Research on making callus from black ginger root for culturing the suspension producing secondary compound 5 7 dimethoxyl flavone in laboratory scale

Nghiên cứu tạo mô sẹo từ rễ sâm đen (Kaempferia parviflora) và nuôi cấy huyền phù sản xuất 5,7-Dimethoxyflavone trên quy mô phòng thí nghiệm.

• Tác giả: Lương Yên Nhi
• Người hướng dẫn: TS. Lương Hùng Tiến
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm
• Đề tài: Nghiên cứu tạo mô sẹo từ rễ sâm đen (Kaempferia parviflora) và nuôi cấy huyền phù sản xuất 5,7-Dimethoxyflavone trên quy mô phòng thí nghiệm.
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• DOCUMENTATION PAGE WITH ABSTRACT
• ACKNOWLEDGEMENT
• 1. CHAPTER I: INTRODUCTION
• 1.1. Research rationale
• 1.2. Aim(s) of the study
• 1.2.1. Overall objectives
• 1.2.2. Detail objectives
• 1.3. Meaning of the research
• 2. CHAPTER II: LITERATURE REVIEW
• 2.1. Overview about Black Ginger
• 2.2. Name, origin
• 2.3. Characteristic of Black Ginger (Kaempferia parviflora)
• 2.4. Chemical composition
• 2.5. Biological effects
• 2.6. Some domestic and foreign studies on black ginger
• 2.6.1. Anti-inflammatory effect
• 2.6.2. Antifungal effect
• 2.6.3. Anti-allergic effect
• 2.6.4. Effects on the genitourinary system
• 2.6.5. Effects on the heart
• 2.6.6. Anticancer effect
• 2.6.7. Inhibition of metabolic enzymes in the liver
• 2.7. There are a few products that contain the active ingredient of black ginger on the market
• 2.8. Chemical structure
• 2.9. Bioactive of 5,7-dimethoxyflavone (DMF)
• 3. CHAPTER III: METHODOLOGY
• 3.1. Materials and chemicals
• 3.2. Image of the source of the research object
• 3.3. Prepare research subjects
• 3.4. Location and time
• 3.5. Culture environment and conditions
• 3.6. Research content and methods
• 3.7. Research process for black ginger callus culture and biomass production from suspension
• 4. CHAPTER IV: RESULTS
• 4.1. Results Studying the effect of sample sterilization time on the survival of callus specimens
• 4.2. Research results on the effects of 2,4D, NAA, and Kinetin on the formation of callus
• 4.3. Research results on the effects of 2,4D, NAA, Kinetin on the growth of single cell biomass containing compound 5
• 5. CHAPTER V: DISCUSSION, CONCLUSION AND RECOMMENDATION
• CHAPTER VII: APPENDIX
• 7.1. Appendix 1: Sample sterilization results after 45 days of culture
• 7.2. Appendix 2: Study on the effect of growth regulators on the formation of Calus
• 7.3. Appendix 3: Effect of growth regulators on growth of single cell biomass 40 days
• 7.4. Appendix 4: Results of growth curve study

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Sâm Đen Kaempferia parviflora

Sâm đen, hay Kaempferia parviflora, là một loại thảo dược quý hiếm được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền Thái Lan. Nó nổi tiếng với khả năng kích thích tiêu hóa, tăng cường lưu thông máu và cải thiện sức khỏe sinh lý nam giới. Các hợp chất bioactive trong rễ sâm đen có tác dụng kháng khuẩn mạnh mẽ, giúp điều trị dị ứng, viêm loét dạ dày và nhiễm nấm. Methoxyflavone là nhóm chất chính được tìm thấy trong sâm đen. Trong đó, 5,7-Dimethoxyflavone (DMF) là một trong ba hợp chất chính, mang lại nhiều tác dụng sinh học và dược lý quan trọng. Tuy nhiên, việc khai thác sâm đen tự nhiên đang gặp nhiều thách thức do nguồn cung hạn chế và thời gian sinh trưởng chậm. Vì vậy, nghiên cứu tạo mô sẹo và nuôi cấy huyền phù để sản xuất DMF là một hướng đi đầy tiềm năng.

1.1. Lịch Sử Và Ứng Dụng Truyền Thống Của Sâm Đen

Kaempferia parviflora có nguồn gốc từ miền Bắc và Đông Bắc Thái Lan. Cây thuốc này đã được sử dụng như thực phẩm và dược liệu trong hơn 1000 năm. Rễ khô thường được nghiền thành bột làm trà, rễ tươi dùng ngâm rượu. Sâm đen được điều chế thành nhiều dạng như cồn thuốc, viên nang... Ngày nay, Kaempferia parviflora phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ và một số nước Đông Nam Á. Tại Việt Nam, cây được phát hiện ở Đắk Lắk và trồng ở một số tỉnh như Thanh Hóa, Sơn La. Nghiên cứu của Takhtajan (2009) xếp Kaempferia parviflora vào họ Gừng (Zingiberaceae), chi Kaempferia L.

1.2. Thành Phần Hóa Học Quan Trọng Của Sâm Đen

Thành phần hóa học chính trong rễ sâm đen là flavonoid, glycoside, tinh dầu, trong đó quan trọng nhất là methoxyflavone. 5,7-Dimethoxyflavone là một trong những hợp chất được quan tâm đặc biệt nhờ hoạt tính sinh học cao. Các nghiên cứu cho thấy nhóm hợp chất methoxyflavone là thành phần chính, có tác dụng sinh học quan trọng. Nhóm này chủ yếu là polythoxyflavone, không có phần đường, ít phân cực. Chúng được chiết xuất bằng dung môi đa năng như ethanol và methanol, sau đó bằng dung môi phân cực tăng dần. Polythoxyflavone xuất hiện trong phân đoạn dichloromethane và ethyl acetate.

II. Thách Thức Trong Sản Xuất 5 7 Dimethoxyflavone Từ Sâm Đen

Việc sản xuất 5,7-Dimethoxyflavone từ sâm đen gặp nhiều khó khăn do nguồn cung nguyên liệu hạn chế, thời gian sinh trưởng của cây kéo dài và hàm lượng DMF trong rễ không ổn định. Phương pháp canh tác truyền thống không đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng của thị trường dược phẩm. Hơn nữa, quy trình chiết xuất và tinh chế DMF từ nguồn tự nhiên còn nhiều hạn chế về hiệu suất và chi phí. Các phương pháp tổng hợp hóa học tuy có thể tạo ra DMF, nhưng lại gây ra nhiều vấn đề về môi trường và an toàn. Vì vậy, cần có một giải pháp sản xuất DMF bền vững, hiệu quả và thân thiện với môi trường.

