Luận án tiến sĩ tác dụng ức chế của cao chiết cây Mần tưới lên vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa

Nghiên cứu tác dụng của cao chiết cây mần tưới lên sự phát triển của vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa trong thủy vực nước ngọt.

• Tác giả: Phạm Thanh Nga
• Người hướng dẫn: Hướng Dẫn 1. Đặng Đình Kim
• Trường học: Học viện khoa học và công nghệ
• Chuyên ngành: Kỹ thuật môi trường
• Đề tài: Nghiên Cứu Tác Dụng Ức Chế Của Cao Chiết Cây Mần Tưới Lên Vi Khuẩn Lam Độc Microcystis Aeruginosa
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH ẢNH
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 1.1. Vi khuẩn lam độc và hiện tượng phú dưỡng trong các thủy vực nước ngọt
• 1.1.1. Vi khuẩn lam độc
• 1.1.2. Hiện tượng phú dưỡng và triển bùng nổ sinh khối VKL độc
• 1.1.3. Các biện pháp kiểm soát phát triển bùng nổ sinh khối VKL độc
• 1.1.4. Phương pháp triển khai áp dụng ngoài thực tế tại các ao, hồ Việt Nam
• 1.2. Sử dụng cao chiết thực vật và hoạt chất thiên nhiên để kiểm soát bùng nổ Vi khuẩn lam độc
• 1.2.1. Hoạt tính sinh học của cao chiết và các hợp chất thiên nhiên
• 1.2.2. Nghiên cứu điển hình sử dụng cao chiết, dịch chiết thực vật kiểm soát bùng phát VKL độc
• 1.2.3. Một số nhóm hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên kiểm soát bùng nổ VKL
• 1.2.4. Cơ chế tác động của các cao chiết và các hợp chất thiên nhiên lên sinh trưởng của VKL độc M.
• 1.3. Cây Mần tưới Eupatorium fortunei
• 1.3.1. Sơ lược về cây Mần tưới Eupatorium fortunei
• 1.3.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
• 1.3.3. Hoạt tính sinh học của cây Mần tưới
• 1.3.4. Ứng dụng cao chiết cây Mần tưới để kiểm soát bùng phát sinh khối VKL độc M.
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.1. Cây Mần tưới Eupatorium fortunei
• 2.1.2. Vi khuẩn lam độc nước ngọt Microcystis aeruginosa Kützing
• 2.1.3. Loài tảo lục Chlorella vulgaris
• 2.1.4. Bèo tấm Lemna minor
• 2.1.5. Giáp xác Daphnia magna
• 2.1.6. Quần thể thực vật phù du hồ Hoàn Kiếm và hồ Láng
• 2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
• 2.2.1. Thiết bị và dụng cụ
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu thực vật, tạo cao chiết và phân lập các hợp chất sạch
• 2.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất sạch
• 2.3.3. Phương pháp đánh giá sinh trưởng của VKL, tảo lục Chlorella vulgaris và thực vật phù du
• 2.3.4. Phương pháp quan sát hình thái tế bào VKL và Chlorella vulgaris
• 2.3.5. Phương pháp đánh giá độc tố của cao chiết lên Daphnia magna
• 2.3.6. Phương pháp đánh giá độc tố của cao chiết lên Lemna minor
• 2.3.7. Phương pháp phân tích chất lượng môi trường nước
• 2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu
• 2.4. Mô tả thực nghiệm
• 2.4.1. Thực nghiệm xử lý mẫu thực vật, tạo cao chiết và phân lập chất sạch
• 2.4.2. Quy trình phân lập các chất sạch từ cao chiết phân đoạn etyl axetate Mần tưới
• 2.4.3. Thực nghiệm nghiên cứu độc tính diệt VKL độc và tảo lục của các cao chiết
• 2.4.4. Thực nghiệm đánh giá tính an toàn của cao chiết
• 2.4.5. Thực nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao chiết đối với mẫu nước hồ tự nhiên
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Công thức cấu tạo các chất sạch được phân lập từ cây Mần tưới Eupatorium fortunei
• 3.1.1. Hợp chất 7,8,9-trihydroxythymol (EfD4.1)
• 3.1.2. Hợp chất 8,10-didehydro-7,9-dihydroxythymol (EfD4.2)
• 3.1.3. Hợp chất 8,9,10-Trihydroxythymol (EfD5.1)
• 3.1.4. Hợp chất o-Coumaric acid (EfD1.1)
• 3.1.5. Hợp chất 4-(2-hydroxyethyl)benzaldehyde (EfD10.1)
• 3.1.6. Hợp chất kaempferol (EfD10.2)
• 3.1.7. Hợp chất 8,10-dihydroxy-9-acetoxythymol (EfD14.1)
• 3.2. Kết quả đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng và diệt VKL độc, vi tảo của các cao chiết và chất sạch được phân lập
• 3.2.1. Đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng VKL độc Microcystis aeruginosa TC3 của các cao chiết tổng Mần tưới
• 3.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết tổng etanol Mần tưới lên sinh trưởng của Microcystis aeruginosa TC3 và Chlorella vulgaris
• 3.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn lên sinh trưởng của Microcystis aeruginosa TC3 và Chlorella vulgaris
• 3.2.4. Đánh giá tiềm năng kiểm soát bùng nổ sinh khối Microcystis aeruginosa TC3 của cao chiết Mần tưới
• 3.2.5. Đánh giá hoạt tính diệt Microcystis aeruginosa TC3 của các chất sạch
• 3.2.6. Ảnh hưởng của cao chiết lên cấu trúc tế bào M. aeruginosa TC3 và C. vulgaris
• 3.3. Kết quả đánh giá tính an toàn của cao chiết thực vật Mần tưới (ảnh hưởng lên một số sinh vật khác)
• 3.3.1. Ảnh hưởng của cao chiết đến giáp xác Daphnia magna
• 3.3.2. Ảnh hưởng của cao chiết đến bèo tấm Lemna minor
• 3.4. Bước đầu thử nghiệm ảnh hưởng của cao chiết lên sinh trưởng VKL độc trong mẫu nước hồ tự nhiên
• 3.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng ức chế của cao chiết lên mẫu nước hồ Hoàn Kiếm quy mô phòng thí nghiệm
• 3.4.2. Kết quả thử nghiệm trên mẫu nước hồ Láng quy mô 5L tại phòng thí nghiệm
• 3.4.3. Kết quả thử nghiệm trên mẫu nước hồ Láng quy mô ngoài trời
• 3.4.4. Ảnh hưởng của cao chiết đến các thông số môi trường
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC
• 1. Quyết định về việc công nhận trúng tuyển nghiên cứu sinh năm 2015
• 2. Quyết định về việc công nhận tên đề tài và người hướng dẫn
• 3. Danh mục các bài báo công bố của NCS
• 4. Danh mục các phổ của các chất sạch được phân lập từ cây Mần tưới

