Luận án tiến sĩ sinh học: Nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen NAC liên quan đến tính chịu hạn

Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC nhằm nâng cao khả năng chịu hạn cho cây lúa.

Chuyên ngành

Hóa sinh học

Người đăng

Ẩn danh

Thể loại

Luận án tiến sĩ

2018

156
4
0

Phí lưu trữ

45 Point

Mục lục chi tiết

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

1. CHƯƠNG 1: TONG QUAN

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CAY LUA

1.2. Đặc điểm sinh học của cây lúa Oryza sativa

1.3. Ảnh hưởng của hạn hán đối với ngành sản xuất lúa gạo

1.4. Vai trò của nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng stress hạn ở thực vật

1.4.1. Nhân tố phiên mã NAC và vai trò đáp ứng stress hạn ở thực vật

1.5. Agrobacterium tumefaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật

1.5.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn A.

1.5.2. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A.

1.5.3. Hệ thống vector/promoter dùng trong chuyển gen thực vật

1.6. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chống chịu hạn

1.6.1. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chống chịu hạn trên thế giới

1.6.2. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen ở Việt Nam

2. CHƯƠNG 2: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.2. Chủng vi sinh vật

2.3. Vector và oligonucleotide

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Xử lý mẫu thực vật

2.4.2. Tách chiết, định lượng DNA/RNA

2.4.3. Nhân dòng gen OsNACI, OsNAC5 và OsNACT0 vào vector pGEM-T

2.4.4. Thiết kế cấu trúc biểu hiện gen OsNACI trong tế bào thực vật

2.4.5. Tạo cây lúa chuyển gen biểu hiện OsWAC1

2.4.6. Sàng lọc các dòng lúa chuyển gen

2.4.7. Các phương pháp định lượng sinh lý, sinh hóa ở cây lúa

2.4.8. Phương pháp xử lý số liệu thống kê

3. CHƯƠNG 3: KET QUA NGHIÊN CỨU & THẢO LUẬN

3.1. Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan đến tính chịu hạn ở lúa

3.1.1. Khảo sát khả năng chịu hạn của một số giống lúa Việt Nam

3.1.2. Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tới tính chịu hạn

3.2. Phân tích biểu hiện của OsNACI, OsNAC5 và OsNACT0 trong điều kiện hạn

3.3. Thiết kế vector biểu hiện OsNACI trong tế bào thực vật

3.4. Nghiên cứu chuyển gen OsNACT vào cây lúa

3.4.1. Biến nạp vector biểu hiện vào A.

3.4.2. Nghiên cứu chuyển gen OsNACI vào lúa

3.4.3. Sàng lọc các dòng lúa tái sinh được chuyển cấu trúc biểu hiện

3.4.4. Chọn lọc dòng lúa chuyển gen

3.5. Đánh giá sinh trưởng phát triển và khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu chung về cây lúa và vấn đề hạn hán

Cây lúa (Oryza sativa) là một trong những cây lương thực quan trọng nhất trên thế giới, đặc biệt ở các quốc gia châu Á như Việt Nam. Tuy nhiên, hạn hán đang trở thành một thách thức lớn đối với sản xuất lúa gạo do biến đổi khí hậu. Hạn hán không chỉ làm giảm năng suất mà còn ảnh hưởng đến chất lượng hạt lúa. Nghiên cứu lúa chịu hạn là một hướng đi quan trọng để đảm bảo an ninh lương thực. Lúa chuyển gen mang các gen chịu hạn như gen NAC đang được tập trung nghiên cứu để tạo ra các giống lúa có khả năng thích ứng tốt hơn với điều kiện khắc nghiệt.

1.1. Đặc điểm sinh học của cây lúa

Cây lúa thuộc chi Oryza, với hai loài phụ chính là Indica và Japonica. Lúa Indica phổ biến ở vùng nhiệt đới như Việt Nam, trong khi Japonica thường được trồng ở vùng ôn đới. Cây lúa có thời gian sinh trưởng từ 90 đến 180 ngày, tùy thuộc vào giống và điều kiện môi trường. Các giai đoạn sinh trưởng chính bao gồm sinh dưỡng, sinh sản và chín. Hạn hán ảnh hưởng nghiêm trọng đến giai đoạn sinh sản, làm giảm năng suất hạt.