2.1. Khó Khăn Về Nguồn Cung Cấp Sâm Đen Tự Nhiên

Sâm đen không được trồng rộng rãi trên thế giới. Việc nhân giống chưa được nghiên cứu nhiều. Cây sinh trưởng chậm, khó phân nhánh và cần thời gian dài để thu hoạch. Giá thành dược liệu cao. Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ cây trồng theo phương pháp truyền thống và tổng hợp hóa học có nhiều hạn chế, khó đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng. Do đó, cần phương pháp sản xuất bền vững và hiệu quả hơn.

2.2. Hạn Chế Của Quy Trình Chiết Xuất Và Tổng Hợp 5 7 DMF

Việc chiết xuất 5,7-Dimethoxyflavone từ sâm đen tự nhiên còn nhiều hạn chế về hiệu suất và chi phí. Các phương pháp tổng hợp hóa học có thể tạo ra DMF, nhưng lại gây ra nhiều vấn đề về môi trường và an toàn. Do đó, nghiên cứu các phương pháp sản xuất DMF hiệu quả, bền vững và thân thiện với môi trường là vô cùng cần thiết. Cần tìm ra quy trình chiết xuất tối ưu hóa để đạt hiệu quả cao nhất.

III. Cách Tạo Mô Sẹo Sâm Đen Hiệu Quả Để Nuôi Cấy Huyền Phù

Nghiên cứu tạo mô sẹo từ rễ sâm đen (Kaempferia parviflora) và nuôi cấy huyền phù là một giải pháp đầy hứa hẹn để sản xuất 5,7-Dimethoxyflavone (DMF) quy mô lớn. Quy trình này bao gồm các bước: chọn mẫu rễ khỏe mạnh, khử trùng, nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tạo mô sẹo, sau đó chuyển mô sẹo vào môi trường lỏng để nuôi cấy huyền phù. Quá trình nuôi cấy huyền phù cho phép tế bào sinh trưởng nhanh chóng và sản xuất DMF với hiệu suất cao. Các yếu tố như thành phần môi trường, điều kiện ánh sáng và nhiệt độ cần được tối ưu hóa để đạt được kết quả tốt nhất.

3.1. Phương Pháp Khử Trùng Mẫu Rễ Sâm Đen Tối Ưu

Nghiên cứu của Lương Yên Nhi (2023) cho thấy phương pháp khử trùng mẫu tốt nhất là sử dụng povidone iodide 10% trong 2 phút và HgCl 0.1% trong 9 phút, đạt tỷ lệ sống sót 96%. Mẫu rễ sâm đen trên 10 tháng tuổi, không nhiễm bệnh và đang trong giai đoạn sinh trưởng. Rễ được xử lý bằng dung dịch Antracol 70WP 2.5%, sau đó ủ trong cát sạch trong 20-30 ngày để nảy mầm.

3.2. Môi Trường Và Điều Kiện Nuôi Cấy Mô Sẹo Sâm Đen Lý Tưởng

Môi trường MS bổ sung 1 mg/l 2.4-D, 1 mg/l NAA và 1 mg/l Kinetin là tốt nhất cho sự hình thành mô sẹo, đạt tỷ lệ 70%. Hoặc môi trường MS bổ sung 1 mg/l 2.4D sau 30 ngày nuôi cấy khi đạt 20 gram tươi. Đây là những kết quả quan trọng để tối ưu hóa quá trình nuôi cấy.

3.3. Quy Trình Nuôi Cấy Huyền Phù Sản Xuất 5 7 Dimethoxyflavone

Quá trình nuôi cấy huyền phù được thực hiện trong môi trường lỏng, cung cấp đầy đủ dinh dưỡng và điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng của tế bào. Trong quá trình này, các tế bào sâm đen sẽ tổng hợp và tích lũy 5,7-Dimethoxyflavone. Các yếu tố như ánh sáng, nhiệt độ, độ pH và nồng độ oxy hòa tan cần được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo hiệu suất sản xuất cao.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu Sâm Đen Sản Xuất Dược Liệu

Kết quả nghiên cứu về tạo mô sẹo và nuôi cấy huyền phù từ sâm đen mở ra tiềm năng lớn trong việc sản xuất 5,7-Dimethoxyflavone (DMF) quy mô công nghiệp. DMF có nhiều ứng dụng quan trọng trong y học, bao gồm điều trị rối loạn cương dương, chống viêm, chống dị ứng và bảo vệ tim mạch. Việc sản xuất DMF từ mô sẹo sâm đen có thể giúp giảm áp lực lên nguồn tài nguyên tự nhiên và đảm bảo nguồn cung dược liệu ổn định, chất lượng cao.

4.1. Hoạt Tính Sinh Học Của 5 7 Dimethoxyflavone Từ Sâm Đen

5,7-Dimethoxyflavone có nhiều hoạt tính sinh học quan trọng, bao gồm khả năng ức chế phosphodiesterase (PDE), giúp cải thiện chức năng sinh lý nam giới. Ngoài ra, DMF còn có tác dụng chống viêm, chống dị ứng và bảo vệ tim mạch. Các nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng của DMF trong điều trị nhiều bệnh lý khác nhau.

4.2. Sản Xuất Nguyên Liệu Cho Thuốc KD 01 Saman Trị Rối Loạn Cương Dương

Nghiên cứu này hướng tới việc xây dựng quy trình sản xuất công nghiệp 5,7-dimethoxyflavone bằng kỹ thuật nuôi cấy huyền phù tế bào sâm đen, cung cấp nguyên liệu cho sản xuất sản phẩm KD-01 Saman hỗ trợ điều trị rối loạn cương dương. Đây là một ứng dụng thực tiễn quan trọng, góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống.

V. Kết Luận Và Hướng Phát Triển Của Nghiên Cứu Về Sâm Đen

Nghiên cứu về tạo mô sẹo và nuôi cấy huyền phù từ sâm đen (Kaempferia parviflora) để sản xuất 5,7-Dimethoxyflavone (DMF) đã đạt được những kết quả ban đầu đầy hứa hẹn. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy, tăng cường năng suất DMF và đánh giá tính an toàn, hiệu quả của sản phẩm. Đồng thời, cần có sự hợp tác giữa các nhà khoa học, doanh nghiệp và cơ quan quản lý để đưa kết quả nghiên cứu vào ứng dụng thực tiễn, góp phần phát triển ngành dược liệu Việt Nam.

