Tổng quan luận án

Tình trạng hạn hán ngày càng gia tăng dưới tác động của biến đổi khí hậu toàn cầu, gây sụt giảm nghiêm trọng năng suất và sản lượng cây lương thực, đặc biệt là cây lúa (Oryza sativa L.) – nguồn lương thực chính chiếm 60% tổng sản lượng lương thực quốc gia và canh tác trên diện tích xấp xỉ 3,8 triệu ha tại Việt Nam. Trong khi đó, các phương pháp chọn tạo giống truyền thống đang dần đạt ngưỡng bão hòa về năng suất và gặp hạn chế đối với các tính trạng đa gen phức tạp như tính chịu hạn. Tính trạng chịu hạn liên quan chặt chẽ đến quá trình điều hòa phiên mã của các gen chức năng. Mặc dù các nhân tố phiên mã (Transcription Factors - TF) không trực tiếp thực hiện chức năng sinh hóa bảo vệ tế bào, chúng đóng vai trò chỉ huy mạng lưới kích hoạt hàng loạt gen đáp ứng stress. Trong số các họ nhân tố phiên mã ở thực vật, họ NAC (NAM/ATAF1/2/CUC2) là một trong những họ lớn nhất và đặc thù nhất, chi phối nhiều đáp ứng sinh lý, sinh hóa và chống chịu bất lợi phi sinh học. Luận án giải quyết khoảng trống nghiên cứu về việc khai thác nguồn gen bản địa của Việt Nam nhằm phân lập, thiết kế cấu trúc vector mang các promoter đặc hiệu (bao gồm promoter cảm ứng stress) và tạo các dòng lúa chuyển gen chịu hạn ổn định về mặt di truyền mà không làm suy giảm các chỉ tiêu nông sinh học trong điều kiện bình thường.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 2 mục tiêu cụ thể:

  1. Phân lập, thiết kế vector chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tính chịu hạn từ giống lúa Việt Nam.
  2. Tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã thuộc nhóm NAC có khả năng chống chịu hạn.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Các gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC (OsNAC1, OsNAC5, OsNAC10) phân lập từ giống lúa địa phương Việt Nam (giống lúa Tẻ Đỏ) và các dòng lúa chuyển gen mang cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1.
  • Phạm vi không gian: Nghiên cứu thực nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Bệnh học Phân tử và Phòng Thí nghiệm Việt – Pháp thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam), kết hợp với Phòng Thí nghiệm tương tác cây trồng - vi sinh vật thuộc Trung tâm Nghiên cứu vì sự Phát triển (IRD) tại Montpellier, Cộng hòa Pháp.
  • Phạm vi thời gian và nội dung: Đánh giá vật liệu và các thế hệ cây chuyển gen từ $T_0$, $T_1$ đến $T_2$ trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới, hoàn thành và bảo vệ năm 2018.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng quan hệ thống các công trình nghiên cứu về phân loại học, cơ sở sinh lý, hóa sinh và di truyền phân tử của cây lúa trong điều kiện thiếu nước:

  • Về phân loại học và sinh học cây lúa: Tác giả dẫn chứng nghiên cứu của Kato và cộng sự (1928) về phân chia loài lúa Oryza sativa thành hai loài phụ indica và japonica; các nghiên cứu của IRRI (1981, 2002) về thang đánh giá khả năng chịu hạn và đặc điểm hình thái rễ, lá đòng liên quan đến năng suất dưới điều kiện hạn.
  • Về đáp ứng sinh lý và hóa sinh của thực vật dưới stress hạn: Luận án điểm lại phát hiện đầu tiên về sự tích lũy proline tự do của Kemble và Mac-Pherson (1954) trên cỏ lúa mạch đen; phương pháp định lượng proline của Bates (1973); nghiên cứu của Iyer và cộng sự (1998) về vai trò của chất trung gian dị hóa proline P5C trong việc hoạt hóa gen thẩm thấu dhn4; các nghiên cứu của Sharma và cộng sự (2012), Gill và Tuteja (2014) về cơ chế sinh độc tính oxy hóa của các gốc oxy hoạt hóa (ROS) và mạng lưới enzyme chống oxy hóa (SOD, CAT, POD, APX, GR) cùng các chất chống oxy hóa phi enzyme (ascorbic acid, glutathione, carotenoid, $\alpha$-tocopherol); các nghiên cứu của Yang và cộng sự (2014) về sự suy giảm huỳnh quang diệp lục $F_v/F_m$ và hàm lượng chất diệp lục.
  • Về mạng lưới nhân tố phiên mã đáp ứng stress: Luận án hệ thống hóa các họ nhân tố phiên mã chính gồm AP2/ERF (nghiên cứu của Dubouzet và cs., 2003; Sakuma và cs., 2002; Datta và cs., 2012), WRKY (nghiên cứu của Wu và cs., 2004; Qiu và cs., 2008), bZIP (nghiên cứu của Jakoby và cs., 2002; Lu và cs., 2012), MYB (nghiên cứu của Chen và cs., 2005 về BcMYB1; Seo và Park, 2009 về MYB96).
  • Về nhân tố phiên mã họ NAC: Aida và cộng sự (1997) lần đầu phát hiện gen thuộc họ NAC; Ooka và cộng sự (2003) phân tích hệ thống họ gen NAC ở lúa; Ernst và cộng sự (2004) xác định cấu trúc không gian ba chiều domain NAC bảo thủ; Hu và cộng sự (2006, 2008) chứng minh vai trò chịu hạn và mặn của SNAC1/OsNAC9 và SNAC2/OsNAC6; Jeong và cộng sự (2010) chuyển gen OsNAC10 dưới sự điều khiển của promoter đặc hiệu rễ (RCc3) giúp tăng năng suất lúa trong điều kiện hạn ngoài đồng ruộng; Takasaki và cộng sự (2010) phân tích chức năng gen OsNAC5.
  • Về kỹ thuật chuyển gen và tình hình nghiên cứu tại Việt Nam: Hiei và cộng sự (1994) thiết lập hệ thống chuyển gen qua Agrobacterium tumefaciens; Christensen và cộng sự (1992), Cornejo và cộng sự (1993) nghiên cứu promoter Ubiquitin ngô; Yamaguchi-Shinozaki và Shinozaki (1993, 1994) nghiên cứu promoter cảm ứng Rd29A; các tác giả trong nước như Đinh Thị Phòng (2001), Cao Lệ Quyên, Trần Tuấn Tú và Phạm Xuân Hội (2009, 2017), Lê Thị Thu Hiền và cs. (2007), Huỳnh Thị Thu Huệ và cs. (2011), Phạm Xuân Hội và Nguyễn Duy Phương (2012, 2014), Hoàng Thị Giang và cs. (2015), Nguyễn Thị Nhã và cs. (2014), Trần Thị Hương Sen và cs. (2017).

Khoảng trống nghiên cứu được luận án tập trung giải quyết: Mặc dù các gen NAC đã được quan tâm nghiên cứu trên thế giới, phần lớn công trình sử dụng promoter biểu hiện liên tục mạnh (CaMV 35S hoặc Ubiquitin), đôi khi dẫn đến các biến đổi bất lợi về hình thái hoặc tiêu tốn năng lượng không cần thiết trong điều kiện sinh trưởng bình thường. Luận án lựa chọn khai thác nguồn gen bản địa từ giống lúa chịu hạn của Việt Nam (lúa Tẻ Đỏ), tiến hành phân lập đồng thời 3 gen OsNAC1, OsNAC5, OsNAC10, và tập trung thiết kế các cấu trúc chuyển gen OsNAC1 dưới sự điều hòa của cả promoter liên tục (Ubiquitin, 35S) và promoter cảm ứng stress hạn (Lip9, Rd29A), từ đó so sánh và tuyển chọn các dòng lúa chuyển gen thế hệ $T_2$ mang đơn bản sao đồng hợp tử có khả năng chống chịu hạn mà vẫn duy trì sinh trưởng ổn định.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

