chemistry), sử dụng quy trình thực nghiệm kết hợp giữa kỹ thuật chiết tách chọn lọc, sắc ký phân đoạn, phân tích cấu trúc bằng phổ học hiện đại, thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro và tính toán mô phỏng in silico.
Phương pháp xử lý mẫu và chiết tách
- Hạt cây Bon bo: 9,0 kg mẫu hạt khô, rửa sạch, sấy bằng bơm nhiệt ở 40–50°C, nghiền nhỏ, ngâm chiết siêu âm 3 lần với methanol (20 lít $\times$ 3 lần). Cất quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 950 g cao chiết tổng methanol. Cao methanol được hòa vào nước và chiết phân bố lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: hexane thu 20 g cao hexane (ASH); ethyl acetate thu 345 g cao ethyl acetate (ASE); butanol thu 189 g cao butanol (ASB); và phần nước còn lại thu 126 g dịch nước (ASW).
- Rễ cây Bon bo: 8,5 kg rễ phơi khô ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ, nghiền nhỏ, chiết siêu âm với methanol (20 lít $\times$ 3 lần) ở nhiệt độ 40–50°C. Cất thu hồi dung môi thu được 820 g cao chiết methanol. Chiết phân bố lỏng - lỏng thu được: 20 g cao hexane (ARH), 245 g cao chloroform (ARC), 161 g cao butanol (ARB) và 126 g dịch nước (ARW).
- Rễ cây Cát sâm: Rễ làm sạch, phơi khô 1 tuần, xay nhỏ, chiết siêu âm với dung môi thích hợp, chiết phân bố với hexane, ethyl acetate và butanol để thu được các phân đoạn cao tương ứng trước khi tiến hành phân lập.
Phương pháp phân lập và tinh chế
- Sắc ký lớp mỏng (TLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel $60\ \text{F}_{254}$, phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 368 nm, hoặc phun thuốc thử hiện màu.
- Sắc ký cột (CC, FC): Sử dụng chất hấp phụ pha thường là silica gel (cỡ hạt 70–230 mesh Kieselgel và 230–240 mesh Merck); sắc ký cột pha đảo RP-18; sắc ký lọc gel rây phân tử Sephadex LH-20.
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Sử dụng cho phân tích kiểm tra độ tinh khiết và điều chế tinh chế mẫu.
Phương pháp xác định cấu trúc phân tử
- Nhiệt độ nóng chảy: Đo trên thiết bị Yanaco MP-S3.
- Phổ hồng ngoại (FT-IR): Đo trên máy quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier.
- Phổ khối lượng: Đo phổ ESI-MS và phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS trên thiết bị micrOTOF-QII 10187 (đo tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh).
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Ghi trên thiết bị Bruker ở tần số 500 MHz đối với phổ $^1\text{H}$-NMR và 125 MHz đối với phổ $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT. Phổ tương tác 2D-NMR gồm HSQC, HMBC, $^1\text{H}$-$^1\text{H}$ COSY, NOESY (đo tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam).
Phương pháp thử hoạt tính sinh học và docking phân tử
- Thử nghiệm ức chế sản sinh NO in vitro: Đánh giá hoạt tính kháng viêm trên dòng tế bào đại thực bào RAW264.7 kích thích bằng lipopolysaccharide (LPS). Định lượng nồng độ nitrite tích tụ trong môi trường nuôi cấy thông qua phản ứng Griess, đo mật độ quang (OD). Độc tính tế bào được đánh giá đồng thời bằng phương pháp thử MTT. Chất đối chứng dương sử dụng là L-NMMA.
- Thử nghiệm ức chế enzyme α-glucosidase in vitro: Sử dụng enzyme α-glucosidase từ nấm men Saccharomyces cerevisiae, cơ chất là p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside (p-NPG). Đo quang mật độ sinh màu của p-nitrophenol giải phóng ở bước sóng 405 nm. Chất đối chứng dương là acarbose.
- Thử nghiệm ức chế enzyme acetylcholinesterase (AchE) in vitro: Đánh giá khả năng ức chế enzyme AchE dựa trên phương pháp đo màu Ellman.
