Luận án tiến sĩ sinh học: Nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen NAC liên quan đến tính chịu hạn

• Tác giả: Phạm Thu Hằng
• Người hướng dẫn: PGS. Phạm Xuân Hội
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Hóa sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen NAC chịu hạn hiệu quả
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TONG QUAN
• 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CAY LUA
• 1.2. Đặc điểm sinh học của cây lúa Oryza sativa
• 1.3. Ảnh hưởng của hạn hán đối với ngành sản xuất lúa gạo
• 1.4. Vai trò của nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng stress hạn ở thực vật
• 1.4.1. Nhân tố phiên mã NAC và vai trò đáp ứng stress hạn ở thực vật
• 1.5. Agrobacterium tumefaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật
• 1.5.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn A.
• 1.5.2. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A.
• 1.5.3. Hệ thống vector/promoter dùng trong chuyển gen thực vật
• 1.6. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chống chịu hạn
• 1.6.1. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chống chịu hạn trên thế giới
• 1.6.2. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Chủng vi sinh vật
• 2.3. Vector và oligonucleotide
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Xử lý mẫu thực vật
• 2.4.2. Tách chiết, định lượng DNA/RNA
• 2.4.3. Nhân dòng gen OsNACI, OsNAC5 và OsNACT0 vào vector pGEM-T
• 2.4.4. Thiết kế cấu trúc biểu hiện gen OsNACI trong tế bào thực vật
• 2.4.5. Tạo cây lúa chuyển gen biểu hiện OsWAC1
• 2.4.6. Sàng lọc các dòng lúa chuyển gen
• 2.4.7. Các phương pháp định lượng sinh lý, sinh hóa ở cây lúa
• 2.4.8. Phương pháp xử lý số liệu thống kê
• 3. CHƯƠNG 3: KET QUA NGHIÊN CỨU & THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan đến tính chịu hạn ở lúa
• 3.1.1. Khảo sát khả năng chịu hạn của một số giống lúa Việt Nam
• 3.1.2. Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tới tính chịu hạn
• 3.2. Phân tích biểu hiện của OsNACI, OsNAC5 và OsNACT0 trong điều kiện hạn
• 3.3. Thiết kế vector biểu hiện OsNACI trong tế bào thực vật
• 3.4. Nghiên cứu chuyển gen OsNACT vào cây lúa
• 3.4.1. Biến nạp vector biểu hiện vào A.
• 3.4.2. Nghiên cứu chuyển gen OsNACI vào lúa
• 3.4.3. Sàng lọc các dòng lúa tái sinh được chuyển cấu trúc biểu hiện
• 3.4.4. Chọn lọc dòng lúa chuyển gen
• 3.5. Đánh giá sinh trưởng phát triển và khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

I. Giới thiệu chung về cây lúa và vấn đề hạn hán

Cây lúa (Oryza sativa) là một trong những cây lương thực quan trọng nhất trên thế giới, đặc biệt ở các quốc gia châu Á như Việt Nam. Tuy nhiên, hạn hán đang trở thành một thách thức lớn đối với sản xuất lúa gạo do biến đổi khí hậu. Hạn hán không chỉ làm giảm năng suất mà còn ảnh hưởng đến chất lượng hạt lúa. Nghiên cứu lúa chịu hạn là một hướng đi quan trọng để đảm bảo an ninh lương thực. Lúa chuyển gen mang các gen chịu hạn như gen NAC đang được tập trung nghiên cứu để tạo ra các giống lúa có khả năng thích ứng tốt hơn với điều kiện khắc nghiệt.

1.1. Đặc điểm sinh học của cây lúa

Cây lúa thuộc chi Oryza, với hai loài phụ chính là Indica và Japonica. Lúa Indica phổ biến ở vùng nhiệt đới như Việt Nam, trong khi Japonica thường được trồng ở vùng ôn đới. Cây lúa có thời gian sinh trưởng từ 90 đến 180 ngày, tùy thuộc vào giống và điều kiện môi trường. Các giai đoạn sinh trưởng chính bao gồm sinh dưỡng, sinh sản và chín. Hạn hán ảnh hưởng nghiêm trọng đến giai đoạn sinh sản, làm giảm năng suất hạt.