  • Mô hình điều hòa phiên mã chống chịu stress ở thực vật thông qua hai con đường chính: phụ thuộc ABA và không phụ thuộc ABA.
  • Cấu trúc phân tử của protein nhân tố phiên mã NAC: Domain NAC bảo thủ ở đầu N gồm khoảng 150–160 axit amin, chia thành 5 tiểu vùng chức năng (A, B, C, D, E). Vùng C và D tích điện dương chịu trách nhiệm liên kết phân tử DNA tại các trình tự nhận biết đặc hiệu NACRS; vùng A tham gia dimer hóa; vùng B và E tạo nên tính đa dạng chức năng. Đầu C chứa vùng điều hòa phiên mã (Transcription Regulatory Region - TRR) có tính biến động cao.
  • Cơ sở chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: Sử dụng hệ thống vector nhị thể (binary vector) mang vùng T-DNA chứa gen chỉ thị chọn lọc kháng kháng sinh Hygromycin (hptII) và cassette biểu hiện gen đích OsNAC1.

Phương pháp nghiên cứu

  • Vật liệu thực vật và vi sinh vật:
    • Nguồn gen: 11 giống lúa do Trung tâm Tài nguyên Thực vật (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) cung cấp gồm: Lúa Tẻ đỏ, Pêđớ, Khẩu le, Blue xa, Lốc nghệ, Lúa ngoi, Lúa lốc đỏ, Nếp khau Pi Pọt, Lúa té nương, Chành trụi và giống đối chứng IR64.
    • Chủng vi sinh vật: Escherichia coli chủng DH5$\alpha$; Agrobacterium tumefaciens chủng EHA105.
    • Vector: Vector tách dòng pGEM-T Easy; các vector chuyển gen thực vật pBI101, pCAMBIA1301; các cấu trúc mang promoter Ubiquitin, CaMV 35S, Lip9, Rd29A.
  • Phương pháp sinh học phân tử:
    • Tách chiết RNA tổng số bằng TRIzol; xử lý mẫu với DNase I; tổng hợp cDNA sợi đơn bằng enzyme phiên mã ngược.
    • Khuếch đại gen bằng PCR với các cặp mồi đặc hiệu; dòng hóa sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy; biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5$\alpha$; sàng lọc khuẩn lạc bằng PCR và cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn (EcoRI, BamHI, KpnI, XbaI, SacI).
    • Xác định trình tự nucleotide bằng máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3100; so sánh trình tự với cơ sở dữ liệu GenBank (mã số truy cập OsNAC1: AY596808.1; OsNAC5: AB028184.1; OsNAC10: AK069257.1).
    • Thiết kế 4 vector biểu hiện: pBI-Ubi/OsNAC1, pBI-35S/OsNAC1, pCAM-Lip9/OsNAC1, pCAM-Rd29A/OsNAC1.
  • Phương pháp chuyển gen và tái sinh mô thực vật:
    • Tạo mô sẹo (callus) từ phôi hạt lúa chín trên môi trường NB-IND (bổ sung 2,4-D 2,5 mg/l).
    • Đồng nuôi cấy callus với vi khuẩn A. tumefaciens mang cấu trúc tái tổ hợp trên môi trường R2-CS (bổ sung Acetosyringone 100 $\mu$M).
    • Chọn lọc callus chuyển gen trên môi trường NB-S chứa Hygromycin (50 mg/l), Cefotaxime (400 mg/l) và Vancomycin (100 mg/l).
    • Tái sinh chồi trên môi trường PRN-S và RN (chứa BAP, NAA, kinetin), ra rễ trên môi trường R và huấn luyện cây con trong nhà lưới.
  • Phương pháp phân tích di truyền phân tử:
    • Tách chiết DNA tổng số từ lá lúa bằng phương pháp CTAB cải tiến.
    • Kiểm tra sự có mặt của chuyển gen ở các thế hệ $T_0$, $T_1$, $T_2$ bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu của gen chọn lọc Hyg và gen chỉ thị nội sinh Actin.
    • Phân tích mức độ biểu hiện gen bằng RT-PCR và định lượng Real-time qRT-PCR sử dụng chất nhuộm huỳnh quang SYBR Green.
    • Xác định số lượng bản sao chuyển gen (copy number) và phân tích trạng thái hợp tử (zygosity: đồng hợp tử AA, dị hợp tử Aa) ở thế hệ phân ly bằng phương pháp $2^{-\Delta\Delta C_t}$ dựa trên gen tham chiếu nội sinh đơn bản sao REF#3.
  • Phương pháp đánh giá sinh lý, sinh hóa và hình thái:
    • Đánh giá khả năng chịu hạn: Xử lý ngừng tưới nước nhân tạo liên tục trong 2 tuần ở giai đoạn đẻ nhánh trong điều kiện nhà lưới; theo dõi khả năng phục hồi sau 7 ngày cấp nước trở lại.
    • Đánh giá mức độ cuốn lá theo thang điểm 9 cấp của IRRI (2002).
    • Đo hàm lượng nước tương đối (Relative Water Content - RWC) của lá.
    • Định lượng hàm lượng diệp lục a, diệp lục b và diệp lục tổng số bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 663 nm và 645 nm.
    • Định lượng hàm lượng proline tự do theo phương pháp so màu với thuốc thử acid ninhydrin ở bước sóng 520 nm (Bates et al., 1973).
    • Xác định sự tích tụ hydro peroxide ($H_2O_2$) trong mô lá bằng kỹ thuật nhuộm 3,3'-diaminobenzidine (DAB).
  • Phương pháp xử lý số liệu:
    • Xử lý số liệu thực nghiệm bằng phần mềm Microsoft Excel.
    • Sử dụng hàm T-Test (kiểm định Student's t-test) để đánh giá độ tin cậy và mức độ sai khác có ý nghĩa thống kê giữa các dòng chuyển gen và dòng đối chứng không chuyển gen ($p < 0,05$ ký hiệu $$; $0,0001 < p < 0,001$ ký hiệu $ $; $p < 0,0001$ ký hiệu $ * *$).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 trình bày tổng quan lý luận và thực tiễn gồm 4 nội dung lớn:

  1. Đặc điểm sinh học của cây lúa Oryza sativa, thống kê thiệt hại kinh tế do hạn hán gây ra trên phạm vi toàn cầu và Việt Nam. Phân tích toàn diện tác động của stress thiếu nước lên các cấp độ: hình thái (suy giảm diện tích lá, kích thích ăn sâu của rễ, phản ứng cuốn lá), sinh lý (đóng khí khổng, ức chế quang hợp, giảm hiệu suất sử dụng nước WUE, vai trò của hormone ABA), sinh hóa (tích lũy proline, polyamine, tăng cường hoạt tính các enzyme chống oxy hóa SOD, CAT, POD, APX nhằm dập tắt ROS), và phân tử (chuỗi nhận tín hiệu thụ thể màng, kinase MAPK/CDPK, các protein chức năng HSP, LEA, Aquaporin).
  2. Hệ thống hóa cấu trúc và chức năng của các họ nhân tố phiên mã đáp ứng bất lợi phi sinh học ở thực vật, tập trung phân tích sâu họ nhân tố phiên mã NAC. Cấu trúc protein NAC gồm domain liên kết DNA bảo thủ ở đầu N và domain TRR biến đổi ở đầu C; cơ chế điều hòa biểu hiện các gen hạ nguồn qua các yếu tố cis-element.
  3. Hệ thống chuyển gen ở thực vật qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, cơ chế chuyển T-DNA vào nhân tế bào chủ, đặc điểm của các loại promoter cấu trúc liên tục (CaMV 35S, Ubiquitin) và promoter cảm ứng điều kiện bất lợi (Lip9, Rd29A).
  4. Tình hình nghiên cứu tạo giống cây trồng và lúa chuyển gen chống chịu hạn trên thế giới và tại Việt Nam.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc vật liệu, hóa chất, thiết bị, hệ thống môi trường nuôi cấy mô thực vật (các môi trường NB-IND, R2-CL, R2-CS, R2-S, NB-S, PRN-S, RN, R với nồng độ chi tiết các muối khoáng, vitamin, chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D, BAP, NAA, ABA và kháng sinh chọn lọc), quy trình công nghệ chuyển gen qua A. tumefaciens, các kỹ thuật sinh học phân tử (PCR, RT-PCR, qRT-PCR xác định copy number và zygosity) và các phương pháp kiểm tra sinh lý, hóa sinh theo các tiêu chuẩn quốc tế và phương pháp thống kê sinh học.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu & thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được qua 4 phần chính:

1. Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan đến tính chịu hạn ở lúa

  • Khảo sát khả năng chịu hạn của 11 giống lúa thu thập tại Việt Nam, kết quả xác định giống lúa Tẻ Đỏ có khả năng chịu hạn tốt nhất, được lựa chọn làm nguồn vật liệu phân lập gen.
  • Phân lập thành công 3 gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC từ giống lúa Tẻ Đỏ:
    • Gen OsNAC1: Chiều dài 951 bp, mã hóa chuỗi polypeptide gồm 316 axit amin, tương đồng cao với trình tự trên GenBank (AY596808.1).
    • Gen OsNAC5: Chiều dài 993 bp, mã hóa chuỗi polypeptide gồm 330 axit amin, so sánh với trình tự GenBank (AB028184.1 dài 990 bp) có sự sai khác một số nucleotide và vùng chèn/mất đoạn nhỏ nhưng bảo tồn hoàn toàn domain NAC ở đầu N.
    • Gen OsNAC10: Chiều dài 1183 bp, mã hóa chuỗi polypeptide tương ứng, so sánh với trình tự công bố trên GenBank (AK069257.1 dài 1153 bp).
  • Kết quả phân tích RT-PCR và qRT-PCR cho thấy mức độ phiên mã của cả 3 gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 đều được cảm ứng tăng cường rõ rệt trong điều kiện cây bị xử lý stress hạn, trong đó OsNAC1 biểu hiện mạnh và ổn định.

2. Thiết kế vector biểu hiện gen OsNAC1 trong tế bào thực vật

  • Luận án đã hoàn thiện thiết kế và kiểm tra thành công 4 cấu trúc vector biểu hiện mang gen đích OsNAC1:
    • Hai cấu trúc điều khiển bởi promoter hoạt động liên tục: pBI-Ubi/OsNAC1 (promoter Ubiquitin) và pBI-35S/OsNAC1 (promoter CaMV 35S).
    • Hai cấu trúc điều khiển bởi promoter cảm ứng stress: pCAM-Lip9/OsNAC1 (promoter Lip9) và pCAM-Rd29A/OsNAC1 (promoter Rd29A).
  • Các cấu trúc tái tổ hợp được kiểm tra chính xác bằng phản ứng cắt enzyme giới hạn (BamHI, KpnI, XbaI, SacI) và giải trình tự nucleotide khẳng định khung đọc mở chính xác.

3. Nghiên cứu chuyển gen OsNAC1 vào lúa và sàng lọc các thế hệ chuyển gen

  • Biến nạp các cấu trúc vector vào chủng A. tumefaciens EHA105 và tiến hành chuyển gen vào mô sẹo lúa.
  • Sàng lọc cây tái sinh $T_0$ trên môi trường chứa Hygromycin 50 mg/l, kiểm tra PCR khẳng định sự có mặt đồng thời của đoạn gen chuyển hptII và OsNAC1.
  • Phân tích thế hệ $T_1$ và $T_2$ bằng qRT-PCR để xác định số lượng bản sao (copy number) và kiểu gen (zygosity). Kết quả đã chọn lọc được các dòng mang một bản sao (single copy) ở trạng thái đồng hợp tử ($AA$) như dòng L1.1 (cấu trúc Lip9:OsNAC1) và dị hợp tử ($Aa$) như L4.3, U2.7.