- Mô phỏng docking phân tử (in silico): Tiến hành mô phỏng docking các hợp chất phân lập từ Cát sâm vào vị trí hoạt động của cấu trúc mô hình enzyme α-glucosidase (Saccharomyces cerevisiae và enzyme ruột người) lấy từ Ngân hàng Dữ liệu Protein (PDB). Phân tích cấu trúc lập thể qua đồ thị Ramachandran; đánh giá năng lượng liên kết và các liên kết hydrogen, tương tác kỵ nước giữa ligand và các amino acid trong túi liên kết (như Arg, Asp, Glu, His, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr, Val).
- Xử lý số liệu: Tính toán các giá trị nồng độ ức chế 50% ($IC_{50}$) và độ lệch chuẩn (SD) thông qua phân tích thống kê.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan
Chương 1 (24 trang) tập hợp các dẫn liệu khoa học về đặc điểm thực vật, phân bố, công dụng dân gian, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của hai loài Alpinia blepharocalyx và Millettia speciosa. Tác giả trình bày chi tiết các nhóm hợp chất tự nhiên đã biết trên thế giới: 40 diarylheptanoid, các monoterpene, labdan diterpenoid, sesquiterpenoid, flavonoid và phenolic từ hạt và quả Bon bo; hơn 50 hợp chất thuộc các nhóm alkaloid, flavonoid/polyphenol, coumarin/lignan, triterpene/steroid, acid hữu cơ và rotenoid từ rễ Cát sâm. Chương này chỉ ra rằng tại Việt Nam, các dẫn liệu về thành phần hóa học tinh sạch và hoạt tính sinh học tương ứng của hai loài này chưa từng được công bố, xác lập cơ sở thực tiễn và lý luận cho việc triển khai đề tài.
Chương 2: Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm
Chương 2 (25 trang) mô tả chi tiết địa điểm, thời gian thu mẫu thực vật (Pù Hoạt năm 2018 và Pù Mát năm 2019), các thiết bị máy móc phân tích và hóa chất phân tích được sử dụng. Tác giả trình bày sơ đồ chiết tách và quy trình sắc ký phân lập từng hợp chất:
- Từ 9,0 kg hạt Bon bo: Sắc ký cột silica gel cao ethyl acetate (ASE, 345 g) thu được các phân đoạn ASE1 đến ASE8; tiếp tục phân tách các phân đoạn nhỏ bằng silica gel và cột pha đảo RP-18 rửa giải với methanol : nước (3 : 1, v/v) thu được AS1 (Flavokawain A, 24 mg), AS2 (2',6'-dihydroxy-4'-methoxychalcone, 7 mg), AS3 (Nevadensin, 12 mg), AS4 (Apigenin, 18 mg). Sắc ký cao butanol (ASB, 189 g) trên cột RP-18 và Sephadex LH-20 thu được AS5 (Apigetrin, 28 mg), AS6 (Luteoloside, 11 mg), AS7 (Rutin, 15 mg), AS8 (Polydatin, 75 mg) và AS9 (Luteolin-4'-yl O-$\beta$-D-glucopyranoside, 153 mg).
- Từ 8,5 kg thân rễ Bon bo: Phân lập cao chloroform (ARC, 245 g) trên cột silica gel rửa giải hệ hexane : acetone và chloroform : methanol thu được AR2 (Desmethoxyyangonin, 19 mg), AR3 (Resveratrol, 22 mg), AR4 (Zerumbone, 35 mg), AR5 (Bisdemethoxycurcumin, 40 mg), AR6 (Demethoxycurcumin, 28 mg), AR7 (Quercetin, 11,2 mg). Phân lập cao butanol (ARB, 161 g) trên cột silica gel và RP-18 thu được AR1 (4-hydroxy-2-methoxy-phenyl 1-O-$\beta$-D-[3''-O-(4'-hydroxy-3'-methoxy-benzoyl)]-glucopyranoside, 55 mg).