1.2. Ảnh hưởng của hạn hán đến cây lúa

Hạn hán gây ra sự mất nước trong tế bào, làm giảm quá trình quang hợp và tích lũy chất khô. Điều này dẫn đến sự suy giảm năng suất và chất lượng hạt lúa. Cây trồng chịu hạn là giải pháp quan trọng để giảm thiểu thiệt hại. Nghiên cứu lúa chịu hạn tập trung vào việc tìm kiếm các gen liên quan đến khả năng chịu hạn, trong đó gen NAC đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa các phản ứng stress.

II. Vai trò của gen NAC trong cây lúa chịu hạn

Gen NAC là một nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã đặc trưng ở thực vật, liên quan đến nhiều quá trình sinh lý, bao gồm đáp ứng với stress phi sinh học như hạn hán. Gen NAC điều hòa biểu hiện của các gen chức năng, giúp cây lúa tăng cường khả năng chịu hạn. Nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen NAC đã chứng minh rằng các dòng lúa mang gen NAC có khả năng chịu hạn tốt hơn so với các dòng không chuyển gen.

2.1. Cơ chế hoạt động của gen NAC

Gen NAC tham gia vào quá trình điều hòa phiên mã của các gen đáp ứng stress. Chúng hoạt động như các yếu tố phiên mã, liên kết với các trình tự DNA đặc hiệu để kích hoạt hoặc ức chế biểu hiện gen. Nhân tố phiên mã NAC như OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 đã được chứng minh là có vai trò quan trọng trong việc tăng cường khả năng chịu hạn của cây lúa.

2.2. Ứng dụng của gen NAC trong tạo giống lúa chịu hạn

Công nghệ sinh học đã mở ra cơ hội mới trong việc tạo ra các giống lúa chịu hạn thông qua kỹ thuật di truyền. Lúa biến đổi gen mang các gen NAC như OsNAC1 đã được tạo ra và thử nghiệm, cho thấy khả năng chịu hạn vượt trội so với các giống lúa truyền thống. Đây là một bước tiến quan trọng trong nông nghiệp bền vững, giúp đảm bảo năng suất lúa trong điều kiện biến đổi khí hậu.

III. Phương pháp nghiên cứu và kết quả

Nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen NAC đã sử dụng các phương pháp hiện đại như kỹ thuật di truyền và công nghệ sinh học để phân lập và chuyển gen NAC vào cây lúa. Các vector biểu hiện gen được thiết kế để điều khiển biểu hiện của gen NAC dưới sự kiểm soát của các promoter cảm ứng stress. Kết quả nghiên cứu đã tạo ra các dòng lúa chuyển gen có khả năng chịu hạn tốt hơn, đồng thời duy trì năng suất trong điều kiện bình thường.

3.1. Phân lập và thiết kế vector biểu hiện gen NAC

Các gen NAC như OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 đã được phân lập từ giống lúa Việt Nam. Các vector biểu hiện gen được thiết kế với các promoter cảm ứng stress như Lip9 và Rd29A, cũng như các promoter hoạt động liên tục như Ubiquitin và 35S. Kỹ thuật di truyền đã được sử dụng để chuyển các vector này vào cây lúa, tạo ra các dòng lúa chuyển gen.

3.2. Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen

Các dòng lúa chuyển gen đã được đánh giá về khả năng chịu hạn thông qua các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa. Kết quả cho thấy các dòng lúa mang gen NAC có khả năng chịu hạn tốt hơn, với tỷ lệ sống sót cao hơn và sự tích lũy proline tăng lên trong điều kiện hạn. Điều này chứng tỏ tiềm năng ứng dụng của gen NAC trong việc tạo ra các giống lúa chịu hạn hiệu quả.