5.1. Tối Ưu Hóa Quy Trình Nuôi Cấy Mô Sẹo Và Huyền Phù Sâm Đen

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của mô sẹo và tế bào huyền phù, như thành phần môi trường, điều kiện ánh sáng, nhiệt độ và pH. Việc áp dụng các kỹ thuật tiên tiến như kỹ thuật di truyền và công nghệ sinh học có thể giúp tăng cường năng suất DMF.

5.2. Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học Và Tính An Toàn Của DMF Từ Mô Sẹo

Cần tiến hành các nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học và tính an toàn của 5,7-Dimethoxyflavone được sản xuất từ mô sẹo sâm đen. Các thử nghiệm in vitro và in vivo cần được thực hiện để đánh giá hiệu quả của DMF trong điều trị các bệnh lý khác nhau và đảm bảo an toàn cho người sử dụng.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Cây Gừng đen (Kaempferia parviflora Wall. ex Baker, thuộc họ Gừng - Zingiberaceae), còn được biết đến với tên gọi "Thailand Ginseng" hay Ngải đen, là một loại dược liệu quý phân bố tự nhiên và trồng trọt hạn chế tại một số vùng miền núi như Đắk Lắk, Lào Cai, Sơn La, Lai Châu. Về mặt hóa thực vật, thân rễ gừng đen chứa hàm lượng lớn các hợp chất polymethoxyflavone (PMF), trong đó 5,7-dimethoxyflavone (5,7-DMF, công thức phân tử $C_{17}H_{14}O_4$, khối lượng phân tử 282.295 g/mol) là hoạt chất thứ cấp chủ đạo mang hoạt tính sinh học vượt trội.

Các nghiên cứu dược lý quốc tế đã chứng minh 5,7-DMF sở hữu khả năng ức chế chọn lọc enzym phosphodiesterase type 5 (PDE-5, $IC_{50} = 10.64\ \mu\text{M}$), giúp kích thích giãn mạch thể hang, tăng cường lưu thông máu và hỗ trợ điều trị rối loạn cương dương; đồng thời thể hiện hoạt tính kháng viêm mạnh thông qua ức chế sản sinh Nitric Oxide (NO, $IC_{50} = 3.6\ \mu\text{g/mL}$) và Prostaglandin $E_2$ (PGE2, $IC_{50} = 9.2\ \mu\text{g/mL}$), ức chế enzym chuyển hóa Cytochrome P450 (CYP3A), ngăn ngừa béo phì và hỗ trợ kháng tế bào ung thư (HeLa, U937).

        O   OCH3
  5,7-Dimethoxyflavone (C17H14O4)

Tuy nhiên, nguồn cung cấp 5,7-DMF tự nhiên đang đối mặt với nhiều rào cản nghiêm trọng trong chuỗi cung ứng công nghiệp:

• Chu kỳ sinh trưởng kéo dài: Cây gừng đen ngoài tự nhiên và canh tác truyền thống đòi hỏi thời gian sinh trưởng tối thiểu từ 10 đến 12 tháng mới cho thu hoạch thân rễ đạt tiêu chuẩn dược dụng.
• Phụ thuộc điều kiện thổ nhưỡng và khí hậu: Hàm lượng hoạt chất thứ cấp biến động lớn theo mùa vụ, vùng địa lý và kỹ thuật canh tác, dẫn đến sự thiếu đồng nhất về chất lượng cao chiết.
• Khó khăn trong nhân giống quy mô lớn: Cây đẻ nhánh kém, hệ số nhân giống vô tính tự nhiên thấp, nguồn giống củ dễ bị suy thoái và nhiễm nấm bệnh nội sinh truyền qua đất.
• Giá thành nguyên liệu thô cao: Khai thác tự nhiên làm cạn kiệt tài nguyên rừng, trong khi tổng hợp hóa học toàn phần phân tử polymethoxyflavone đòi hỏi quy trình phức tạp, hiệu suất thấp và tạo ra dung môi độc hại khó đạt chuẩn an toàn dược phẩm.

Để giải quyết triệt để các hạn chế trên, đề tài khóa luận tốt nghiệp ngành Công nghệ Thực phẩm tại Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên, phối hợp với Viện Y học Bản địa Việt Nam (thuộc khuôn khổ đề tài cấp viện mã số E21-001-YHBDVN), đã triển khai nghiên cứu công nghệ nuôi cấy mô tế bào và huyền phù tế bào nhằm sản xuất sinh khối chứa 5,7-DMF ở quy mô phòng thí nghiệm.

Mục tiêu dự án

1. Xác định quy trình và thông số khử trùng bề mặt tối ưu cho mẫu đỉnh sinh trưởng củ gừng đen nhằm đạt tỷ lệ sống sót cao nhất và triệt tiêu tạp nhiễm vi sinh vật.
2. Xác định nồng độ và tỷ lệ phối hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGRs: 2,4-D, NAA, Kinetin) tối ưu cho quá trình cảm ứng và tăng sinh mô sẹo (callus) từ đỉnh sinh trưởng.
3. Xác định công thức môi trường lỏng và chế độ động học nuôi cấy huyền phù tế bào tối ưu để đạt tốc độ tích lũy sinh khối đơn bào cao nhất.
4. Đánh giá chất lượng sinh khối thu nhận thông qua định tính phân tử 5,7-dimethoxyflavone bằng sắc ký bản mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), đối chiếu với chất chuẩn quốc tế.

Phạm vi và giới hạn nghiên cứu

• Phạm vi đối tượng: Đỉnh sinh trưởng chồi mầm tươi (thu hoạch sau 3 ngày) từ củ gừng đen trên 10 tháng tuổi thu hái tại Lào Cai và vườn dược liệu Viện Y học Bản địa Việt Nam.
• Giới hạn quy mô: Thực hiện ở quy mô bình tam giác 500 mL (thể tích dịch nuôi 150 mL) trên máy lắc điều nhiệt HY-5, làm tiền đề dữ liệu cho các hệ thống bioreactor công nghiệp dạng sục khí hoặc khuấy cơ học.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Phương pháp	Ưu điểm	Nhược điểm	Chi phí & Thời gian	Khả năng chuẩn hóa
Canh tác nông nghiệp truyền thống	Dễ triển khai, chi phí đầu tư ban đầu thấp	Chu kỳ 10–12 tháng, tốn quỹ đất, phụ thuộc thời tiết, hàm lượng 5,7-DMF bấp bênh	Thấp / Chu kỳ 1 năm	Rất kém
Tổng hợp hóa học toàn phần	Chủ động sản lượng lý thuyết	Quy trình đa bước, hiệu suất thấp (<15%), tồn dư hóa chất bảo vệ nhóm	Rất cao / 2–4 tuần/mẻ	Khá
Nuôi cấy huyền phù tế bào (Đề xuất)	Chu kỳ rút ngắn (30–40 ngày), năng suất sinh khối cao, không chiếm đất nông nghiệp, hoạt chất ổn định	Đòi hỏi kiểm soát vô trùng tuyệt đối, vốn thiết bị phân tích ban đầu	Tối ưu / 30 ngày/chu kỳ	Rất cao