- Từ thân rễ Cát sâm: Quy trình chiết phân đoạn bằng hexane, ethyl acetate và butanol kết hợp sắc ký cột silica gel, RP-18 và Sephadex LH-20 phân lập được 14 hợp chất: MS1 (Friedelin), MS2 ($\beta$-Sitosterol), MS3 (Ursolic acid), MS4 (Rotundic acid), MS5 (Uvaol), MS6 (Pterocarpin), MS7 (Pedunculoside), MS8 (3-acetyl morolic acid), MS9 (Syringin), MS10 (Daidzin), MS11 (Rutin), MS12 (Gypenoside XVII), MS13 (Betulinic acid), MS14 (Daucosterol). Chương này cũng cung cấp đầy đủ các dữ kiện phổ ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, ESI-MS/HR-ESI-MS) và quy trình chuẩn thử nghiệm hoạt tính sinh học (in vitro NO, α-glucosidase, AchE) cùng quy trình mô phỏng docking phân tử.
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 3 (60 trang) là phần nội dung thực nghiệm chính của luận án, tập trung vào việc giải mã cấu trúc hóa học của 30 hợp chất phân lập được và đánh giá hoạt tính sinh học.
1. Các hợp chất từ hạt cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx)
Tác giả xác định cấu trúc 9 hợp chất ký hiệu từ AS1 đến AS9:
- AS1 (Flavokawain A): Tinh thể màu vàng, điểm nóng chảy xác định trên thiết bị. Cấu trúc thuộc nhóm chalcone.
- AS2 (2',6'-dihydroxy-4'-methoxychalcone): Tinh thể màu vàng, thuộc nhóm chalcone.
- AS3 (Nevadensin): Chất bột màu vàng, cấu trúc flavone chứa nhóm methoxy.
- AS4 (Apigenin): Chất kết tinh màu vàng, cấu trúc tetrahydroxyflavone.
- AS5 (Apigetrin): Hợp chất dạng bột màu vàng, là dẫn xuất apigenin-7-O-glucoside.
- AS6 (Luteoloside): Dạng bột màu vàng, là dẫn xuất luteolin-7-O-glucoside.
- AS7 (Rutin): Flavonoid glycoside (quercetin-3-O-rutinoside).
- AS8 (Polydatin): Tinh thể hình kim không màu, là dạng glycoside của resveratrol (resveratrol-3-O-$\beta$-D-glucopyranoside).
- AS9 (Luteolin-4'-yl O-$\beta$-D-glucopyranoside): Bột màu vàng nhạt, dẫn xuất glycoside ở vị trí C-4' của luteolin.
2. Các hợp chất từ thân rễ cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx)
Xác định cấu trúc 7 hợp chất ký hiệu từ AR1 đến AR7:
- AR1: Dạng bột màu trắng; HR-ESI-MS cho pic ion phân tử $m/z\ 451{,}1245\ [M-H]^-$ (tính toán cho $\text{C}{21}\text{H}{23}\text{O}_{11}^-$ là 451,1240). Cấu trúc xác định là 4-hydroxy-2-methoxy-phenyl 1-O-$\beta$-D-[3''-O-(4'-hydroxy-3'-methoxy-benzoyl)]-glucopyranoside.
- AR2 (Desmethoxyyangonin): Tinh thể màu trắng, thuộc nhóm diarylheptanoid/α-pyrone.
- AR3 (Resveratrol): Tinh thể màu vàng; ESI-MS cho ion $m/z\ 229\ [M+H]^+$. Dữ liệu phổ $^1\text{H}$-NMR ghi nhận hệ proton thơm và nối đôi liên hợp trans: $\delta_{\text{H}}\ 7{,}38$ (2H, d, $J = 9{,}0\ \text{Hz}$, H-2',6'); 6,75 (2H, d, $J = 9{,}0\ \text{Hz}$, H-3',5'); 6,38 (2H, d, $J = 2{,}0\ \text{Hz}$, H-2,6); 6,11 (1H, t, $J = 2{,}0\ \text{Hz}$, H-4); 6,80 (1H, d, $J = 16{,}5\ \text{Hz}$, H-7); 6,92 (1H, d, $J = 16{,}5\ \text{Hz}$, H-8).