Tóm tắt

I. Tổng quan về tác dụng ức chế của cao chiết cây Mần tưới

Cao chiết từ cây Mần tưới (Eupatorium fortunei) đã được nghiên cứu để đánh giá tác dụng ức chế đối với vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa. Vi khuẩn này là nguyên nhân chính gây ra hiện tượng phú dưỡng trong các thủy vực nước ngọt, dẫn đến sự phát triển ồ ạt của tảo và sản sinh độc tố. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế tác động của cao chiết mà còn mở ra hướng đi mới trong việc kiểm soát ô nhiễm nước.

1.1. Cây Mần tưới và thành phần hóa học

Cây Mần tưới chứa nhiều hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học, bao gồm flavonoid và phenolic. Những hợp chất này đã được chứng minh có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn lam độc, đặc biệt là Microcystis aeruginosa.

1.2. Tác động của Microcystis aeruginosa đến môi trường

Microcystis aeruginosa là một trong những loài vi khuẩn lam độc phổ biến nhất, gây ra hiện tượng nở hoa nước. Sự phát triển của chúng không chỉ làm giảm chất lượng nước mà còn ảnh hưởng đến sức khỏe con người và động vật.

II. Vấn đề ô nhiễm nước và thách thức từ vi khuẩn lam độc

Ô nhiễm nước do vi khuẩn lam độc đang trở thành một vấn đề nghiêm trọng trên toàn cầu. Việc kiểm soát sự phát triển của Microcystis aeruginosa là một thách thức lớn, đặc biệt trong bối cảnh gia tăng ô nhiễm nguồn nước. Các phương pháp truyền thống thường không hiệu quả và có thể gây ra ô nhiễm thứ cấp.

2.1. Nguyên nhân gây ra ô nhiễm nước

Ô nhiễm nước chủ yếu do xả thải công nghiệp, nông nghiệp và sinh hoạt không qua xử lý. Điều này dẫn đến sự gia tăng nồng độ dinh dưỡng trong nước, tạo điều kiện cho vi khuẩn lam phát triển.

2.2. Hệ quả của ô nhiễm nước

Ô nhiễm nước không chỉ ảnh hưởng đến chất lượng nước mà còn gây ra các vấn đề sức khỏe nghiêm trọng cho con người và động vật. Việc sử dụng nước ô nhiễm có thể dẫn đến các bệnh truyền nhiễm và ngộ độc.

III. Phương pháp nghiên cứu tác dụng ức chế của cao chiết

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất từ cây Mần tưới để đánh giá tác dụng ức chế đối với vi khuẩn lam độc. Các thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện kiểm soát để đảm bảo tính chính xác của kết quả.