4. Đánh giá sinh trưởng, phát triển và khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen

  • Trong điều kiện sinh trưởng bình thường (không xử lý hạn): Các dòng lúa chuyển gen thế hệ $T_2$ biểu hiện các chỉ tiêu nông sinh học (chiều cao cây, số nhánh/khóm, số hạt chắc/bông, thời gian sinh trưởng) tương đương với dòng đối chứng không chuyển gen (ĐC), không ghi nhận hiện tượng bất thường hay suy giảm năng suất.
Dòng lúa / Chỉ tiêu Chiều cao cây (cm) Số nhánh / khóm Số hạt chắc / bông Thời gian sinh trưởng (ngày)
Dòng L1.1 103,2 ± 0,29 5,5 ± 0,57 105,7 ± 7,50 107 ± 0,54
Dòng L4.1 102,9 ± 0,29 5,0 ± 0,00 101,7 ± 4,16 105 ± 1,53
Dòng L4.3 102,9 ± 0,58 5,3 ± 0,50 103,3 ± 6,11 106 ± 0,57
Dòng U2.7 103,2 ± 0,76 5,3 ± 0,50 104,3 ± 6,66 105 ± 1,53
Cây đối chứng không chuyển gen (ĐC) 103,5 ± 0,50 5,3 ± 0,50 106,7 ± 3,05 105 ± 1,00
  • Trong điều kiện xử lý hạn (ngừng tưới 2 tuần):
    • Chỉ số cuốn lá và khả năng phục hồi: Các dòng lúa chuyển gen có độ cuốn lá thấp hơn rõ rệt (duy trì sức trương tốt hơn) và tỷ lệ phục hồi sau khi tái cấp nước cao hơn so với dòng đối chứng.
    • Hàm lượng nước tương đối (RWC): Trong điều kiện thường, RWC giữa các dòng chuyển gen và ĐC không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê ($p = 0,55398$). Khi bị hạn, các dòng chuyển gen duy trì RWC cao hơn đối chứng ở mức ý nghĩa $p = 0,00069$ ($* * *$).
    • Hàm lượng chất diệp lục: Dưới điều kiện hạn, hàm lượng diệp lục a ($p = 0,00001$), diệp lục b ($p = 0,00049$) và diệp lục tổng số ($p = 0,00049$) ở các dòng chuyển gen duy trì ở mức cao hơn có ý nghĩa thống kê so với dòng đối chứng.
    • Hàm lượng proline tự do: Dưới điều kiện hạn, hàm lượng proline tích lũy ở các dòng chuyển gen tăng vọt và cao hơn có ý nghĩa thống kê ($p = 0,00004$) so với đối chứng, hỗ trợ điều hòa thẩm thấu tế bào.
    • Nhuộm DAB xác định $H_2O_2$: Mức độ bắt màu nâu của phản ứng DAB ở mô lá các dòng chuyển gen thấp hơn đối chứng, chứng minh mức độ tích tụ $H_2O_2$ nội bào thấp hơn và màng tế bào ít bị tổn thương oxy hóa hơn.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

  • Phân lập và xác định đặc tính phân tử thành công của 3 gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC gồm OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 từ nguồn gen giống lúa bản địa Tẻ Đỏ của Việt Nam, cung cấp dẫn liệu trình tự nucleotide và chuỗi axit amin suy diễn bổ sung vào ngân hàng dữ liệu gen.
  • Xây dựng thành công hệ thống vector biểu hiện thực vật mang gen OsNAC1 được điều khiển bởi 4 loại promoter khác nhau, chứng minh tính hiệu quả của promoter cảm ứng stress (Lip9) trong việc điều hòa biểu hiện gen đích đáp ứng với điều kiện khô hạn mà không gây ảnh hưởng bất lợi đến sinh trưởng phát triển bình thường của cây.
  • Chứng minh cơ chế nâng cao tính chịu hạn ở các dòng lúa chuyển gen OsNAC1 thông qua khả năng duy trì hàm lượng nước tương đối (RWC), bảo vệ hệ sắc tố quang hợp (chlorophyll a, b), tăng cường tích lũy chất điều hòa thẩm thấu (proline) và giảm thiểu sự tích tụ các chất oxy hóa ($H_2O_2$).