- AR4 (Zerumbone): Tinh thể màu vàng, sesquiterpene vòng đặc trưng của họ Gừng, tín hiệu mũi đôi trên phổ $^1\text{H}$-NMR ở 6,01 ppm (1H, d, $J = 12{,}5\ \text{Hz}$).
- AR5 (Bisdemethoxycurcumin): Chất rắn màu vàng; ESI-MS cho pic $m/z\ 307{,}1\ [M-H]^-$. Phổ $^1\text{H}$-NMR ghi nhận: $\delta_{\text{H}}\ 7{,}57$ (2H, d, $J = 16{,}0\ \text{Hz}$, H-4,4'); 7,42 (4H, d, $J = 9{,}0\ \text{Hz}$, H-6,6',10,10'); 6,87 (4H, d, $J = 9{,}0\ \text{Hz}$, H-7,7',9,9'); 6,46 (2H, d, $J = 16{,}0\ \text{Hz}$, H-3,3'); 5,80 (1H, s, H-1).
- AR6 (Demethoxycurcumin): Chất rắn vàng cam; ESI-MS cho ion $m/z\ 361{,}1\ [M+Na]^+$.
- AR7 (Quercetin): Tinh thể hình kim màu vàng, flavonoid aglycone.
3. Các hợp chất từ thân rễ cây Cát sâm (Millettia speciosa)
Xác định cấu trúc 14 hợp chất ký hiệu từ MS1 đến MS14:
- MS1: Friedelin (triterpenoid ketone).
- MS2: $\beta$-Sitosterol (phytosterol).
- MS3: Ursolic acid (triterpene acid pentacyclic) — lần đầu tiên phân lập được từ loài Cát sâm.
- MS4: Rotundic acid (triterpene acid).
- MS5: Uvaol (triterpene alcohol) — lần đầu tiên phân lập được từ loài Cát sâm.
- MS6: Pterocarpin (isoflavonoid nhóm pterocarpan) — lần đầu tiên phân lập được từ loài Cát sâm.
- MS7: Pedunculoside (triterpenoid saponin).
- MS8: 3-acetyl morolic acid (triterpenoid dẫn xuất acetyl).
- MS9: Syringin (sinapyl alcohol 4-yl O-$\beta$-D-glucopyranoside / sinapyl alcohol 4-O-glucoside, thuộc nhóm phenylpropanoid glycoside).
- MS10: Daidzin (daidzein-7-yl O-$\beta$-D-glucopyranoside, isoflavone glycoside).
- MS11: Rutin (flavonol glycoside).
- MS12: Gypenoside XVII (dammarane-type saponin) — lần đầu tiên phân lập được từ loài Cát sâm.
- MS13: Betulinic acid (lupane-type triterpene acid).
- MS14: Daucosterol ($\beta$-sitosterol 3-O-$\beta$-D-glucoside).
