MỞ ĐẦU Dioxin thuộc nhóm các hợp chất thơm đa halogen khó phân hủy (Polyhalogenated aromatic compounds- PHAHs) là các chất gây ô nhiễm môi trường phổ biến bao gồm dibenzo-p-dioxin polychlorin hóa (PCDDs), dibenzofurans (PCDFs), biphenyls (PCB) và ete diphenyl (PCDEs). PCB đã được sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng công nghiệp đa dạng như chất hóa dẻo, chất chống cháy, phụ gia sơn, chất kết dính, dầu ngâm, chất bịt kín và sáp. PCBs tích lũy trong môi trường chủ yếu do tính chất hóa lý, tính ổn định sinh học và bản chất kỵ nước của chúng. Mặt khác, PCDD, PCDF và PCDE chủ yếu được hình thành dưới dạng sản phẩm phụ trong quá trình công nghiệp hoặc quá trình đốt cháy bao gồm các lò đốt rác đô thị.
Dư lượng dioxin đã được phát hiện trong nhiều loại chất nền bao gồm đất, trầm tích, nước, cá, động vật hoang dã, mô mỡ của con người, huyết thanh và sữa. Mặc dù mức độ phát thải dioxin đã giảm hơn 80% kể từ những năm 1980 ở hầu hết các quốc gia, nhưng việc phơi nhiễm các hợp chất tương tự dioxin qua đất hoặc trầm tích bị ô nhiễm và tích tụ trong chuỗi thức ăn vẫn là một vấn đề cho đến ngày nay. Con người tiếp xúc với dioxin và các hợp chất liên quan chủ yếu thông qua thực phẩm (thịt, các sản phẩm từ sữa và cá) nên an toàn thực phẩm và thức ăn chăn nuôi được ưu tiên cao. EU đã đưa ra các tiêu chuẩn giới hạn nghiêm ngặt đối với hàm lượng dioxin trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bao gồm Chỉ thị của Ủy ban EU 2003/57/EC, 2002/69/EC, 2002/70/EC và Quy định của Hội đồng số 2375/2001).
Do đó, các phương pháp phát hiện dioxin đã được nghiên cứu và phát triển. Một trong số đó là xét nghiệm DR- CALUX (Dioxin Response Chemical Activated Luciferase Gene eXpression). Phương pháp DR-CALUX là một kỹ thuật dùng tế bào cảm biến sinh học đã được chuyển gen sinh tổng hợp luciferase để phát hiện dioxin và các chất dẫn xuất trong mẫu vật ra đời với nhiều ưu điểm, có thể đánh giá được đúng cơ chế của dioxin lên tế bào và phân tích sàng lọc được nhiều mẫu với thời gian ngắn. Hiện nay, xét nghiệm tế bào đã được thiết lập tốt tại một số phòng thí nghiệm ở châu Âu và trên toàn thế giới.
Các “xét nghiệm sinh học” này được thực hiện sàng lọc giám sát nồng độ và xác định các mẫu nghi ngờ vi phạm 2 quy định an toàn thực phẩm. Đơn vị Nghiên cứu xét nghiệm Sinh học tại Phòng thí nghiệm Tham khảo của Liên minh Châu Âu (EU-RL) về Dioxin và PCB trong Thức ăn và Thực phẩm đã đánh giá và tối ưu hóa hiệu suất của xét nghiệm sinh học gen DR CALUX để sử dụng nó trong kiểm soát thức ăn và thực phẩm chính thức của Châu Âu. Tại Bỉ, Cơ quan Liên bang về An toàn Chuỗi Thực phẩm (FASFC) sử dụng phương pháp CALUX như một công cụ sàng lọc để giám sát sự tuân thủ tiêu chuẩn thực phẩm. Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về dioxin và các chất dẫn xuất cũng như nghiên cứu về các phương pháp CALUX phát hiện dioxin trong đất, nước, sữa mẹ, trong máu và thực phẩm… Tuy nhiên, các nghiên cứu vẫn sử dụng các bộ kit CALUX của nước ngoài với chi phí khá cao, hiện chưa có nghiên cứu nào về sản xuất dòng tế bào chuyển gen luciferase nhằm chủ động trong động trong việc sàng lọc phát hiện các chất độc hại đã biết cũng như góp phần phát hiện ra các chất chưa biết.