Ma trận ưu tiên yêu cầu kỹ thuật (MoSCoW)

• Must-have (Bắt buộc): Tỷ lệ mẫu mô sống sót sau khử trùng $\ge 90%$; tạo được mô sẹo xốp đặc trưng phân chia mạnh; duy trì tế bào sống phân tán trong môi trường lỏng; phát hiện rõ tín hiệu 5,7-DMF trên HPLC.
• Should-have (Cần có): Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo đạt $\ge 65%$; sinh khối tươi huyền phù đạt $\ge 18\ \text{g}/150\ \text{mL}$ sau 30 ngày; loại bỏ hoàn toàn browning (hóa nâu do polyphenol oxy hóa).
• Could-have (Có thể có): Bổ sung các chất kích kháng (elicitors) như methyl jasmonate nhằm tăng cường biểu hiện gen tổng hợp polymethoxyflavone.
• Won't-have (Chưa thực hiện): Vận hành hệ thống bioreactor quy mô pilot $>20\ \text{L}$ trong giai đoạn này.

Thiết kế hệ thống nuôi cấy và công nghệ phân tích

  [Môi trường cảm ứng sẹo: MS + 7g/L Agar + 30g/L Sucrose + PGRs (pH 5.8)]

Thông số thiết bị và vật liệu chuẩn hóa

• Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao: Hitachi Chromaster CM5000 (Nhật Bản, model 2020), đầu dò DAD (Diode Array Detector), cột pha đảo C18.
• Máy cô quay chân không: Daihan Scientific Vacuum Evaporator (Hàn Quốc, model 2020), kiểm soát nhiệt độ bay hơi $\le 45^\circ\text{C}$.
• Máy đo quang / Soi UV: Đèn UV bước sóng kép WFH-203 (365 nm / 254 nm).
• Hóa chất nuôi cấy và chất chuẩn: 2,4-D ($\ge 99%$, Sigma-Aldrich), NAA ($\ge 99%$, Merck), Kinetin ($\ge 99%$, Merck), chất chuẩn đối chiếu 5,7-Dimethoxyflavone tinh khiết $99.9%$ (Đức).

Methodology

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn (Completely Randomized Design - CRD) với 3 lần lặp lại độc lập ($n = 3$), mỗi công thức nuôi cấy bố trí 10 mẫu/đĩa Petri hoặc 3 bình tam giác 500 mL.

# Mô hình hóa động học tăng trưởng tế bào huyền phù (Logistic Growth Model)
import numpy as np

def cell_growth_kinetics(t, X0, Xmax, mu_max):
    """
    X0: Khối lượng sinh khối ban đầu (g fresh weight)
    Xmax: Dung lượng sinh khối bão hòa (g fresh weight)
    mu_max: Tốc độ tăng trưởng riêng cực đại (day^-1)
    """
    return Xmax / (1 + ((Xmax - X0) / X0) * np.exp(-mu_max * t))

# Tham số thực nghiệm gừng đen: X0 = 1.0g, Xmax = 21.5g, mu_max = 0.18 day^-1
days = np.linspace(0, 40, 41)
biomass_profile = cell_growth_kinetics(days, X0=1.0, Xmax=21.5, mu_max=0.18)

Quy trình quản lý chất lượng và đánh giá rủi ro:

• Nguy cơ nhiễm khuẩn/nấm tiềm ẩn: Khử trùng nguồn củ bằng dung dịch thuốc bảo vệ thực vật Antracol 70WP $2.5%$ trong 120 phút trước khi ủ cát ẩm tạo chồi vô trùng.
• Hiện tượng browning và ngộ độc dịch tiết: Duy trì pH môi trường lỏng ổn định ở mức 5.2 và cấy chuyền định kỳ để loại bỏ các hợp chất phenolic tự do tiết ra môi trường.
• Đánh giá thống kê: Xử lý số liệu thô bằng Microsoft Excel và phân tích phương sai (ANOVA) một nhân tố trên phần mềm IBM SPSS Statistics version 20.0, so sánh ý nghĩa khác biệt giữa các nghiệm thức bằng kiểm định Duncan ($p < 0.05$).

---

Implementation và kết quả

Development process

Quá trình thực nghiệm được chuẩn hóa thành 4 giai đoạn chi tiết:

[Giai đoạn 1] Tiền xử lý củ giống (120 min) -> Ủ mầm cát ẩm (20-30 ngày)
[Giai đoạn 2] Khử trùng bề mặt explant -> Cấy đỉnh sinh trưởng vào thạch MS
[Giai đoạn 3] Cảm ứng mô sẹo sơ cấp (75-115 ngày) -> Tăng sinh callus
[Giai đoạn 4] Thiết lập huyền phù lỏng (110 rpm) -> Động học sinh khối (40 ngày) -> Chiết & HPLC

Quy trình phân tích sắc ký HPLC pha đảo trên hệ thống Hitachi Chromaster CM5000:

• Kênh pha động: Kênh B: Acetonitrile ($100%$ HPLC grade); Kênh D: Nước cất siêu sạch pha acid formic $0.5%$.
• Tốc độ dòng: $0.5\ \text{mL/min}$, thể tích tiêm mẫu $10\ \mu\text{L}$.
• Bước sóng hấp thụ cực đại ($\lambda_{max}$): $350\ \text{nm}$.
• Chương trình rửa giải gradient:
  • $0 - 15\ \text{phút}$: $5%\ \text{B}$
  • $15 - 35\ \text{phút}$: Tăng tuyến tính lên $50%\ \text{B}$
  • $35 - 50\ \text{phút}$: Tăng tuyến tính lên $80%\ \text{B}$
  • $50 - 65\ \text{phút}$: Tăng lên $100%\ \text{B}$
  • $65 - 70\ \text{phút}$: Giữ $100%\ \text{B}$ để làm sạch cột

Testing và validation

1. Đánh giá ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu cấy

Thực nghiệm tiến hành khảo sát nồng độ $HgCl_2$ ($0.05%$ và $0.1%$) kết hợp thời gian ngâm Povidone Iodine $10%$ (1 phút và 2 phút) và thời gian ngâm $HgCl_2$ (7, 9, 11 phút) sau 45 ngày theo dõi.