| Ký hiệu | Tên hợp chất | Phân loại hóa học | Nguồn phân lập | Ghi chú phát hiện |
|---|---|---|---|---|
| AS1 | Flavokawain A | Chalcone | Hạt Bon bo | |
| AS2 | 2',6'-dihydroxy-4'-methoxychalcone | Chalcone | Hạt Bon bo | |
| AS3 | Nevadensin | Flavone | Hạt Bon bo | |
| AS4 | Apigenin | Flavone | Hạt Bon bo | |
| AS5 | Apigetrin | Flavone glycoside | Hạt Bon bo | |
| AS6 | Luteoloside | Flavone glycoside | Hạt Bon bo | |
| AS7 | Rutin | Flavonol glycoside | Hạt Bon bo | |
| AS8 | Polydatin | Stilbene glycoside | Hạt Bon bo | |
| AS9 | Luteolin-4'-yl O-$\beta$-D-glucopyranoside | Flavone glycoside | Hạt Bon bo | |
| AR1 | 4-hydroxy-2-methoxy-phenyl 1-O-$\beta$-D-[3''-O-(4'-hydroxy-3'-methoxy-benzoyl)]-glucopyranoside | Phenolic glycoside | Thân rễ Bon bo | |
| AR2 | Desmethoxyyangonin | Diarylheptanoid / $\alpha$-Pyrone | Thân rễ Bon bo | |
| AR3 | Resveratrol | Stilbene | Thân rễ Bon bo | |
| AR4 | Zerumbone | Sesquiterpenoid | Thân rễ Bon bo | |
| AR5 | Bisdemethoxycurcumin | Curcuminoid | Thân rễ Bon bo | |
| AR6 | Demethoxycurcumin | Curcuminoid | Thân rễ Bon bo | |
| AR7 | Quercetin | Flavonol | Thân rễ Bon bo | |
| MS1 | Friedelin | Triterpenoid | Rễ Cát sâm | |
| MS2 | $\beta$-Sitosterol | Steroid | Rễ Cát sâm | |
| MS3 | Ursolic acid | Pentacyclic triterpene | Rễ Cát sâm | Lần đầu tiên từ Cát sâm |
| MS4 | Rotundic acid | Triterpenoid acid | Rễ Cát sâm | |
| MS5 | Uvaol | Triterpenoid alcohol | Rễ Cát sâm | Lần đầu tiên từ Cát sâm |
| MS6 | Pterocarpin | Pterocarpan / Isoflavonoid | Rễ Cát sâm | Lần đầu tiên từ Cát sâm |
| MS7 | Pedunculoside | Triterpenoid saponin | Rễ Cát sâm | |
| MS8 | 3-acetyl morolic acid | Triterpenoid | Rễ Cát sâm | |
| MS9 | Syringin | Phenylpropanoid glycoside | Rễ Cát sâm | |
| MS10 | Daidzin | Isoflavone glycoside | Rễ Cát sâm | |
| MS11 | Rutin | Flavonol glycoside | Rễ Cát sâm | |
| MS12 | Gypenoside XVII | Dammarane saponin | Rễ Cát sâm | Lần đầu tiên từ Cát sâm |
| MS13 | Betulinic acid | Lupane triterpene | Rễ Cát sâm | |
| MS14 | Daucosterol | Steroid glycoside | Rễ Cát sâm |
4. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học và docking phân tử
- Hoạt tính kháng viêm của các chất từ rễ Bon bo: Thử nghiệm hoạt tính ức chế sản sinh NO trên tế bào đại thực bào RAW264.7 cho thấy cả 6 hợp chất được thử nghiệm từ AR1 đến AR6 đều thể hiện hoạt tính kháng viêm rõ rệt mà không gây độc tế bào ở các nồng độ khảo sát.
- Hoạt tính sinh học của các chất từ rễ Cát sâm:
- Ức chế sản sinh NO: Đánh giá trên tế bào RAW264.7 (Bảng 3.34 và Hình 3.1, 3.2 trong luận án) cho thấy một số chất ức chế sự sinh sản NO do LPS gây ra ở các mức độ khác nhau.
- Ức chế enzyme α-glucosidase: Kết quả xác định giá trị $IC_{50}$ (Bảng 3.35, Bảng 3.36 trong luận án) thể hiện khả năng ức chế enzyme phân giải đường của các hợp chất triterpenoid và flavonoid từ Cát sâm. Trong đó, chất MS3 (ursolic acid) và MS5 (uvaol) thể hiện hoạt tính ức chế mạnh.
- Ức chế enzyme acetylcholinesterase (AchE): Bảng 3.37 trong văn bản tổng hợp nồng độ ức chế nửa tối đa ($IC_{50}$) đối với AchE của các chất phân lập từ M. speciosa, chứng minh tác động ức chế enzyme liên quan đến dẫn truyền thần kinh.
- Nghiên cứu docking phân tử trên enzyme α-glucosidase:
- Tác giả phân tích đồ thị Ramachandran kiểm định độ tin cậy cấu trúc mô hình enzyme α-glucosidase từ nấm men Saccharomyces cerevisiae và ruột người (Hình 2.2, Hình 3.3, 3.4, 3.5 và Bảng 3.38).