1.2. Ảnh hưởng của hạn hán đến cây lúa

Hạn hán gây ra sự mất nước trong tế bào, làm giảm quá trình quang hợp và tích lũy chất khô. Điều này dẫn đến sự suy giảm năng suất và chất lượng hạt lúa. Cây trồng chịu hạn là giải pháp quan trọng để giảm thiểu thiệt hại. Nghiên cứu lúa chịu hạn tập trung vào việc tìm kiếm các gen liên quan đến khả năng chịu hạn, trong đó gen NAC đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa các phản ứng stress.

II. Vai trò của gen NAC trong cây lúa chịu hạn

Gen NAC là một nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã đặc trưng ở thực vật, liên quan đến nhiều quá trình sinh lý, bao gồm đáp ứng với stress phi sinh học như hạn hán. Gen NAC điều hòa biểu hiện của các gen chức năng, giúp cây lúa tăng cường khả năng chịu hạn. Nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen NAC đã chứng minh rằng các dòng lúa mang gen NAC có khả năng chịu hạn tốt hơn so với các dòng không chuyển gen.

2.1. Cơ chế hoạt động của gen NAC

Gen NAC tham gia vào quá trình điều hòa phiên mã của các gen đáp ứng stress. Chúng hoạt động như các yếu tố phiên mã, liên kết với các trình tự DNA đặc hiệu để kích hoạt hoặc ức chế biểu hiện gen. Nhân tố phiên mã NAC như OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 đã được chứng minh là có vai trò quan trọng trong việc tăng cường khả năng chịu hạn của cây lúa.

2.2. Ứng dụng của gen NAC trong tạo giống lúa chịu hạn

Công nghệ sinh học đã mở ra cơ hội mới trong việc tạo ra các giống lúa chịu hạn thông qua kỹ thuật di truyền. Lúa biến đổi gen mang các gen NAC như OsNAC1 đã được tạo ra và thử nghiệm, cho thấy khả năng chịu hạn vượt trội so với các giống lúa truyền thống. Đây là một bước tiến quan trọng trong nông nghiệp bền vững, giúp đảm bảo năng suất lúa trong điều kiện biến đổi khí hậu.

III. Phương pháp nghiên cứu và kết quả

Nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen NAC đã sử dụng các phương pháp hiện đại như kỹ thuật di truyềncông nghệ sinh học để phân lập và chuyển gen NAC vào cây lúa. Các vector biểu hiện gen được thiết kế để điều khiển biểu hiện của gen NAC dưới sự kiểm soát của các promoter cảm ứng stress. Kết quả nghiên cứu đã tạo ra các dòng lúa chuyển gen có khả năng chịu hạn tốt hơn, đồng thời duy trì năng suất trong điều kiện bình thường.

3.1. Phân lập và thiết kế vector biểu hiện gen NAC

Các gen NAC như OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 đã được phân lập từ giống lúa Việt Nam. Các vector biểu hiện gen được thiết kế với các promoter cảm ứng stress như Lip9 và Rd29A, cũng như các promoter hoạt động liên tục như Ubiquitin và 35S. Kỹ thuật di truyền đã được sử dụng để chuyển các vector này vào cây lúa, tạo ra các dòng lúa chuyển gen.

3.2. Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen

Các dòng lúa chuyển gen đã được đánh giá về khả năng chịu hạn thông qua các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa. Kết quả cho thấy các dòng lúa mang gen NAC có khả năng chịu hạn tốt hơn, với tỷ lệ sống sót cao hơn và sự tích lũy proline tăng lên trong điều kiện hạn. Điều này chứng tỏ tiềm năng ứng dụng của gen NAC trong việc tạo ra các giống lúa chịu hạn hiệu quả.

21/02/2025

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: TONG QUAN 1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CAY LUA 1. Đặc điểm sinh học của cây lúa Oryza sativa Lúa Oryza sativa thuộc bộ Hòa thảo (Graminales), ho Hòa thảo (Graminaceae), chi Oryza. Chi Oryza phân bố rộng trên thé giới, trong đó có 23 loài hoang đã và 2 loài lúa trồng (O.

Loài Oryza sativa L. (2n = 24) được trồng phổ biến trên thế giới, tập trung chủ yếu ởcác quốc gia châu A. Dựa vào đặc điểm hình thái, Kato và cộng sự (1928) đã đề nghị phân chia lúa Oryza sativa L. thành 2 loài phụ là Oryza sativa L.

indica (lúa Indica) va Oryza sativa L. Lua Indica thường phân bồ ở vĩ độ thấp như An Độ, Việt Nam, Indonexia. cây cao, lá nhỏ xanh nhạt, bông xòe, hạt dài, vỏ trau mỏng, com khô, nở nhiéu,. Lúa Japonica thường phân bố ở vĩ độ cao như: Nhật Bản, Bắc Trung Quốc, châu Âu.

cây thấp, lá to xanh đậm, bông chum, hạt ngăn, vỏ trau day, cơm dẻo, ít nở. Lúa có kiểu hình đa dạng, được trồng ở cả hệ sinh thái vùng cao và vùng thấp. Tuy nhiên, khoảng 76% sản lượng gạo toàn cầu được sản xuất từ lúa nước ở hệ sinh thái vùng đất trũng. Tiềm năng năng suất lúa được hình thành/xác định trong giai đoạn sinh dưỡng.