3.1. Quy trình chiết xuất cao chiết từ cây Mần tưới

Quy trình chiết xuất bao gồm việc thu hái, làm khô và chiết xuất bằng dung môi phù hợp. Các hợp chất được phân lập và xác định để đánh giá hoạt tính sinh học.

3.2. Đánh giá tác dụng ức chế sinh trưởng của vi khuẩn

Các thí nghiệm được thực hiện để đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng của Microcystis aeruginosa dưới tác động của cao chiết. Kết quả cho thấy cao chiết có khả năng ức chế mạnh mẽ sự phát triển của vi khuẩn này.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết từ cây Mần tưới có tác dụng ức chế mạnh mẽ đối với vi khuẩn lam độc. Điều này mở ra cơ hội ứng dụng cao chiết trong việc kiểm soát ô nhiễm nước và bảo vệ môi trường.

4.1. Hiệu quả ức chế của cao chiết đối với Microcystis

Cao chiết từ cây Mần tưới đã cho thấy hiệu quả ức chế rõ rệt đối với sự phát triển của Microcystis aeruginosa, với nồng độ ức chế tối ưu được xác định trong các thí nghiệm.

4.2. Ứng dụng cao chiết trong thực tiễn

Cao chiết từ cây Mần tưới có thể được ứng dụng trong việc xử lý nước ô nhiễm, giúp giảm thiểu sự phát triển của vi khuẩn lam độc và cải thiện chất lượng nước.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu về tác dụng ức chế của cao chiết cây Mần tưới đối với vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa đã mở ra hướng đi mới trong việc kiểm soát ô nhiễm nước. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất và đánh giá tính an toàn của cao chiết.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu

Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị thực tiễn trong việc bảo vệ môi trường nước và sức khỏe cộng đồng.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu để phát triển các sản phẩm từ cao chiết cây Mần tưới, đồng thời đánh giá tác động lâu dài của chúng đối với hệ sinh thái.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tình trạng ô nhiễm môi trường nước mặt và hiện tượng phú dưỡng (eutrophication) trong các thủy vực nước ngọt do sự gia tăng nồng độ các chất dinh dưỡng (chủ yếu là nitơ và photpho từ nguồn nước thải sinh hoạt, công nghiệp và nông nghiệp) đang dẫn đến sự bùng phát sinh khối ồ ạt của vi khuẩn lam (VKL) và vi tảo, hay còn gọi là hiện tượng "tảo nở hoa" hoặc "nở hoa của nước". Trong các loài VKL độc gây hiện tượng nở hoa nước tại các thủy vực nước ngọt, loài Microcystis aeruginosa chiếm tới 90% tần suất xuất hiện và sản sinh các nhóm độc tố nguy hiểm gồm độc tố gan (hepatotoxins - điển hình là microcystin), độc tố thần kinh (neurotoxins) và độc tố gây dị ứng da. Mật độ tế bào VKL từ 20.000 đến trên 100.000 tế bào/mL gây nguy hiểm nghiêm trọng cho sức khỏe con người, động vật nuôi và hệ sinh thái thủy sinh.

Các giải pháp truyền thống như cơ học (vớt váng, che sáng, pha loãng nước), vật lý (thay đổi pH, sóng siêu âm, bức xạ UV-C) và hóa học (sử dụng muối kim loại nhôm, sắt, đồng sunphat $\text{CuSO}_4$, chất oxy hóa $\text{H}_2\text{O}_2$, $\text{KMnO}_4$, $\text{O}_3$, thuốc trừ cỏ 2,4-D hoặc vật liệu nano) bộc lộ nhiều hạn chế: chi phí cao, tác động không chọn lọc gây hủy hoại sinh vật có ích, gây ô nhiễm thứ cấp, làm vỡ tế bào đột ngột dẫn đến giải phóng độc tố microcystin ra môi trường nước, hoặc gây ra hiện tượng nhờn thuốc khi sử dụng lặp lại. Do đó, việc nghiên cứu các hợp chất có nguồn gốc thực vật có khả năng ức chế sinh trưởng chọn lọc đối với VKL độc và thân thiện với môi trường là một hướng đi cần thiết. Nghiên cứu sơ bộ năm 2013 của Nguyễn Tiến Đạt và cộng sự ghi nhận cao chiết cây Mần tưới (Eupatorium fortunei Turcz.) có hiệu quả ức chế M. aeruginosa cao hơn so với nhiều loài thực vật khác tại Việt Nam; tuy nhiên, các nghiên cứu trước đó chưa phân lập đầy đủ các hoạt chất sạch chịu trách nhiệm, chưa kiểm tra tính an toàn sinh thái trên các sinh vật chỉ thị, chưa giải thích cơ chế tác động lên siêu cấu trúc tế bào và chưa thử nghiệm trên các mẫu nước hồ tự nhiên ở quy mô ngoài trời.