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

  • Tạo được các dòng lúa chuyển gen thế hệ $T_2$ mang đơn bản sao gen OsNAC1 ở trạng thái đồng hợp tử (tiêu biểu như dòng L1.1 điều khiển bởi promoter Lip9), sinh trưởng bình thường trong điều kiện không xử lý hạn và có tỷ lệ sống sót, khả năng phục hồi vượt trội sau stress hạn so với cây không chuyển gen.
  • Cung cấp nguồn vật liệu di truyền và các cấu trúc vector biểu hiện gen OsNAC1 phục vụ công tác nghiên cứu chuyển gen cải thiện tính chịu hạn trên các đối tượng cây trồng nông nghiệp quan trọng khác như ngô, đậu tương, bông.

Kiến nghị

  • Tiếp tục theo dõi, đánh giá tính ổn định di truyền của tính trạng chịu hạn và năng suất của các dòng lúa chuyển gen qua các thế hệ tiếp theo ($T_3$, $T_4$) trong điều kiện đồng ruộng.
  • Ứng dụng các vector biểu hiện mang cấu trúc promoter cảm ứng stress (Lip9:OsNAC1, Rd29A:OsNAC1) để chuyển giao và thử nghiệm chuyển gen vào các giống lúa thuần và lúa lai thương phẩm có diện tích canh tác lớn tại Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của nghiên cứu:
    • Các thử nghiệm đánh giá khả năng chịu hạn và các chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh mới được thực hiện trong điều kiện nhân tạo và quy mô nhà lưới, chưa tiến hành khảo nghiệm diện rộng ngoài đồng ruộng dưới các điều kiện khô hạn tự nhiên đa dạng.
    • Luận án tập trung sâu vào nghiên cứu chức năng và tạo cây chuyển gen với gen OsNAC1, chưa hoàn thành việc đánh giá so sánh hiệu quả chịu hạn của các dòng chuyển gen mang OsNAC5 và OsNAC10 ở các thế hệ tương đương.
    • Đối tượng nhận gen trong nghiên cứu tái sinh chủ yếu thuộc nhóm lúa Japonica, cần mở rộng quy trình sang các nền giống thuộc phân loài Indica vốn chiếm tỷ trọng canh tác chủ yếu tại Việt Nam.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo:
    • Khảo nghiệm đánh giá tính chịu hạn, khả năng chống chịu kết hợp (hạn - mặn) và các yếu tố cấu thành năng suất của dòng chuyển gen $T_2$, $T_3$ tại các vùng sinh thái chịu ảnh hưởng khô hạn.
    • Phân tích biểu hiện toàn diện hệ transcriptome để xác định chính xác các gen hạ nguồn trực tiếp chịu sự điều hòa của OsNAC1.
    • Thử nghiệm chuyển cấu trúc Lip9:OsNAC1 vào các giống cây trồng cạn như ngô và đậu tương.

Giá trị tham khảo

  • Đối với nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Hóa sinh học, Di truyền học và Công nghệ sinh học: Luận án là tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình công nghệ sinh học phân tử hoàn chỉnh từ phân lập gen, thiết kế vector biểu hiện thực vật mang các promoter chuyên biệt, kỹ thuật chuyển gen qua Agrobacterium, sàng lọc dòng chuyển gen đơn bản sao đồng hợp tử bằng phương pháp Real-time PCR ($2^{-\Delta\Delta C_t}$), đến các phương pháp đo đạc chỉ tiêu sinh lý - hóa sinh thực vật.
  • Đối với giảng viên và nhà nghiên cứu sinh lý thực vật: Dữ liệu về tương quan giữa hàm lượng proline, huỳnh quang diệp lục, tỷ lệ RWC, tích tụ $H_2O_2$ và mức độ cuốn lá là tài liệu hữu ích cho việc giảng dạy và phát triển các chỉ thị sinh hóa chọn giống chịu hạn.
  • Đối với các nhà chọn tạo giống và cơ quan quản lý nông nghiệp: Cung cấp nguồn vật liệu chuyển gen tiềm năng và cơ sở khoa học cho định hướng ứng dụng công nghệ chuyển gen hỗ trợ ứng phó biến đổi khí hậu.