Chiều cao cây, khả năng đẻ nhánh (liên quan đến số lượng bông), sự phát triển của rễ, diện tích lá là những đặc điểm chính của giai đoạn sinh trưởng. Kích thước và hình thái bông được quyết định trong giai đoạn sinh sản, trong khi kích thước hoặc khối lượng của hạt được quyết định trong giai đoạn chín. Giai đoạn sinh sản được xác định là giai đoạn cây lúa nhạy cảm nhất với stress sinh học và phi sinh học, ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất hạt sau này [71]. Thời gian sinh trưởng của cây lúa được tính từ lúc nảy mầm cho đến khi chin, đao động từ 90 - 180 ngày tùy theo giống và điều kiện ngoại cảnh.

Trong canh 13 tác lúa hiện đại, thời gian sinh trưởng của các giống lúa được các nhà nông học quan tâm đặc biệt do liên quan trực tiếp đến năng suất và cơ cấu thời vụ, luân canh. Giống lúa có thời gian sinh trưởng quá ngắn hoặc quá dài có năng suất thấp do sinh trưởng dinh dưỡng bị hạn chế (đối với giống lúa có thời gian sinh trưởng quá ngắn), dễ bị lốp đồ và chịu nhiều tác động bat lợi của điều kiện ngoại cảnh (đối với giỗng lúa có thời gian sinh trưởng quá dài). Ngược lại, các giống có thời gian sinh trưởng trung bình trong khoảng 120 - 135 ngày có khả năng cho năng suất cao hơn nhiều. Giống lúa sinh trưởng dai ngày tạo ra lượng chất khô lớn nhưng tỷ lệ hạt/rơm ra thấp, riêng các giống lúa có thời gian sinh trưởng từ 130 - 150 ngày, ty lệ hạt/rơm ra đạt cao nhất [78].

Đẻ nhánh là tính trạng số lượng, có hệ số di truyền thấp cho đến trung bình và chịu ảnh hưởng rõ rệt của điều kiện ngoại cảnh. Trong quá trình sinh trưởng, nhánh lúa được hình thành từ các mầm trên thân. Các giống lúa khác nhau có thời gian đẻ nhánh khác nhau. Khả năng đẻ nhánh có ý nghĩa đáng kể đối với năng suất sau này của cây lúa [69].

Chiều cao cây lúa cũng là một chỉ tiêu hình thái có liên quan đến một số chỉ tiêu sinh trưởng khác, đặc biệt là khả năng chống đồ của cây lúa. Các nhà khoa học ở Viện nghiên cứu lúa quốc tế IRRI đã chứng minh các giống lúa lùn có nguồn gốc từ Trung Quốc mang gen lùn là gen lặn không ảnh hưởng đến chiều dài bông lúa, có ý nghĩa rat quan trọng trong công tác chọn tạo giống [69]. Anh hướng của hạn hán đối với ngành sản xuất lúa gạo Lúa gạo là cây lương thực chính của người dân châu Á. Mặc dù năng suất lúa gạo đã tăng lên theo thời gian sau cuộc cách mạng xanh.

Những năm gần đây, do tác động của biến đổi khí hậu đặc biệt là hạn hán thường xuyên xảy ra làm ảnh hưởng không nhỏ đến sự tăng năng suất lúa gạo. Ít nhất 23 triệu ha trồng lúa (20% tổng diện tích trồng lúa) ở châu Á chịu ảnh hưởng của hạn hán [105]. Hạn hán đã gây ra sự thiếu hụt lương thực ở nhiều mức độ khác nhau, dẫn đến nạn đói xảy ra 0 các khu vực khác nhau của châu A và châu Phi. Ở An Độ, hạn hán những năm 14 1918, 1957 - 1958 và 1965 đã dẫn đến nạn đói trong thế kỷ XX [46].