Luận án tiến sĩ chuyên ngành Kỹ thuật môi trường (mã số: 9.20) của nghiên cứu sinh Phạm Thanh Nga, thực hiện tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam dưới sự hướng dẫn của GS. Đặng Đình Kim và TS. Lê Thị Phương Quỳnh (Hà Nội, 2019), đặt ra mục tiêu chung: Tạo được cao chiết thực vật ức chế hiệu quả sinh trưởng của Vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa.

Nội dung nghiên cứu của luận án được xác định cụ thể theo 5 nội dung đánh số trong văn bản:

1. Xây dựng quy trình tạo cao chiết tổng, cao chiết phân đoạn, các chất sạch phân lập từ cây Mần tưới.
2. Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng ức chế của cao chiết tổng Mần tưới lên sinh trưởng của M. aeruginosa và đánh giá an toàn sinh thái.
3. Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng ức chế của cao chiết phân đoạn etyl axetat và cao chiết phân đoạn nước Mần tưới lên sinh trưởng của M. aeruginosa và đánh giá an toàn sinh thái.
4. Nghiên cứu phân lập và đánh giá hoạt tính diệt VKL độc M. aeruginosa của 07 hợp chất hóa học được phân lập từ cây Mần tưới.
5. Nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng cao chiết để kiểm soát bùng nổ Vi khuẩn lam trong các mẫu nước hồ tự nhiên.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Cây Mần tưới (Eupatorium fortunei Turcz., họ Cúc Asteraceae); chủng vi khuẩn lam độc nước ngọt Microcystis aeruginosa Kützing (chủng phân lập phòng thí nghiệm TC3); chủng vi tảo lục Chlorella vulgaris; bèo tấm Lemna minor; giáp xác râu ngành Daphnia magna; và quần thể thực vật phù du (TVN) trong mẫu nước tự nhiên thu thập từ hồ Hoàn Kiếm và hồ Láng (Hà Nội).
• Phạm vi không gian: Nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm và thử nghiệm mô phỏng ngoài trời tại Hà Nội trên nguồn nước lấy từ hồ Hoàn Kiếm và hồ Láng.
• Phạm vi thời gian: Quá trình nghiên cứu và thu thập số liệu thực nghiệm được triển khai trong giai đoạn đào tạo nghiên cứu sinh từ năm 2015 đến năm 2019.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các hướng nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam về việc sử dụng các chế phẩm sinh học, dịch chiết và cao chiết thực vật để kiểm soát sự bùng phát của vi khuẩn lam và vi tảo độc trong các hệ sinh thái nước ngọt:

1. Dịch chiết từ rơm lúa mạch (Hordeum vulgare): Được nghiên cứu từ đầu thập niên 1990 bởi Gibson và cộng sự (1990) với hiệu quả ức chế Cladophora glomerata, Chlorella vulgaris và Selenastrum capricornutum đạt 63% sau 6 tháng. Jonathan (1993) ghi nhận dịch chiết rơm phân hủy ức chế 95% M. aeruginosa ở liều 2,57 g sinh khối khô/$\text{m}^3$. Everall (1996) thử nghiệm trên hồ thực tế với tỷ lệ 25 g/$\text{m}^3$. Tuy nhiên, Boylan (2003) chứng minh hiệu lực giảm sau 8–9 tuần và phụ thuộc vào nồng độ oxy hòa tan (DO); Ferrier ghi nhận kết quả không ổn định giữa 12 loài VKL khác nhau; Timothy (2009) thử nghiệm 3 loại cao chiết nước ở dải nồng độ cao từ 1.720 đến 3.030 mg/L và khẳng định vai trò của các hợp chất phenolic phân tử lượng 1.000–3.000 Da.
2. Cao chiết từ rơm lúa gạo (Oryza sativa): Park và cộng sự (2006) dùng cao chiết metanol ức chế 98% M. aeruginosa ở nồng độ 10 mg/L; phân lập các axit salicylic, axit p-coumaric, axit benzoic. Park và cộng sự (2009) chứng minh tính ức chế chọn lọc không gây hại cho tảo lục (Ankistrodesmus convolutus, Scenedesmus quadricauda) và giáp xác Daphnia magna. Ateeque và cộng sự (2014) thử nghiệm 5 chất sạch và ghi nhận hoạt chất oleioyl-$\beta$-D-arabinoside ức chế 92,6% ở 100 mg/L sau 6 ngày.
3. Cao chiết từ các loài cây họ Anh túc (Papaveraceae): Jancula và cộng sự (2007) nghiên cứu cao chiết nước từ rễ của 5 loài (Dicranostigma lactucoides có $\text{EC}{50} = 55,81\text{ mg/L}$, Chelidonium majus có $\text{EC}{50} = 57,11\text{ mg/L}$, Sanguinaria canadensis, Stylophorum lasiocarpum, Macleaya microcarpa). Trong đó, cao chiết C. majus ít độc hơn đối với Daphnia magna ($\text{EC}{50} > 500\text{ mg/L}$) và Lemna minor ($\text{EC}{50} = 448,69\text{ mg/L}$); hoạt tính ức chế được xác định do các alkaloid nhóm benzo[c]phenanthridine như magnoflorine và coptisine.
4. Cao chiết từ cây keo đen (Acacia mearnsii): Zhou và cộng sự (2012) thử nghiệm mô hình ngắn hạn (1 tháng, liều 3,623 mg/L làm giảm chlorophyll a trong 17 ngày) và dài hạn (1 năm, bổ sung 1–2 mg/L hàng tuần). Liu và cộng sự (2013, 2015) chỉ ra cao chiết làm suy giảm biểu hiện các gen quang hợp (rbcL, psaB, psbD) và tăng hoạt tính enzym $\text{Ca}^{2+}/\text{Mg}^{2+}\text{-ATPase}$.
5. Cao chiết từ rễ cây Ephedra equisetina: Yan (2010) chứng minh cao chiết nước (10–75 µg) làm giảm chlorophyll a từ 670 xuống 150 µg/L sau 5 ngày mà không làm thay đổi lớn các thông số thủy hóa ($\text{TN} = 6,45\text{ mg/L}$, $\text{TP} = 0,65\text{ mg/L}$), quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) thấy màng thylakoid bị bóc tách khỏi tế bào chất.
6. Cao chiết từ thực vật thủy sinh họ Myriophyllaceae: Nakai và cộng sự (2000, 2005) phân lập axit gallic ($\text{EC}{50} = 1,0\text{ mg/L}$), axit pyrogallic ($\text{EC}{50} = 0,65\text{ mg/L}$) và axit nonanoic ($\text{EC}_{50} = 0,5\text{ mg/L}$) từ Myriophyllum spicatum. Zhu (2010) chứng minh axit pyrogallic và axit gallic làm giảm năng suất quang hệ II (PSII) xuống 71,43% và 70,95%.
7. Nghiên cứu tại Việt Nam: Nguyễn Thị Hoài Hà và cộng sự (2010) sử dụng vi khuẩn Sphingomonas saccharolytica N7 phân lập từ hồ Hoàn Kiếm để phân hủy microcystin (thời gian bán phân hủy 3,4 giờ đối với nồng độ ban đầu 10 µg/L). Dương Thị Thủy và cộng sự (2015) thử nghiệm vật liệu nano kim loại (nano đồng 1 mg/L ức chế chọn lọc M. aeruginosa so với Chlorella). Nguyễn Tiến Đạt và cộng sự (2013) bước đầu khảo sát hoạt tính diệt M. aeruginosa của cao chiết Mần tưới.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết: Mặc dù tiềm năng của cây Mần tưới đã được ghi nhận bước đầu, các công trình trước chưa phân lập và xác định đầy đủ cấu trúc hóa học của các hợp chất tinh khiết có hoạt tính diệt tảo; chưa đánh giá so sánh tác động chọn lọc giữa VKL độc và vi tảo lục có ích; chưa kiểm tra toàn diện tính an toàn sinh thái trên các bậc dinh dưỡng khác nhau (Daphnia magna, Lemna minor); chưa phân tích biến đổi siêu cấu trúc tế bào dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM); và chưa đánh giá diễn biến chất lượng nước (các chỉ tiêu thủy lý, thủy hóa) khi thử nghiệm cao chiết trên các mẫu nước hồ tự nhiên quy mô phòng thí nghiệm và ngoài trời. Luận án được thực hiện nhằm giải quyết đồng bộ các khoảng trống này.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về sinh thái học thủy vực phú dưỡng, sinh học vi khuẩn lam độc, cơ chế ức chế cảm nhiễm (allelopathy) của các hợp chất thứ cấp từ thực vật và độc học môi trường nước. Khung nghiên cứu kết hợp giữa hóa học các hợp chất thiên nhiên và thực nghiệm sinh học - môi trường.