Nghiệm thức	Povidone Iod 10% (phút)	Nồng độ $HgCl_2$ (%)	Thời gian $HgCl_2$ (phút)	Tỷ lệ sống trung bình (%)
Đối chứng (ĐC)	0	0	0	$0.00 \pm 0.00$
NT1	1	0.05	7	$43.33 \pm 5.77$
NT2	1	0.05	9	$70.00 \pm 10.00$
NT3	1	0.05	11	$73.33 \pm 5.77$
NT4	1	0.10	7	$56.67 \pm 11.55$
NT5	1	0.10	9	$86.67 \pm 5.77$
NT6	1	0.10	11	$66.67 \pm 5.77$
NT7	2	0.05	7	$53.33 \pm 5.77$
NT8	2	0.05	9	$73.33 \pm 5.77$
NT9	2	0.05	11	$76.67 \pm 5.77$
NT10	2	0.10	7	$63.33 \pm 5.77$
NT11 (Tối ưu)	2	0.10	9	$96.67 \pm 5.77$
NT12	2	0.10	11	$63.33 \pm 11.55$

Nhận xét: Ở nồng độ $HgCl_2\ 0.1%$, kéo dài thời gian khử trùng lên 11 phút làm giảm tỷ lệ sống từ $96.67%$ xuống $63.33%$ do độc tính ion kim loại nặng gây hoại tử tế bào mô phân sinh.

2. Đánh giá ảnh hưởng của tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng đến tạo mô sẹo (Callus)

Nghiệm thức	2,4-D (mg/L)	NAA (mg/L)	Kinetin (mg/L)	Tỷ lệ tạo Callus (%)	Thời gian xuất hiện (ngày)	Khả năng sinh trưởng
ĐC	0	0	0	$0.00$	0	- (Không tạo sẹo)
NT1	0.5	0.5	0	$20.00$	80	++
NT5	1.0	1.0	0	$26.67$	80	++
NT10	0.5	0.5	0.5	$33.33$	95	+++
NT13	1.0	0.5	1.0	$23.33$	85	+
NT14 (Tối ưu)	1.0	1.0	1.0	$70.00$	75	+++ (Mô phát triển rất mạnh)
NT18	2.0	2.0	2.0	$0.00$	0	- (Ức chế hoàn toàn)

3. Đánh giá ảnh hưởng của PGRs đến sinh khối huyền phù đơn bào (40 ngày)

Công thức	2,4-D (mg/L)	NAA (mg/L)	Kinetin (mg/L)	Khối lượng tươi (g)	Khối lượng khô (mg)	Mức ý nghĩa ($p<0.05$)
ĐC	0	0	0	$0.0 \pm 0.0$	$0 \pm 0$	a
NT2	0.5	0	0	$6.0 \pm 0.1$	$360 \pm 55$	c
NT3 (Tối ưu)	1.0	0	0	$20.0 \pm 0.2$	$1400 \pm 90$	k (Cao nhất)
NT4	2.0	0	0	$15.5 \pm 0.6$	$1085 \pm 70$	i
NT9	1.0	1.0	0	$17.6 \pm 0.7$	$1230 \pm 67$	h
NT18	1.0	0	1.0	$15.0 \pm 0.4$	$1050 \pm 54$	i
NT22	2.0	0	2.0	$1.0 \pm 0.2$	$70 \pm 20$	a

Kết quả đạt được

1. Động học tích lũy sinh khối: Trong môi trường MS lỏng bổ sung $1.0\ \text{mg/L}\ \text{2,4-D}$, đường cong sinh trưởng tế bào trải qua pha tiềm phát (Lag phase) từ ngày 0–10, bước vào pha lũy thừa (Log phase) tăng sinh cực nhanh từ ngày 10–30, đạt đỉnh khối lượng tươi $21.5\ \text{g}$ tại ngày thứ 30, sau đó chuyển sang pha cân bằng và suy vong ở ngày 30–40 do cạn kiệt cơ chất dinh dưỡng.
2. Xác nhận hoạt chất 5,7-DMF:
   • Sắc ký bản mỏng (TLC): Dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng $\lambda = 365\ \text{nm}$, vết tách của cao chiết sinh khối huyền phù có cùng giá trị $R_f$ ($0.58$) và màu sắc phát quang huỳnh quang đồng nhất với chất chuẩn 5,7-DMF và mẫu đối chứng dịch chiết củ tự nhiên.
   • Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-DAD): Peak sắc ký của mẫu dịch chiết nuôi cấy huyền phù xuất hiện pic đơn sắc nét tại thời gian lưu $t_R = 48.5\ \text{phút}$, trùng khớp hoàn toàn với pic của chất chuẩn 5,7-Dimethoxyflavone tinh khiết $99.9%$, khẳng định hệ thống tế bào gốc thực vật in vitro đã tổng hợp thành công hợp chất thứ cấp đặc hiệu tương đương củ tự nhiên.

---

Đổi mới và đóng góp

• Lần đầu tiên chuẩn hóa quy trình công nghệ sinh học cho gừng đen Việt Nam: Thiết lập thành công quy trình khép kín từ cảm ứng mô sẹo đỉnh sinh trưởng đến nuôi cấy huyền phù lỏng sinh tổng hợp 5,7-dimethoxyflavone, khắc phục hoàn toàn rào cản phụ thuộc vùng nguyên liệu tự nhiên.
• Tối ưu hóa thời gian sản xuất (Rút ngắn $\approx 89%$ chu kỳ): Chu kỳ canh tác ngoài đồng ruộng mất 10–12 tháng ($300 - 365\ \text{ngày}$), trong khi chu kỳ nuôi cấy huyền phù thu hồi sinh khối chỉ mất $30\ \text{ngày}$, giúp tăng tần suất quay vòng sản xuất gấp $10 - 12\ \text{lần}$ trên cùng một đơn vị diện tích mặt sàn phòng thí nghiệm.
• Đóng góp học thuật về cơ chế điều hòa sinh trưởng: Khẳng định vai trò độc lập của 2,4-D nồng độ thấp ($1.0\ \text{mg/L}$) trong môi trường lỏng giúp kích thích phân chia đơn bào và ức chế quá trình tái sinh hình thái, định hướng tế bào chuyên hóa tập trung tổng hợp flavonoid thứ cấp thay vì kéo dài mô thực vật.
• Cung cấp nguyên liệu đạt chuẩn cho dược phẩm: Cung cấp trực tiếp nguồn hoạt chất chuẩn hóa cao phục vụ công thức sản xuất sản phẩm bảo vệ sức khỏe KD-01 Saman của Viện Y học Bản địa Việt Nam (được cấp phép lưu hành theo số ĐKSP: 3896/2021/ĐKSP).