Hạn hán năm 1987 đã ảnh hưởng đến gần 60% tổng diện tích trồng trọt và 285 triệu người trên khắp Án Độ [132]. Tương tự, khu vực bị ảnh hưởng hạn hán hàng năm trung bình ở Trung Quốc trong giai đoạn 1978 - 2003 được ước tinh là 14 triệu ha và chi phí kinh tế trực tiếp xử lý hạn hán chiếm khoảng 0,5% - 3,3% GDP của ngành nông nghiệp Trung Quốc. Ở Thái Lan, hạn hán năm 2004 ước tính đã ảnh hưởng đến 2 triệu ha diện tích trồng và hơn 8 triệu người [22]. Mới đây, Bộ Nông nghiệp My đã công bố số liệu cho thay, lượng gạo tồn kho tại ba quốc gia xuất khâu gạo hàng đầu thé giới là Thái Lan, An Độ và Việt Nam sẽ giảm xuống còn khoảng 19 triệu tấn vào cuối năm 2016.

Đây là mức giảm lớn nhất ké từ năm 2003 trở lại đây. Việc nguồn cung không được đảm bảo sẽ tác động đến an ninh lương thực của 7,2 tỷ người trên thế giới. Gánh nặng này càng tăng nếu dân số thế giới tăng lên 9,6 tỷ người vào năm 2050. Điều này đồng nghĩa với việc sản xuất nông nghiệp cần phải tăng 70% dé đáp ứng nhu cầu thực phẩm của người dân.

Liên hợp quốc cảnh báo, nếu nguồn cung lương thực không được đảm bảo, thế giới sẽ có thêm 60 triệu người nữa bị thiếu ăn cùng với gần 1 tỷ người suy dinh dưỡng vào năm 2020 [162]. Việt Nam là một trong số các quốc gia bi tac động nặng nề nhất bởi biến đổi khí hậu. Sự xuất hiện thường xuyên của hạn hán tiếp tục đe dọa nghiêm trọng đến nền sản xuất lúa gạo trong nước [134]. Theo dự báo của FAO, do tác động của hạn hán, sản lượng lúa gạo hai vụ xuân và vụ mùa trên khắp cả nước, đặc biệt là vùng đồng bằng sông Hồng sẽ có xu hướng giảm dan, có thé giảm tới 12,5% vào năm 2050 và 16,5% vào năm 2070.

Hệ quả của các tác động này là áp lực ngày càng tăng đối với giá lúa gạo trên thị trường thế giới do Việt Nam là một trong những nước xuất khẩu gạo quan trọng nhất trên thế giới. Chính vì vậy, các chính sách tăng trưởng xanh và toàn diện trong ngành nông nghiệp dé đối phó với hạn hán phải được chính phủ xem là vấn đề trọng tâm cần giải quyết và cần có sự tham gia của tất cả các thành phần trong xã hội [163]. Ảnh hướng của hạn tới cây lúa Cây lúa đòi hỏi lượng nước lớn hơn rất nhiều so với các cây trồng khác trong suốt chu kỳ sống. Trung bình dé sản xuất 1 kg hạt lúa cần 3.000 lít nước, trong khi dé sản xuất 1 kg hạt lúa mỳ hoặc ngô thì lượng nước chỉ cần khoảng 1⁄2.

Chính vi vậy, hạn hán luôn là mối đe dọa nghiêm trọng đối với nền sản xuất lúa gạo. Hạn ảnh hưởng tiêu cực đến cây lúa ở tất cả các đặc điểm, bao gồm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân tử. Qua đó, hạn ảnh hưởng tới năng suất cây lúa [144]. Ảnh hướng của hạn tới đặc điểm hình thái Cây lúa khi tiếp xúc với hạn bị giảm khả năng hấp thu nước ở rễ, đồng thời tăng tỷ lệ thoát hơi nước, dẫn tới suy giảm quá trình sinh trưởng, phát triển và cuối cùng là giảm năng suất.

Khi hạn xảy ra, cây lúa phản ứng bằng cách làm chậm hoặc ngừng sinh trưởng. Đây là phản ứng bình thường giúp cây lúa giảm sự mat nước, đóng vai trò như một cơ chế sông sót. Khi đó, cây lúa có những thay đổi hình thái linh hoạt nhằm giảm thiểu sự mat nước, đồng thời duy trì lượng nước hap thụ vào cơ thé. Ở mức độ hình thái, lá và rễ là hai cơ quan bị ảnh hưởng nặng nề nhất và cả hai cơ quan này đều có vai trò quan trọng đối với khả năng thích nghi điều kiện hạn của cây lúa.