- Kết quả mô phỏng gắn kết vào túi hoạt động của enzyme cho thấy: Hợp chất MS3 (ursolic acid), MS5 (uvaol) và MS11 (rutin) có khả năng docking vào vị trí liên kết tốt hơn chất MS7 (pedunculoside). Trong đó, MS3 là chất hoạt động mạnh nhất, khớp nối vào vị trí xúc tác tương tự như chất kiểm soát acarbose thông qua hệ thống liên kết hydrogen (với các nhóm nhận HBA) và tương tác kỵ nước (vùng HP).
Kết quả và những đóng góp mới
Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận
Luận án đã tự công bố các đóng góp mới cụ thể như sau:
- Phát hiện mới về thành phần hóa học: Lần đầu tiên phân lập và xác định cấu trúc của 4 hợp chất từ loài Cát sâm (Millettia speciosa Champ), bao gồm: Ursolic acid (MS3), Uvaol (MS5), Pterocarpin (MS6) và Gypenoside XVII (MS12).
- Khám phá mới về hoạt tính sinh học của Bon bo: Thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hợp chất AR1–AR6 phân lập từ thân rễ cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx K. Schum) cho thấy tất cả các hợp chất này đều có khả năng kháng viêm thông qua cơ chế ức chế sản sinh NO trên tế bào RAW264.7. Đây là công trình đầu tiên công bố hoạt tính kháng viêm của các hợp chất này trên loài Bon bo.
- Đóng góp mới về mô phỏng phân tử trên Cát sâm: Lần đầu tiên thực hiện nghiên cứu mô phỏng docking phân tử khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase đối với các hợp chất phân lập từ loài Cát sâm (Millettia speciosa). Kết quả tính toán chỉ ra rằng các hợp chất MS3, MS5 và MS11 có ái lực gắn kết và khả năng tương tác tại vị trí hoạt động của enzyme α-glucosidase tốt hơn hợp chất MS7.
Đóng góp mới về mặt thực tiễn và giải pháp đề xuất
- Xây dựng được quy trình chiết tách phân đoạn chọn lọc bằng hệ dung môi (hexane, ethyl acetate, chloroform, butanol) và quy trình sắc ký tinh chế (silica gel, RP-18, Sephadex LH-20) cho phép thu nhận 9 hợp chất từ hạt Bon bo, 7 hợp chất từ thân rễ Bon bo và 14 hợp chất từ rễ củ Cát sâm.
- Cung cấp cơ sở khoa học xác thực cho các kinh nghiệm sử dụng cây Bon bo và Cát sâm trong y học dân gian (chữa đau nhức xương khớp, kháng viêm, bồi bổ sức khỏe).
- Gợi mở tiềm năng ứng dụng các hợp chất phân lập từ Cát sâm (đặc biệt là ursolic acid MS3, uvaol MS5 và rutin MS11) trong nghiên cứu phát triển các sản phẩm hỗ trợ điều trị đái tháo đường thông qua cơ chế ức chế enzyme α-glucosidase, cũng như điều trị thoái hóa thần kinh thông qua ức chế AchE.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Dựa trên nội dung và phạm vi nghiên cứu được nêu trong văn bản luận án:
- Hạn chế:
- Mẫu thực vật thu thập mang tính chất cục bộ theo mùa vụ và địa bàn địa lý xác định (mẫu Bon bo thu hái tại Pù Hoạt vào tháng 9/2018; mẫu Cát sâm thu hái tại Pù Mát vào tháng 10/2019), chưa so sánh biến thiên hàm lượng hoạt chất giữa các vùng sinh thái khác nhau tại Việt Nam.
- Các thử nghiệm hoạt tính sinh học mới dừng lại ở quy mô in vitro (ức chế sản sinh NO trên đại thực bào RAW264.7, ức chế enzyme phân giải carbohydrate α-glucosidase và enzyme AchE) và mô phỏng điện toán in silico (molecular docking), chưa triển khai các mô hình thử nghiệm in vivo trên động vật thực nghiệm.