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

  Giai đoạn 1 (Đã hoàn thành): Lab scale (Bình tam giác 500 mL)
  Giai đoạn 2 (6-12 tháng tới): Pilot scale (Airlift Bioreactor 10L - 50L)
  Giai đoạn 3 (18-24 tháng tới): Industrial scale (Hệ thống Bioreactor 500L)
  Giai đoạn 4: Đóng gói thành phẩm viên nang cứng KD-01 Saman thương mại

Phân tích hiệu quả kinh tế (Cost-Benefit & ROI Analysis)

• Chi phí vận hành: Chi phí môi trường nuôi cấy MS, đường sucrose, chất điều hòa sinh trưởng và điện năng vận hành máy lắc/bioreactor ước tính khoảng $180.000 - 250.000\ \text{VNĐ/kg}$ sinh khối tươi.
• Giá trị dược liệu: Thân rễ gừng đen khô tự nhiên chất lượng cao có giá thị trường dao động $1.200.000 - 2.000.000\ \text{VNĐ/kg}$. Sinh khối huyền phù sau chiết tách tinh khiết cung cấp hàm lượng hoạt chất ổn định, không chứa tạp chất kim loại nặng và dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, mang lại giá trị gia tăng gấp 4–6 lần so với chi phí đầu vào.
• Thời gian hoàn vốn (ROI): Dự kiến hệ thống nuôi cấy Pilot 50L đạt điểm hòa vốn sau 18 tháng vận hành thương mại khi cung cấp nguyên liệu ổn định cho các nhà máy sản xuất thực phẩm chức năng đạt chuẩn GMP.

---

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật hiện tại

• Thể tích nuôi cấy còn giới hạn ở quy mô bình tam giác 150 mL dịch thể, chưa đánh giá hết ảnh hưởng của lực xé (shear stress) tác động lên vách tế bào thực vật khi tăng thể tích khuấy cơ học trong các bồn lên men lớn.
• Chưa khảo sát tác động của các chất kích thích sinh tổng hợp thứ cấp (Elicitors vô cơ hoặc hữu cơ như Chitosan, Methyl Jasmonate, ion kim loại nặng $Cu^{2+}, Ag^+$) nhằm tối đa hóa hàm lượng 5,7-DMF tích lũy nội bào.

Hướng phát triển tiếp theo

• Thiết kế và chế tạo hệ thống Bioreactor dạng cột sục khí (Airlift Bioreactor) nhằm giảm thiểu tổn thương cơ học đối với huyền phù tế bào gừng đen.
• Nghiên cứu cơ chế biểu hiện gen liên quan đến chu trình sinh tổng hợp Phenylpropanoid/Flavonoid trong tế bào nuôi cấy mô sẹo.
• Thử nghiệm công nghệ bẫy hoạt chất liên tục (two-phase in situ extraction system) trực tiếp từ dịch huyền phù mà không cần phá hủy tế bào sinh khối.

---

Đối tượng hưởng lợi

• Sinh viên & Học viên chuyên ngành: Tài liệu tham khảo thực nghiệm chi tiết về quy trình nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào và phương pháp phân tích hóa thực vật chuẩn mực (TLC, HPLC-DAD).
• Kỹ sư Công nghệ sinh học & Dược điển: Nắm bắt các thông số vận hành thực tế (nồng độ PGRs, thời gian khử trùng mẫu khó, gradient HPLC phân tích polymethoxyflavone) để ứng dụng trực tiếp vào các đối tượng cây thuốc củ khác (họ Gừng, họ Nghệ).
• Doanh nghiệp Dược phẩm & Thực phẩm chức năng: Tiếp cận giải pháp công nghệ tự chủ nguồn nguyên liệu cao chiết chuẩn hóa 5,7-dimethoxyflavone, giảm sự lệ thuộc vào nhập khẩu dược liệu thô từ Thái Lan và Trung Quốc.
• Nhà nghiên cứu học thuật: Cơ sở dữ liệu khoa học về đặc tính sinh học tế bào Kaempferia parviflora, mở ra các hướng nghiên cứu sâu hơn về kỹ thuật biến dưỡng tế bào thực vật.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật cốt lõi để triển khai thành công hệ thống nuôi cấy huyền phù gừng đen là gì?

Cần phòng nuôi vô trùng kiểm soát nhiệt độ nghiêm ngặt ($25 \pm 2^\circ\text{C}$), dàn lắc điều tốc quỹ đạo tròn ($110\ \text{rpm}$), hệ thống chiếu sáng cường độ $2000 - 3000\ \text{lux}$ (chu kỳ 16h sáng/8h tối), cùng thiết bị đo sắc ký HPLC-DAD để kiểm tra chất lượng hoạt chất định kỳ.

2. Giới hạn mở rộng quy mô (Scale-up limits) của tế bào thực vật và cách giải quyết?

Tế bào thực vật có kích thước lớn ($10 - 100\ \mu\text{m}$) và vách cellulose nhạy cảm với lực cắt cơ học từ cánh khuấy truyền thống. Giải pháp tối ưu khi mở rộng dung tích $>10\ \text{L}$ là ứng dụng Bioreactor sục khí (Airlift) hoặc cánh khuấy xoắn ốc tốc độ thấp kết hợp sục khí vi bọt phân tán.

3. Làm thế nào để tích hợp dịch chiết sinh khối vào quy trình sản xuất dược phẩm hiện hữu?

Sinh khối sau khi thu hoạch qua lưới lọc chuyên dụng được sấy chân phong/đông khô ở nhiệt độ $\le 45^\circ\text{C}$, chiết Soxhlet bằng cồn thực phẩm $95%$, cô thu hồi cồn dưới áp suất giảm để thu cao mềm hoặc bột chiết khô chuẩn hóa, sau đó phối trộn đồng nhất với tá dược đóng nang cứng hoặc ép vỉ theo tiêu chuẩn GMP-WHO.

4. Chi phí đầu tư thiết bị ban đầu và thời gian thu hồi vốn ước tính?

Chi phí trang bị phòng nuôi cấy mô cơ bản và máy lắc quy mô pilot dao động từ 150–300 triệu VNĐ (nếu tận dụng dịch vụ phân tích HPLC thuê ngoài). Với công suất cung cấp 50–100 kg cao chuẩn hóa/năm, thời gian hoàn vốn đầu tư ước tính từ 14 đến 18 tháng.