Chính vì vậy, sự biến đồi kiểu hình trong điều kiện hạn của cây lúa thể hiện rõ nhất ở hai bộ phận này. Lá dong đóng vai trò quan trọng duy trì sự tong hợp và vận chuyền sản phẩm quang hợp trong điều kiện hạn ở cây lúa. Dưới điều kiện hạn, năng suất và đặc điểm lá đòng có mỗi tương quan dương. Chính vì vậy, các đặc điểm như diện tích, hàm lượng nước tương đối, hàm lượng chlorophyll,.

của lá dong được đề xuất trong chọn tạo giống lúa chống chịu hạn [39]. Cuốn lá là một trong những đáp ứng ở cây lúa trong điều kiện hạn. Nếu sức trương tế bào duy trì đưới điều kiện thiếu nước thì độ cuốn lá diễn ra chậm. Tuy nhiên, dưới điều kiện thiếu nước nghiêm trọng, độ cuốn lá tăng, dẫn đến ngăn ngừa sự thoát hơi nước và mất nước, giúp duy trì thế nước trong tế bào.

Do đó, cuốn lá là một phản ứng thích nghi của cây lúa dưới điều 16 kiện thiếu nước và độ cuốn lá cũng được sử dụng như một tiêu chí đánh giá khả năng chịu hạn ở cây lúa [58, 118]. Bộ rễ giữ vai trò quan trọng trong việc đáp ứng với điều kiện hạn ở cây lúa. Bộ rễ hút nước, hấp thụ dinh dưỡng từ đất [115]. Dưới điều kiện hạn, đặc điểm cấu trúc và mức độ phát triển của bộ rễ là yếu tố quyết định giúp duy trì năng suất lúa.

Trong điều kiện thiếu nước nhẹ, sự phát triển hệ rễ được ưu tiên, trong khi sự phát triển chồi bị ức chế. Điều này là do sự thiết lập, điều chỉnh lại gradient thế nước thông qua việc điều chỉnh thâm thấu và nới lỏng thành tế bào, giúp rễ vẫn phát triển tăng trưởng trong điều kiện thế nước thấp, trong khi cơ chế này không được điều hòa ở lá [65]. Đồng thời, rễ ăn sâu tăng cả về chiều dài và khối lượng hoặc cuộn lại với nhau đâm sâu dưới tầng đất giúp tăng cường khả năng hút nước. Ở các giống lúa chịu hạn thì chiều dài rễ, trọng lượng khô của rễ/cây ở các giống chịu hạn cao hơn rất nhiều giỗng đối chứng.

Như vậy, khối lượng khô và chiều dài của rễ là một tiêu chí tốt đánh giá tiềm năng năng suất dưới điều kiện hạn [48].

Nội dung được bảo vệ bản quyền — Tải xuống đầy đủ

Nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen NAC chịu hạn hiệu quả là một tài liệu quan trọng trong lĩnh vực nông nghiệp, tập trung vào việc phát triển các giống lúa có khả năng chịu hạn nhờ công nghệ chuyển gen NAC. Nghiên cứu này không chỉ mang lại giải pháp bền vững cho nông dân trồng lúa trong điều kiện khí hậu khắc nghiệt mà còn góp phần nâng cao năng suất và đảm bảo an ninh lương thực. Đây là bước tiến đáng kể trong việc ứng dụng công nghệ sinh học vào thực tiễn sản xuất nông nghiệp.

Để hiểu rõ hơn về các biện pháp kỹ thuật canh tác bền vững, bạn có thể tham khảo Luận văn thạc sĩ nông nghiệp điều tra nghiên cứu biện pháp kỹ thuật tổng hợp trong canh tác hồ tiêu piper nigrum l theo hướng bền vững tại đăk lăk. Ngoài ra, nếu quan tâm đến các nghiên cứu về cải thiện năng suất cây trồng, Luận án tiến sĩ nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật bón phân cho cà phê vối coffea canephora pierre giai đoạn kinh doanh trên đất bazan tại đắk lắk sẽ cung cấp thêm thông tin hữu ích. Cuối cùng, để mở rộng kiến thức về ứng dụng công nghệ trong nông nghiệp, Luận án ts quyết định lựa chọn sản xuất chè theo tiêu chuẩn thực hành nông nghiệp tốt của hộ nông dân tại vùng trung du miền núi phía bắc là một tài liệu đáng đọc.

Mỗi liên kết trên là cơ hội để bạn khám phá sâu hơn về các chủ đề liên quan, từ đó nâng cao hiểu biết và ứng dụng vào thực tiễn.