Ngoài ra, dòng tế bào CALUX thương mại sau một thời gian sử dụng bị thoái hóa nên khả năng phát hiện các chất độc bị giảm đi nên cần phải mua mới, rất tốn kém. Do đó, việc chủ động được dòng tế bào CALUX là cần thiết. Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu tạo dòng tế bào DR CALUX hướng tới ứng dụng sàng lọc dioxin hoặc các chất dẫn xuất dioxin” với mục tiêu và nội dung như sau: Mục tiêu: Tạo được dòng tế bào DR CALUX mang cấu trúc DREs và gen phát quang đảm bảo độ nhạy cho việc sàng lọc/ phát hiện dioxin hoặc các dẫn xuất dioxin Nội dung: 1. Tạo dòng tế bào DR CALUX mang plasmid chứa cấu trúc DREs và gen luciferase, 2.
Thiết kế vector biểu hiện mang cấu trúc DREs+eGFP và tạo dòng tế bào DR CAFLUX chứa plasmid mang cấu trúc DREs và gen phát huỳnh quang GFP. Dioxin và độc tính của dioxin 1. Dioxin và các chất dẫn xuất Dioxin là tên gọi chung của một nhóm hàng trăm hợp chất hóa học tồn tại lâu dài trong môi trường, cũng như trong cơ thể con người và các sinh vật khác. Dioxin là những hợp chất rất ổn định với tính chất phân cực thấp, ưa mỡ và kỵ nước.
Chúng được phân loại thành ba nhóm: polychlorinated dibenzo- p-dioxins (PCDDs, được gọi là dioxin), polychlorinated dibenzofurans (PCDFs, được gọi là furan), và polychlorinated biphenyls coplanar (PCB tương tự dioxin, được gọi là dl-PCBs). Tùy theo số lượng nguyên tử clo và vị trí không gian, dioxin có 75 đồng loại PCDD (poly-chloro-dibenzo-dioxins) và 135 đồng loại PCDFs (poly-chloro-dibenzo-furans) với độc tính khác nhau. Trong 210 đồng loại, 17 đồng loại được biết là có độc tính cao vì chúng có thể có nguyên tử clo ở các vị trí 2, 3, 7 và 8 trên vòng benzen. Dựa trên hệ số tương đương độc tính quốc tế (I-TEF), 2,3,7,8-TCDD/TCDFs được biết đến là các hợp chất độc hại nhất [1].
Cấu trúc hóa học của TCDD, PCDD, PCDF và PCB được thể hiện trong Hình 1. Cấu trúc hóa học của các hợp chất TCDD, PCDD, PCDF và PCB [2]. Dioxin hầu như không tan trong nước, có độ ổn định nhiệt cao, chỉ có thể bị phân hủy hoàn toàn ở nhiệt độ trên 1200°C, bền với axit và kiềm mạnh và bám trên bề mặt các nguồn hữu cơ, đặc biệt là trong đất [3]. 4 Dioxin và các chất dẫn xuất không được sản xuất mà chúng được tạo ra khi sản xuất các hóa chất hoặc sản phẩm khác, một số ít được sản xuất dùng cho nghiên cứu khoa học.
Dioxin cũng được hình thành trong tự nhiên nhưng chủ yếu bắt nguồn từ sự tương tác của con người, đặc biệt là liên quan đến quá trình đốt cháy. Sự hình thành PCDD hoặc Furan được thúc đẩy bởi các phản ứng ở nhiệt độ cao giữa các hợp chất hữu cơ và clo. Do đó, các hoạt động như đốt rác thải, nấu chảy kim loại, cháy rừng và đốt nhiên liệu diesel sẽ tạo ra dioxin và các chất dẫn xuất [4]. Nồng độ dioxin trong khí quyển đã thay đổi trong những thập kỷ qua.