Mẫu cây Mần tưới tươi
Cao chiết tổng
Đánh giá hoạt tính sinh học & Độc học sinh thái:
  • Ức chế M. aeruginosa TC3 vs Chlorella vulgaris (OD680, Chlorophyll a, mật độ tế bào)
  • Phân tích siêu cấu trúc tế bào (TEM, SEM)
  • An toàn sinh thái: Daphnia magna (LC50 24h, 48h) & Lemna minor (5 ngày)
  • Thử nghiệm mẫu nước hồ tự nhiên (Hồ Hoàn Kiếm 5L, Hồ Láng 5L & 300L ngoài trời)
  • Quan trắc chất lượng nước (DO, pH, TN, TP, NH4+, NO3-, PO43-)

Phương pháp nghiên cứu hóa học

• Xử lý mẫu và chiết xuất: Mẫu thực vật Mần tưới tươi được thu hái, xử lý cơ học và chiết hồi lưu hoặc ngâm chiết trong các dung môi khác nhau (etanol EtOH, metanol MeOH, nước W). Dung môi được loại bỏ bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ thích hợp để thu cao chiết tổng.
• Chiết phân đoạn: Cao chiết tổng etanol được phân bố lỏng - lỏng lần lượt qua các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etyl axetat (EtOAc) và nước (W).
• Phân lập chất sạch: Sử dụng kỹ thuật sắc ký cột pha thường (Silica gel), sắc ký cột pha đảo (RP-18), rây phân tử (Sephadex LH-20) và sắc ký lớp mỏng (TLC) để tinh sạch các phân đoạn từ cao etyl axetat.
• Xác định cấu trúc hóa học: Kết hợp các phương pháp phổ nghiệm hiện đại: phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, HSQC, HMBC), phổ khối lượng phun mù điện tử phân giải cao (HR-ESI-MS) và phổ hồng ngoại (IR).

Phương pháp nghiên cứu sinh học và môi trường

• Đánh giá sinh trưởng VKL và vi tảo: Đo mật độ quang (OD tại bước sóng 680 nm), xác định nồng độ sắc tố chlorophyll a bằng phương pháp đo quang phổ huỳnh quang/hấp thụ sau khi chiết bằng dung môi, đếm mật độ tế bào trực tiếp bằng buồng đếm dưới kính hiển vi quang học Microscope BX51.
• Quan sát hình thái và siêu cấu trúc tế bào: Sử dụng kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) để theo dõi các tổn thương bề mặt tế bào, màng tế bào, nguyên sinh chất và cấu trúc màng thylakoid sau các khoảng thời gian phơi nhiễm (3, 6, 10 ngày).
• Đánh giá độc tính sinh thái (tính an toàn):
  • Thử nghiệm trên giáp xác Daphnia magna: Xác định tỷ lệ sống sót, bất động sau 24 giờ và 48 giờ phơi nhiễm theo hướng dẫn chuẩn (ISO 6341), tính toán giá trị $\text{LC}_{50}$.
  • Thử nghiệm trên bèo tấm Lemna minor: Đánh giá sự biến đổi tổng số cánh bèo, khối lượng sinh khối tươi và hàm lượng sắc tố quang hợp sau 5 ngày phơi nhiễm ($T_0$ và $T_5$) theo chuẩn OECD 221.
• Thử nghiệm trên mẫu nước hồ tự nhiên: Lấy mẫu nước phú dưỡng tại hồ Hoàn Kiếm và hồ Láng (nơi có quần thể vi khuẩn lam chiếm ưu thế, đặc biệt là các loài Microcystis). Thiết kế thí nghiệm gồm các lô đối chứng (không xử lý), đối chứng hóa chất ($\text{CuSO}_4$ nồng độ 5 µg/L) và các lô xử lý bằng cao chiết Mần tưới (cao tổng etanol, cao phân đoạn etyl axetat) ở hai quy mô:
  • Quy mô phòng thí nghiệm: Bình chứa dung tích 5L.
  • Quy mô ngoài trời: Bể chứa dung tích 300L (mô phỏng điều kiện tự nhiên).
• Phân tích chất lượng nước: Quan trắc các thông số thủy lý (nhiệt độ, pH, độ đục, oxy hòa tan DO) và thông số thủy hóa (tổng nitơ TN, tổng photpho TP, $\text{NH}_4^+$, $\text{NO}_3^-$, $\text{PO}_4^{3-}$) theo các phương pháp tiêu chuẩn phân tích môi trường nước.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan vấn đề nghiên cứu

Chương 1 tổng hợp các cơ sở lý luận và thực tiễn về hiện tượng phú dưỡng và sự phát triển bùng nổ của vi khuẩn lam độc trong các thủy vực nước ngọt. Tác giả chỉ ra rằng Microcystis aeruginosa là loài phổ biến nhất (chiếm trên 75–90% sinh khối nở hoa) và tổng hợp độc tố microcystin với hơn 80 biến thể cấu trúc, gây suy thoái hệ sinh thái nước ngọt và đe dọa sức khỏe cộng đồng.

