Luận Văn Thạc Sĩ: Khả Năng Tái Sinh In Vitro Và Quy Trình Chuyển Gen Ở Lúa Thông Qua Agrobacterium Tumefaciens

• Tác giả: Nguyễn Văn Thành
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Xuân Vũ
• Trường học: Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro ở một số giống lúa và xây dựng quy trình chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thái Nguyên

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Vai trò của cây lúa
• 1.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất lúa trên thế giới
• 1.2.1. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa trên thế giới
• 1.2.2. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới
• 1.3. Tình hình nghiên cứu vẩn xuất lúa tại Việt Nam
• 1.3.1. Nghiên cứu chọn tạo giống lúa ở Việt Nam
• 1.3.2. Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam
• 1.4. Vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật
• 1.4.1. Đặc điểm chung về vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens
• 1.4.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid và T-DNA
• 1.4.3. Cơ chế biến nạp gen thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens vào thực vật
• 1.4.4. Hệ thống gen chỉ thị sử dụng để biến nạp vào tế bào thực vật thông qua vi khuẩn A. tumefaciens được sử dụng trong nghiên cứu
• 1.5. Một số phương pháp biến nạp gen ở lúa
• 1.5.1. Phương pháp vi tiêm
• 1.5.2. Chuyển gen bằng xung điện
• 1.5.3. Chuyển gen qua ống phấn (pollen tube)
• 1.5.4. Chuyển gen bằng súng bắn gen
• 1.5.5. Chuyển gen thông qua vi khuẩn A.
• 1.6. Tình hình nghiên cứu tái sinh in vitro cây lúa trên thế giới và Việt Nam
• 1.7. Tình hình nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen cây lúa trên thế giới và Việt Nam
• 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.2. Vật liệu sử dụng và phạm vi nghiên cứu
• 2.2. Thiết bị sử dụng
• 2.3. Địa điểm và thời gian tiến hành
• 2.4. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Nội dung 1: Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống lúa
• 2.4.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng chuyển gen ở một số giống lúa
• 2.4.3. Điều kiện bố trí thí nghiệm
• 2.4.4. Phương pháp theo dõi, đánh giá
• 2.4.5. Các chỉ tiêu theo dõi
• 2.4.6. Các chỉ tiêu đánh giá
• 2.4.7. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh invitro của một số giống lúa
• 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của NaOCl đến hiệu quả vô trùng mẫu nuôi cấy
• 3.3. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo mô sẹo
• 3.4. Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo ở một số giống lúa
• 3.5. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi ở một số giống lúa
• 3.6. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi ở một số giống lúa Việt Nam
• 3.7. Kết quả nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen
• 3.7.1. Ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến hiệu quả biến nạp gen
• 3.7.2. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến hiệu quả biến nạp gen
• 3.7.3. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến hiệu quả chuyển gen ở một số giống lúa
• 3.7.4. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen
• 3.7.5. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen
• 3.7.6. Ảnh hưởng của nồng độ hygromycin đến hiệu quả chọn lọc chuyển gen
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Nghiên cứu tái sinh in vitro

Nghiên cứu tái sinh in vitro là một phần quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là trong việc cải tiến giống lúa. Phương pháp này cho phép tạo ra các cây lúa từ mô sẹo, mở ra cơ hội để chuyển gen và cải thiện các đặc tính nông học. Trong nghiên cứu này, các giống lúa như Khang dân, Bao thai, Đoàn kết và Nếp 87 được sử dụng để đánh giá khả năng tái sinh. Kết quả cho thấy, môi trường nuôi cấy và các chất điều hòa sinh trưởng như 2,4-D và BAP có ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ tạo mô sẹo và tái sinh chồi. Điều này khẳng định tầm quan trọng của việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để đạt hiệu quả cao trong tái sinh in vitro.

1.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy đóng vai trò quyết định trong quá trình tạo mô sẹo và tái sinh cây. Các môi trường như N6 và MS được sử dụng để đánh giá khả năng tạo mô sẹo của các giống lúa. Kết quả cho thấy, môi trường MS mang lại hiệu quả cao hơn trong việc tạo mô sẹo so với môi trường N6. Điều này cho thấy sự cần thiết của việc lựa chọn môi trường phù hợp để tối ưu hóa quá trình tái sinh in vitro.