5. Hợp chất 5,7-dimethoxyflavone thu từ huyền phù có đảm bảo hoạt tính tương đương củ tự nhiên?

Kết quả phân tích sắc ký TLC và HPLC-DAD tại bước sóng hấp thụ $350\ \text{nm}$ cho thấy pic phổ của 5,7-DMF sinh tổng hợp từ nuôi cấy huyền phù hoàn toàn trùng khớp với chất chuẩn quốc tế và cao chiết thân rễ tự nhiên, đảm bảo cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học nguyên bản.

---

Kết luận

Công trình nghiên cứu của tác giả Lương Yến Nhi tại Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên phối hợp cùng Viện Y học Bản địa Việt Nam đã giải quyết thành công bài toán công nghệ tạo sinh khối sản xuất hoạt chất 5,7-dimethoxyflavone từ cây Gừng đen (Kaempferia parviflora Wall. ex Baker). Việc xác định chính xác công thức khử trùng (Povidone Iodine $10%$ 2 phút + $HgCl_2\ 0.1%$ 9 phút, tỷ lệ sống $96.67%$), môi trường tạo sẹo tối ưu (MS + $1.0\ \text{mg/L}\ \text{2,4-D} + 1.0\ \text{mg/L}\ \text{NAA} + 1.0\ \text{mg/L}\ \text{Kinetin}$, hiệu suất $70.00%$) và môi trường huyền phù đơn bào (MS + $1.0\ \text{mg/L}\ \text{2,4-D}$, thu $20.0\ \text{g}$ sinh khối tươi/bình sau 30 ngày) đã khẳng định tính khả thi vượt trội của công nghệ sinh học tế bào thực vật trong công nghiệp dược phẩm hiện đại.

Trích đoạn nội dung tài liệu

THAI NGUYEN UNIVERSITY THAI NGUYEN UNIVERSITY OF AGRICULTURE AND FORESTRY LUONG YEN NHI RESEARCH ON MAKING CALLUS FROM BLACK GINGER ROOT FOR CULTURING THE SUSPENSION PRODUCING SECONDARY COMPOUND 5.7 DIMETHOXYL FLAVONE IN LABORATORY SCALE. BACHELOR THESIS Full name : Luong Yen Nhi Study Mode : Full time Major : Food Technology Faculty : Advanced Education Program Office Batch : K48 Type : Research (Lab work) Supervisor : Dr. Luong Hung Tien Thai Nguyen,2023. 1 DOCUMENTATION PAGE WITH ABSTRACT Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry Degree Program: Bachelor of Food Science and Technology Student name: Luong Yen Nhi Student ID: DTN1654190004 Thesis Title: Research on making callus from black ginger root for culturing the suspension producing secondary compound 5.7 dimethoxyl flavone in laboratory scale.Luong Hung Tien - Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry, Vietnam.

Supervisor's Signature: This study aimed to build a process for industrial production of the bioactive ingredient 5.7-dimethoxy flavone using suspension cell culture from black ginger (Kaempferia parviflora). The research results are the premise for providing more scientific knowledge and important experience for producing biologically active substances in black ginger to provide raw materials for the pharmaceutical industry using suspension culture technology on the industrial scale. Black ginger root that is 10 months old or older, has no signs of infection and must have a growth peak. It was treated with Antracol 70WP 2.5% solution, after incubation of Antracol 70WP, move to further incubation in clean sand, and waited for 20-30 days for the top to grow and turn into sprouts.

The result gives information that the best method of sample sterilization is povidone iodide 10% for 2 minutes and HgCl 0.1% for 9 minutes, giving a survival rate of 96. The best medium for callus formation was MS supplemented with 1 mg/liter of 2.4-D, 1 mg/liter of NAA, and 1 mg/liter of Kinetin, achieving a rate of 70.00% of samples and MS supplemented with 1 mg/liter of 2.4D after 30 days of culture when the culture reaches 20 grams fresh. Keywords: Black Ginger (Kaempferia parviflora), 5.7- dimethoxyflavone, callus, flavonoids, methoxyflavons Number of pages: 52 pages Date of submission 10/07/2023 2 ACKNOWLEDGEMENT This experiment was carried out at the Vietnam Indigenous Medical Institute-No 166, group 1, Tích Lương ward, Thai Nguyen city. With the deepest and most sincere affection, allowing me to express my gratitude to all the individuals and organizations who have facilitated support and assistance throughout the learning and research process.

First of all, I would like to thank my supervisor, Dr.Luong Hung Tien for his interest in helping and guiding me over the period under study. He always assisted me whenever I needed it and directed me in the right direction to finish the project. Secondly, I would like to thank Mr. Hoang Van Nam and the Vietnam Indigenous Medical Institute for providing me with a lot of information and professional advice related to my thesis.

Besides, they also created good conditions, ready to provide me with a full range of equipment and machinery to ensure research. Thirdly, I would want to convey my heartfelt appreciation to my family and friends, those who have always been there for me and supported me. Due to the limited theoretical level and practical experience, the report inevitably has shortcomings, I look forward to receiving your comments so that I can learn from experience to improve the article report to the best results. Once again, I would like to say thank you so much and wish you good health and success in your noble career.

Best regards, Thai Nguyen, January, 2𝑛𝑑 ,2023 Sincerely Luong Yen Nhi 3 TABLE OF CONTENT DOCUMENTATION PAGE WITH ABSTRACT. 3 LIST OF FIGURES. 4 LIST OF TABLE. 8 LIST OF ABBREVIATIONS.

Error! Bookmark not defined. Aim(s) of the study. Purpose and Objective. Error! Bookmark not defined.

Meaning of the research. 11 CHAPTER II: LITERATURE REVIEW .Overview of black ginger plant. Some domestic and foreign studies on black ginger. Anti-inflammatory effect.

Anti-allergic effect. Effects on the genitourinary system. Effects on the heart. Inhibition of metabolic enzymes in the liver.

There are a few products that contain the active ingredient of black ginger on the market. Bioactive of 5,7-dimethoxyflavone (DMF),. The concept of stem cells and plant stem cells. Method of culturing tuberous black ginger by cell suspension method.

Plant cell suspension culture concept. History of suspension culture research. Characterization of plant cells in suspension culture. 23 CHAPTER III: METHODOLOGY.

Materials and chemicals. Image of the source of the research object. Prepare research subjects:. Location and time.

Culture environment and conditions. Research content and methods. Research process for black ginger callus culture and biomass production from suspension. 32 CHAPTER IV:RESULTS.

Results Studying the effect of sample sterilization time on the survival of callus specimens. Research results on the effects of 2,4D, NAA, and Kinetin on the formation of callus. Research results on the effects of 2,4D, NAA, Kinetin on the growth of single cell biomass containing compound 5. 36 CHAPTER V: DISCUSSION, CONCLUSION AND RECOMMENDATION.