Chương này phân tích các biện pháp kiểm soát VKL, từ các giải pháp cơ học (vớt váng, che sáng, pha loãng), vật lý (sóng siêu âm tần số > 20 kHz, tia cực tím UV-C bước sóng 254 nm) đến các giải pháp hóa học (sử dụng muối sắt, muối nhôm, $\text{CuSO}_4$, $\text{H}_2\text{O}_2$, $\text{KMnO}_4$, $\text{O}_3$, hóa chất diệt cỏ 2,4-D và vật liệu nano kim loại như nano bạc, nano đồng, nano sắt). Tác giả làm rõ các nhược điểm của biện pháp hóa học truyền thống như tính không chọn lọc (diệt cả tảo lục và động vật phù du), tích lũy kim loại nặng trong trầm tích đáy, nguy cơ "nhờn thuốc" và gây vỡ tế bào giải phóng ồ ạt microcystin ra nguồn nước.

Từ đó, chương tổng quan nhấn mạnh tiềm năng của giải pháp sinh học sử dụng dịch chiết/cao chiết thực vật chứa các hợp chất phenolic, quinone, alkaloid, axit béo, este và terpenoid. Phần cuối chương trình bày đặc điểm thực vật học, phân bố và thành phần hóa học của cây Mần tưới (Eupatorium fortunei Turcz.), loài cây chứa nhiều dẫn xuất thymol và terpenoid có hoạt tính sinh học kháng khuẩn.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc vật liệu, thiết bị và các quy trình thực nghiệm được triển khai trong luận án:

• Chuẩn bị sinh khối cây Mần tưới tươi, quy trình chiết xuất thu nhận cao tổng trong các dung môi (EtOH, MeOH, W) và chiết phân đoạn thu ba phân đoạn: hexan, etyl axetat và nước.
• Quy trình phân lập 07 hợp chất sạch từ phân đoạn etyl axetat qua sắc ký cột silica gel và Sephadex LH-20, kết hợp phân tích phổ $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, HSQC, HMBC, HR-ESI-MS để giải mã cấu trúc hóa học.
• Quy trình nuôi cấy đơn dòng và bố trí thí nghiệm phơi nhiễm chủng Microcystis aeruginosa TC3 và vi tảo lục Chlorella vulgaris dưới tác động của cao chiết tổng etanol, cao phân đoạn etyl axetat, cao phân đoạn nước và 07 chất sạch ở các dải nồng độ khác nhau (200 µg/mL, 500 µg/mL; dải 1,0–50,0 µg/mL cho chất sạch; đối chứng $\text{CuSO}_4$ 5 µg/L).
• Phương pháp chuẩn bị mẫu và chụp ảnh cấu trúc hiển vi, siêu cấu trúc tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).
• Quy trình đánh giá độc tính sinh thái trên giáp xác Daphnia magna (theo dõi tỷ lệ sống/chết sau 24h, 48h để xác định $\text{LC}_{50}$) và bèo tấm Lemna minor (theo dõi số cánh bèo, sinh khối tươi và sắc tố quang hợp sau 5 ngày).
• Thiết kế mô hình thử nghiệm trên mẫu nước tự nhiên hồ Hoàn Kiếm và hồ Láng (quy mô phòng thí nghiệm 5L và quy mô ngoài trời 300L), theo dõi định kỳ sinh khối thực vật nổi (chlorophyll a), mật độ tập đoàn Microcystis và diễn biến các thông số thủy lý, thủy hóa (DO, pH, TN, TP).

Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được của luận án, tập trung vào 4 nhóm nội dung chính:

1. Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất sạch từ cây Mần tưới

Từ cao chiết phân đoạn etyl axetat của cây Mần tưới (Eupatorium fortunei), luận án đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 07 hợp chất sạch:

Ký hiệu mẫu	Tên hợp chất	Phân loại / Tính mới	Phương pháp phổ nghiệm xác định cấu trúc
EfD4.1	7,8,9-trihydroxythymol	Dẫn xuất thymol (Hợp chất mới)	HR-ESI-MS, $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, HSQC, HMBC
EfD4.2	8,10-didehydro-7,9-dihydroxythymol	Dẫn xuất thymol (Hợp chất mới)	HR-ESI-MS, $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, HSQC, HMBC
EfD5	8,9,10-trihydroxythymol	Dẫn xuất thymol	$^1\text{H-NMR}$, so sánh tài liệu tham khảo
EfD1	Axit o-coumaric	Axit phenolic	$^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$
EfD10.1	4-(2-hydroxyethyl)benzaldehyde	Dẫn xuất benzaldehyde	Phổ NMR và đối chiếu phổ
EfD10.3	Kaempferol	Flavonoid	$^1\text{H-NMR}$, so sánh tài liệu tham khảo
EfD14.1	8,10-dihydroxy-9-acetoxythymol	Dẫn xuất thymol	$^1\text{H-NMR}$, so sánh tài liệu tham khảo