1.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng

Các chất điều hòa sinh trưởng như 2,4-D và BAP có ảnh hưởng lớn đến quá trình tái sinh. Nghiên cứu chỉ ra rằng, 2,4-D ở nồng độ thích hợp kích thích sự hình thành mô sẹo, trong khi BAP thúc đẩy sự tái sinh chồi. Kết quả này khẳng định tầm quan trọng của việc điều chỉnh nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng để đạt hiệu quả tối ưu trong tái sinh in vitro.

II. Quy trình chuyển gen ở lúa

Quy trình chuyển gen ở lúa bằng Agrobacterium tumefaciens là một phương pháp hiệu quả để tạo ra các giống lúa biến đổi gen. Phương pháp này cho phép chuyển các gen mong muốn vào cây lúa, từ đó cải thiện các đặc tính như khả năng chống chịu sâu bệnh, điều kiện bất lợi và năng suất. Trong nghiên cứu này, quy trình chuyển gen được tối ưu hóa thông qua việc điều chỉnh các yếu tố như tuổi mô sẹo, nồng độ AS, thời gian lây nhiễm và đồng nuôi cấy. Kết quả cho thấy, việc sử dụng mô sẹo 3 ngày tuổi và nồng độ AS 100 µM mang lại hiệu quả chuyển gen cao nhất.

2.1. Ảnh hưởng của tuổi mô sẹo

Tuổi mô sẹo là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen. Nghiên cứu chỉ ra rằng, mô sẹo 3 ngày tuổi có khả năng tiếp nhận gen cao hơn so với mô sẹo già hơn. Điều này cho thấy sự cần thiết của việc lựa chọn mô sẹo ở giai đoạn phù hợp để tối ưu hóa quá trình chuyển gen.

2.2. Ảnh hưởng của nồng độ AS

Nồng độ AS (Acetosyringone) cũng là yếu tố quan trọng trong quá trình chuyển gen. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ AS 100 µM mang lại hiệu quả chuyển gen cao nhất. Điều này khẳng định tầm quan trọng của việc điều chỉnh nồng độ AS để tăng cường khả năng tiếp nhận gen của mô sẹo.

III. Ứng dụng công nghệ sinh học trong cải tiến giống lúa

Công nghệ sinh học, đặc biệt là kỹ thuật di truyền và nuôi cấy mô thực vật, đã mở ra nhiều cơ hội trong việc cải tiến giống lúa. Nghiên cứu này không chỉ tập trung vào tái sinh in vitro và chuyển gen mà còn hướng đến việc ứng dụng các kỹ thuật này để tạo ra các giống lúa có khả năng chống chịu tốt hơn với điều kiện bất lợi và năng suất cao hơn. Việc kết hợp các phương pháp này với các kỹ thuật truyền thống sẽ giúp tạo ra các giống lúa chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu thực tiễn sản xuất.

3.1. Cải tiến giống lúa bằng kỹ thuật di truyền

Kỹ thuật di truyền, đặc biệt là chuyển gen, đã trở thành công cụ mạnh mẽ trong việc cải tiến giống lúa. Nghiên cứu này đã chứng minh hiệu quả của việc sử dụng Agrobacterium tumefaciens để chuyển gen vào lúa, từ đó tạo ra các giống lúa có khả năng chống chịu sâu bệnh và điều kiện bất lợi. Điều này mở ra tiềm năng lớn trong việc phát triển các giống lúa chất lượng cao.

3.2. Nuôi cấy mô thực vật trong cải tiến giống

Nuôi cấy mô thực vật là phương pháp hiệu quả để nhân nhanh các giống lúa chất lượng cao. Nghiên cứu này đã tối ưu hóa quy trình nuôi cấy mô để tạo ra các cây lúa từ mô sẹo, từ đó tăng cường khả năng tái sinh và chuyển gen. Điều này khẳng định tầm quan trọng của nuôi cấy mô trong việc cải tiến giống lúa.