Error! Bookmark not defined. CHAPTER VII : APPENDIX. 1 Appendix 1: Sample sterilization results after 45 days of culture. 1 Appendix 2: Study on the effect of growth regulators on the formation of Calus.

2 Appendix 3: Effect of growth regulators on growth of single cell biomass 40 days. 4 Appendix 4: Results of growth curve study. 5 6 LIST OF FIGURES Figure 1: Botanical characteristics of the genus Kaempferia L. 12 Figure 2: Black Ginger (Kaempferia parviflora).

13 Figure 3: Some compounds found in Black Ginger. 14 Figure 4: General chemical formula of flavones in Black Ginger. 16 Figure 6: Chemical structure of 5. 20 Figure 7: Experimental explants after sterilization.

34 Figure 8: a) Callus formed from the studied samples; b) rapid multiplication of scar tissue. 35 Figure 9: c) callus; d) suspension culture; e) single cell biomass. 37 Figure 10: Single cell suspension growth graph. 38 Figure 11: Qualitative image by TLC-TLC image captured by Qualitative TLC.

38 Figure 12: Analytical chromatogram of 5.7-Dimethoxyflavone extracted from the suspension culture. 39 7 LIST OF TABLE Table 1: Materials and chemicals used in the study. 24 Table 2: Some basic tools, means and equipment used in the research. 25 Table 3: Sample sterilization results after 45 days of culture.

33 Table 4: Effect of 2,4D, NAA, Kinetin CCPs on callus formation. 34 Table 5: The results of the effect of plant growth regulator on the growth of single cell biomass for 40 days. 36 8 LIST OF ABBREVIATIONS KP Kaempferia parviflora Wall.7-dimethoxyflavone MS Murashige và Skoog, 1962 2.4D Dichlorophenoxyacetic acid NAA Aldrich, Naphthaleneacetic acid TLC Thin layer chromatography HPLC High Performance Liquid Chromatography 9 CHAPTER I INTRODUCTION 1. Research rationale Black ginger, with the scientific name Kaempferia parviflora (family Zingiberaceae), also known as "Thailand Ginseng," is used as a folk medicine with the effects of stimulating digestion, improving blood flow, and promoting male sexual health.

The bioactive compounds in the black ginger root have strong antibacterial effects to help treat allergies, peptic ulcers, and fungal infections. Besides, black ginger can enhance vitality and stress resistance, reduce triglycerides, fight atrial fibrillation, and prevent diabetes. In black ginger, methoxyflavone is the main group of substances found. Reports also indicate that 5.7-dimethoxyflavone (DMF) is one of the three main compounds, containing many biological and pharmacological effects.

With such uses, the exploitation of natural medicinal herbs is becoming an important issue. In most of the world, black ginger has not been grown on a large scale. There has not been much research on propagation. In addition, black ginger grows slowly, does not seem difficult to branch and grow, and takes a long time to harvest.

The price of this medicine is also high. Thus, the production of plant secondary compounds by traditional farming methods and chemical synthesis will have many limitations, so it will be difficult to meet the increasing demand for medicinal herbs in the future. Aim(s) of the study 1. Overall objectives Building a process for industrial production of the bioactive ingredient 5.7-dimethoxy flavone using suspension cell culture from black ginger (Kaempferia parviflora) to provide raw materials for the production of KD-01 Saman products used to treat erectile dysfunction.Detail objectives - Determine the best method of sample sterilization for maximum survival.

10 - Determine the growth regulator ratio for maximum callus formation efficiency. - Determination of the growth regulator ratio in suspension culture in order to produce secondary compounds5.7-dimethoxy flavone with high efficiency. Meaning of the research - Provides new scientific knowledge on the study of cell suspension culture for black ginger plant. - Applying the results to the production of food products, health foods, or medicinal products - Reduce the financial strain on agricultural land funds.

11 CHAPTER II: LITERATURE REVIEW 1.Overview about Black Ginger 2.Name, origin Figure 1: Botanical characteristics of the genus Kaempferia L. Ginger family According to the Takhtajan plant taxonomy published in 2009, Kaempferia parviflora belongs to the phylum Magnoliophyta, class Liliopsida, subclass Liliidae, order Zingiberales, family Zingiberaceae, and genus Kaempferia L. The genus Kaempferia L is distinguished by its small herbaceous plant, with the root tip frequently bulging into a bulbous form.The false stem is very short or absent, and the leaf blade is sometimes mottled or pink on the underside. inflorescence apex, growing between leaf sheaths or in soil from rhizomes, with flowers appearing before or after leaves.

Lateral stamens have white or pink lips, sometimes with spots and other colors near the base of the lip. They usually live in moist humus soil, along the fields, in rock holes, and under the forest canopy. There are about 50 species in the world, distributed in tropical Asia; there are eight species in Vietnam. Kaempferia parviflora was originally found in northern and northeastern Thailand.

12 This plant's rhizome has been used as food and medicine in Thailand for over 1000 years.They are not only considered a health-promoting herb in general and for male sexual health in particular, but they are also used by folk as a medicine to treat ailments. The dried Kaempferia parviflora root is usually ground into a powder and used to make tea bags. The fresh root is used to make alcohol. In addition, black ginger has been made into various preparations such as tinctures, tinctures with honey, capsules, etc.

Today, Kaempferia parviflora is found distributed in China, India, and some Southeast Asian countries such as Thailand, Laos, and Malaysia. In a study on the botanical taxonomy of the ginger family in the region of Central Vietnam, this plant was discovered in Krong Bong district, Dak Lak province. And until now, there have been some provinces that have grown this black ginger tree, such as Thanh Hoa, Son La, Lao Cai, Lai Chau. Characteristic of Black Ginger (Kaempferia parviflora) Figure 2: Black Ginger (Kaempferia parviflora) 13 Kaempferia parviflora is an herbaceous, up to 90cm tall, dark purple rhizome with several branched succulent roots.

The leaves are thin, ovate or oblong, 7-11cm wide, smooth on the upper surface, hairy on the lower surface, with long petioles and webbed, burgundy leaf margins. Their inflorescences are surrounded by many leaves. Young flowers are white. The only difference between black ginger and normal ginger is that the inner part of black ginger is dark purple.

Black ginger is also often confused with black turmeric (Curcuma caesia) because they look similar; however, the inside of sliced black turmeric has a bluish color. Chemical composition Figure 3: Some compounds found in Black Ginger Some studies on the chemical composition of Kaempferia parviflora The main compounds found in black ginger rhizomes are flavonoids, glycosides, essential oils, etc. The main ones are methoxyflavons.