Do sự hình thành PCDD/Fs chủ yếu chịu ảnh hưởng của các nguồn nhân tạo nên nồng độ dioxin trong môi trường không đáng kể cho đến khi có sự phát triển của ngành hóa chất vào những năm 1920. Từ đó cho đến đỉnh điểm vào những năm 1970 mức độ phát thải và nồng độ dioxin trong không khí, đất và nước đã tăng lên nhiều lần, nguyên nhân chủ yếu là do sự thiếu hiểu biết chung về tác động tiêu cực của các hợp chất này đối với sức khỏe con người. Ngoài ra, do thiếu sự kiểm soát và quy trình khẩn cấp trong các nhà máy công nghiệp thời đó nên đã xảy ra những tai nạn nghiêm trọng gây ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường ở các khu vực khác nhau trên thế giới, chẳng hạn như thảm họa sinh thái ở Seveso, Ý. PCDD/Fs như TCDD còn có mặt trong các cuộc xung đột vũ trang, như chất độc da cam trong Chiến tranh Việt Nam [5].
Nhưng xu hướng đã thay đổi từ những năm 1970 cho đến ngày nay; khi mà nhận thức xã hội được nâng cao, các quy trình công nghiệp hiệu quả hơn và luật pháp chặt chẽ hơn đã làm giảm mức độ phát thải và ô nhiễm của PCDD/Fs từ các nguồn công nghiệp [5]. Mặt khác, khí thải từ các nguồn phi công nghiệp hầu như không thay đổi trong những năm qua và ngày nay là một trong những nguyên nhân chính trong sự gia tăng dioxin [6]. * Các nguồn tạo ra dioxin và các chất dẫn xuất Các nguồn tạo ra PCDD/Fs liên quan đến hoạt động của con người bao gồm 5 nguồn chính: (i) các sản phẩm phụ trong quá trình sản xuất hóa chất clo hữu cơ (ví dụ: PCB, chlorophenol, chlorobenzene, thuốc trừ sâu clo hóa, polyvinylchloride (PVC)); (ii) kết quả của quá trình đốt cháy không hoàn toàn khi có nguồn clo (ví dụ: đốt cháy một số loại nhựa); (iii) do sử dụng clo vô cơ (ví dụ như trước đây phổ biến trong ngành tẩy trắng giấy); (iv) tái 5 chế/sản xuất một số loại khoáng sản; (v) kết quả của sự hình thành tự nhiên và sự hiện diện trong một số loại đất sét (ví dụ: đất sét bi Mississippi, kaolinit) tạo thành một phần của thức ăn và thực phẩm bổ sung hoặc có thể được sử dụng trong sản xuất thức ăn và thực phẩm. Mặc dù sự hình thành dioxin xảy ra ở cấp độ cục bộ trong một khu vực nhất định, nhưng sự phân bố của các chất độc này trong môi trường có thể rộng hơn nhiều.
Ví dụ, khi dioxin được giải phóng vào khí quyển sẽ liên kết với các hạt khác, thậm chí bụi mịn PM2.5 như tro hoặc khói của lò đốt, các hạt này có thể lơ lửng và bay theo gió trong thời gian dài trước khi lắng đọng trên các bề mặt trên cạn hoặc dưới nước tại các địa điểm cách xa sự phát tán ban đầu của chúng [7]. Sau đó, dioxin có thể được các sinh vật trong môi trường nước hấp thụ hoặc bám vào cỏ, rau và các loại cây trồng khác [8] , [9]. Động vật ăn cỏ bị nhiễm dioxin như bò, trâu, dê, vịt và gà sẽ tích lũy dioxin trong các mô của chúng (đặc biệt là trong gan và mô mỡ dự trữ chất béo) để chất độc di chuyển qua chuỗi thức ăn và cuối cùng xâm nhập vào con người thông qua chế độ ăn uống [10]. Tốc độ hấp thụ dioxin phụ thuộc vào đường tiếp xúc, kích thước phân tử và độ hòa tan của chúng.
Ví dụ, tỷ lệ hấp thụ TCDD qua ruột non và phổi lần lượt là khoảng 50% và 90% [11]. Theo các nghiên cứu thực nghiệm trên chuột [11], [12], khả năng hấp thụ qua da bị hạn chế hơn nhiều, có thể dưới 1%. Một khi dioxin được hấp thụ vào cơ thể con người, chúng sẽ dễ dàng được phân phối theo dòng máu đến tất cả các cơ quan và đặc biệt có xu hướng tích tụ trong gan và các mô mỡ. Tại gan, dioxin được chuyển hóa thành các hợp chất ít độc hơn, hòa tan trong nước, nhưng quá trình giải độc này diễn ra rất chậm.