- Chưa phân lập và khảo sát hoạt tính của các hợp chất thuộc nhóm tinh dầu dễ bay hơi ở hai loài thực vật này.
- Hướng nghiên cứu tiếp:
- Mở rộng khảo sát thành phần hóa học và hàm lượng các hoạt chất chính theo các giai đoạn sinh trưởng và ở các vùng địa lý khác nhau để phục vụ công tác tiêu chuẩn hóa dược liệu.
- Tiến hành các thử nghiệm dược lý chuyên sâu trên mô hình động vật (in vivo) đối với các hợp chất thể hiện hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase và kháng viêm mạnh như MS3, MS5, MS11 và nhóm curcuminoid (AR5, AR6).
- Nghiên cứu bán tổng hợp hoặc tối ưu hóa cấu trúc hóa học của các phân tử khung triterpene và diarylheptanoid để nâng cao hiệu lực ức chế enzyme và độ an toàn sinh học.
Giá trị tham khảo
Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho nhiều nhóm đối tượng học thuật và ứng dụng:
- Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa dược và Hóa học các hợp chất thiên nhiên: Tài liệu tham khảo có giá trị cao về mặt phương pháp luận chiết phân đoạn bằng dung môi có độ phân cực tăng dần, kỹ thuật triển khai sắc ký cột pha thường, pha đảo RP-18 và rây phân tử Sephadex LH-20 để phân lập các lớp chất khó tách (flavonoid glycoside, triterpene acid, stilbene).
- Các nhà nghiên cứu phổ học hữu cơ: Cung cấp tập dữ liệu thực nghiệm chi tiết về nhiệt độ nóng chảy, phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS và dữ kiện phổ NMR một chiều, hai chiều ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT, HSQC, HMBC) của 30 hợp chất tự nhiên, kèm theo 208 phổ chi tiết trong phần phụ lục.
- Giảng viên và các viện nghiên cứu dược liệu: Cung cấp dẫn liệu khoa học xác thực về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài thực vật bản địa tại Nghệ An (Alpinia blepharocalyx và Millettia speciosa), làm cơ sở cho các giáo trình chuyên đề Dược liệu học, Hóa thực vật.
- Các cơ quan quản lý y tế, bảo tồn đa dạng sinh học và các doanh nghiệp sản xuất dược phẩm/thực phẩm chức năng: Dữ liệu hoạt tính kháng viêm và ức chế enzyme α-glucosidase, AchE là căn cứ quan trọng để định hướng quy hoạch vùng trồng, bảo tồn nguồn gen tại Vườn Quốc gia Pù Mát, Khu bảo tồn Pù Hoạt và phát triển sản phẩm chăm sóc sức khỏe có kiểm soát chất lượng từ cây Cát sâm và Bon bo.
Câu hỏi thường gặp
1. Mẫu thực vật cây Bon bo và cây Cát sâm sử dụng trong luận án được thu thập ở đâu và vào thời điểm nào?
Mẫu hạt và mẫu thân rễ cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx K. Schum) được thu hái tại Khu bảo tồn Thiên nhiên Pù Hoạt, huyện Quế Phong, tỉnh Nghệ An vào tháng 9 năm 2018 (mẫu hạt ký hiệu AB092018VN, mẫu rễ ký hiệu AB-DHV092018). Mẫu thân rễ cây Cát sâm (Millettia speciosa Champ) được thu hái tại Vườn Quốc gia Pù Mát, huyện Con Cuông, tỉnh Nghệ An vào tháng 10 năm 2019 (tiêu bản MS-1019-DHV). Tất cả các mẫu đều được định danh bởi TS. Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam) và lưu trữ tại Khoa Hóa học, Trường Đại học Vinh.
2. Những hợp chất nào lần đầu tiên được phân lập từ loài Cát sâm (Millettia speciosa) trong nghiên cứu này?
Có 4 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ loài Cát sâm (Millettia speciosa) gồm:
- MS3: Ursolic acid (thuộc nhóm triterpenoid pentacyclic).