Câu hỏi thường gặp

  1. Luận án đã phân lập được những gen nào từ giống lúa nào của Việt Nam? Luận án đã phân lập thành công 3 gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC gồm OsNAC1 (kích thước 951 bp), OsNAC5 (kích thước 993 bp) và OsNAC10 (kích thước 1183 bp) từ giống lúa địa phương Tẻ Đỏ – giống lúa có khả năng chịu hạn tốt nhất trong số 11 giống lúa Việt Nam được khảo sát.

  2. Các loại promoter nào đã được sử dụng để thiết kế cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1? Luận án đã thiết kế 4 cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1 sử dụng 2 nhóm promoter:

  • Nhóm promoter hoạt động liên tục: Promoter Ubiquitin (trong vector pBI-Ubi/OsNAC1) và promoter CaMV 35S (trong vector pBI-35S/OsNAC1).
  • Nhóm promoter cảm ứng stress: Promoter Lip9 (trong vector pCAM-Lip9/OsNAC1) và promoter Rd29A (trong vector pCAM-Rd29A/OsNAC1).

  1. Phương pháp nào được sử dụng để xác định số lượng bản sao và kiểu gen đồng hợp tử của cây lúa chuyển gen? Luận án sử dụng kỹ thuật Real-time quantitative PCR (qRT-PCR) theo công thức $2^{-\Delta\Delta C_t}$, sử dụng cặp mồi khuếch đại gen kháng Hygromycin (hptII) kết hợp với cặp mồi của gen tham chiếu nội sinh đơn bản sao REF#3 để tính toán số lượng bản sao chuyển gen và xác định trạng thái kiểu gen đồng hợp tử ($AA$) hoặc dị hợp tử ($Aa$).

  2. Khi bị xử lý hạn, các chỉ tiêu sinh lý và hóa sinh của dòng lúa chuyển gen OsNAC1 sai khác như thế nào so với đối chứng? Trong điều kiện ngừng tưới nước 2 tuần, dòng lúa chuyển gen (tiêu biểu như L1.1) duy trì hàm lượng nước tương đối (RWC) cao hơn rõ rệt ($p = 0,00069$), hàm lượng diệp lục a, b và diệp lục tổng số cao hơn ($p < 0,001$), hàm lượng proline tích lũy cao hơn ($p = 0,00004$), mức độ tích tụ $H_2O_2$ thấp hơn và có tốc độ phục hồi tốt hơn so với dòng đối chứng không chuyển gen.

  3. Cây lúa chuyển gen OsNAC1 có bị suy giảm năng suất hay biến đổi hình thái trong điều kiện bình thường không? Không. Trong điều kiện sinh trưởng bình thường không có stress hạn, các dòng lúa chuyển gen thế hệ $T_2$ (đặc biệt là các dòng mang cấu trúc promoter cảm ứng Lip9) có chiều cao cây (102,6–103,2 cm so với ĐC 103,5 cm), số nhánh/khóm (5,0–5,5 nhánh so với ĐC 5,3 nhánh), số hạt chắc/bông (96,0–105,7 hạt so với ĐC 106,7 hạt) và thời gian sinh trưởng (105–110 ngày so với ĐC 105 ngày) tương đương với dòng đối chứng không chuyển gen.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Phạm Thu Hằng đã thực hiện thành công việc phân lập 3 gen nhân tố phiên mã nhóm NAC (OsNAC1, OsNAC5, OsNAC10) từ giống lúa bản địa Tẻ Đỏ và hoàn thiện thiết kế 4 hệ vector biểu hiện mang gen OsNAC1 dưới sự điều khiển của các promoter liên tục và cảm ứng stress. Nghiên cứu đã tạo ra các dòng lúa chuyển gen thế hệ $T_2$ mang đơn bản sao đồng hợp tử (Lip9:OsNAC1), khẳng định vai trò của gen chuyển trong việc nâng cao khả năng điều hòa thẩm thấu, duy trì hàm lượng nước, bảo vệ hệ quang hợp và giảm thiểu tổn thương oxy hóa dưới điều kiện khô hạn. Kết quả này cung cấp cơ sở khoa học và nguồn vật liệu di truyền giá trị phục vụ công tác chọn tạo giống cây trồng chuyển gen thích ứng với biến đổi khí hậu tại Việt Nam.