- MS5: Uvaol (thuộc nhóm triterpenoid alcohol).
- MS6: Pterocarpin (thuộc nhóm pterocarpan/isoflavonoid).
- MS12: Gypenoside XVII (thuộc nhóm dammarane saponin).
3. Quy trình chiết tách từ hạt và rễ cây Bon bo thu được những phân đoạn cao chiết nào với khối lượng cụ thể ra sao?
- Từ 9,0 kg hạt Bon bo: Chiết siêu âm bằng methanol thu 950 g cao tổng methanol. Chiết phân bố lỏng - lỏng thu được: 20 g cao hexane (ASH), 345 g cao ethyl acetate (ASE), 189 g cao butanol (ASB) và 126 g dịch nước (ASW).
- Từ 8,5 kg rễ Bon bo: Chiết siêu âm bằng methanol thu 820 g cao tổng methanol. Chiết phân bố lỏng - lỏng thu được: 20 g cao hexane (ARH), 245 g cao chloroform (ARC), 161 g cao butanol (ARB) và 126 g dịch nước (ARW).
4. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất từ rễ cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx) được ghi nhận như thế nào?
Luận án tiến hành thử nghiệm hoạt tính ức chế sản sinh NO trên tế bào đại thực bào RAW264.7 được kích thích bởi LPS đối với 6 hợp chất phân lập từ rễ Bon bo gồm: AR1, AR2 (desmethoxyyangonin), AR3 (resveratrol), AR4 (zerumbone), AR5 (bisdemethoxycurcumin) và AR6 (demethoxycurcumin). Kết quả cho thấy tất cả các hợp chất từ AR1 đến AR6 đều thể hiện hoạt tính kháng viêm rõ rệt thông qua việc làm giảm nồng độ NO sinh ra, đồng thời không gây độc cho tế bào đại thực bào ở các nồng độ thử nghiệm. Đây là lần đầu tiên hoạt tính kháng viêm của các chất này được thử nghiệm trên loài Bon bo.
5. Kết quả mô phỏng docking phân tử trên enzyme α-glucosidase đối với các hợp chất từ Cát sâm cho thấy điều gì?
Nghiên cứu mô phỏng tương tác phân tử (molecular docking) các hợp chất phân lập từ rễ Cát sâm vào túi hoạt động của enzyme α-glucosidase (mô hình Saccharomyces cerevisiae và enzyme ruột người) chỉ ra rằng: các hợp chất MS3 (ursolic acid), MS5 (uvaol) và MS11 (rutin) có khả năng docking tốt hơn hợp chất MS7 (pedunculoside). Trong đó, MS3 thể hiện khả năng gắn kết mạnh nhất vào vị trí xúc tác của enzyme tương tự như chất đối chứng acarbose nhờ hệ thống các liên kết hydrogen (với các nhóm nhận HBA) và tương tác kỵ nước (vùng HP).
Kết luận
Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Hường đã hoàn thành toàn diện việc khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài dược liệu Alpinia blepharocalyx K. Schum và Millettia speciosa Champ thu hái tại Nghệ An, phân lập và xác định cấu trúc thành công 30 hợp chất hữu cơ tinh khiết (9 chất từ hạt Bon bo, 7 chất từ rễ Bon bo và 14 chất từ rễ Cát sâm). Công trình đóng góp cho khoa học 4 hợp chất lần đầu tiên được phát hiện từ loài Cát sâm (ursolic acid, uvaol, pterocarpin, gypenoside XVII), đồng thời chứng minh năng lực kháng viêm của các hợp chất AR1–AR6 từ rễ Bon bo và hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase, AchE của các phân tử từ Cát sâm. Những kết quả thực nghiệm và tính toán docking phân tử thu được cung cấp luận cứ khoa học quan trọng phục vụ công tác tiêu chuẩn hóa dược liệu và nghiên cứu ứng dụng nguồn tài nguyên thực vật bản địa Việt Nam.