2. Khả năng ức chế sinh trưởng và diệt vi khuẩn lam độc của các cao chiết và chất sạch

• Hiệu quả của cao chiết tổng: Cao chiết tổng etanol Mần tưới thể hiện hoạt tính ức chế mạnh lên sinh trưởng của Microcystis aeruginosa TC3 theo cả 3 chỉ tiêu: mật độ quang $\text{OD}_{680}$, hàm lượng chlorophyll a và mật độ tế bào. Ở nồng độ 500 µg/mL, hiệu quả ức chế sinh trưởng (Inhibition Efficiency - IE) đối với M. aeruginosa đạt $\ge 90%$ sau 72 giờ.
• Tính chọn lọc đối với vi tảo lục: Khi thử nghiệm song song trên vi tảo lục Chlorella vulgaris, cao chiết tổng etanol và cao phân đoạn etyl axetat ở các nồng độ 200 và 500 µg/mL gây ảnh hưởng ức chế rất thấp lên C. vulgaris, chứng minh tính tác động chọn lọc cao đối với VKL độc.
• Hiệu quả của các cao chiết phân đoạn: Phân đoạn etyl axetat thể hiện hoạt tính ức chế M. aeruginosa vượt trội so với phân đoạn nước ở cùng nồng độ khảo sát (200 và 500 µg/mL).
• Hoạt tính của các chất sạch: Hai hợp chất mới được phân lập (7,8,9-trihydroxythymol và 8,10-didehydro-7,9-dihydroxythymol) ở dải nồng độ từ 1,0 đến 50,0 µg/mL cho hiệu quả ức chế sinh trưởng M. aeruginosa TC3 sau 72 giờ lần lượt là 39,1 ÷ 41,2% và 20,0 ÷ 25,0%.
• Tác động lên siêu cấu trúc tế bào: Ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) cho thấy tế bào M. aeruginosa ở mẫu đối chứng có màng và thành nguyên vẹn, các phiến thylakoid xếp lớp đều đặn. Dưới tác động của cao chiết Mần tưới (etanol và etyl axetat), màng thylakoid bị bóc tách khỏi tế bào chất, các phiến thylakoid bị gãy vụn, xuất hiện các khoang rỗng trong tế bào chất, thành tế bào bị biến dạng và chất nguyên sinh bị thoát ra ngoài. Trong khi đó, tế bào tảo lục C. vulgaris duy trì cấu trúc thành tế bào và lục lạp tương đối ổn định.

3. Đánh giá tính an toàn sinh thái của cao chiết Mần tưới

• Trên giáp xác Daphnia magna: Thử nghiệm phơi nhiễm 24 giờ và 48 giờ cho thấy giá trị $\text{LC}_{50}$ của cao chiết tổng etanol và cao chiết phân đoạn etyl axetat đối với D. magna cao hơn nhiều so với nồng độ tác dụng ức chế VKL, chứng minh mức độ an toàn cao hơn đối với động vật phù du so với các hóa chất diệt tảo vô cơ.
• Trên bèo tấm Lemna minor: Sau 5 ngày phơi nhiễm với cao chiết tổng etanol và cao phân đoạn etyl axetat, sự sinh trưởng của L. minor (tính theo tổng số cánh bèo, khối lượng sinh khối tươi $T_0 - T_5$ và hàm lượng sắc tố quang hợp) không có sự suy giảm nghiêm trọng ở dải nồng độ xử lý VKL.

4. Thử nghiệm trên mẫu nước hồ tự nhiên

• Quy mô phòng thí nghiệm (bình 5L, nước hồ Hoàn Kiếm và hồ Láng): Xử lý bằng cao chiết Mần tưới làm giảm mạnh sinh khối thực vật nổi (chlorophyll a) và làm suy giảm mật độ tập đoàn Microcystis sau 10 ngày ($T_{10}$). So với lô xử lý bằng $\text{CuSO}_4$ (5 µg/L), lô sử dụng cao chiết Mần tưới duy trì hàm lượng oxy hòa tan (DO) và giá trị pH ổn định hơn, không làm suy thoái đột ngột chất lượng nước.
• Quy mô ngoài trời (bể 300L, nước hồ Láng): Bổ sung cao chiết tổng etanol Mần tưới đạt hiệu quả ức chế sinh khối vi khuẩn lam độc trên 60% sau 10 ngày phơi nhiễm trong điều kiện tự nhiên, đồng thời các thông số thủy lý, thủy hóa của nước hồ được duy trì ở ngưỡng an toàn.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

1. Phân lập và giải mã cấu trúc hóa học của 02 hợp chất mới thuộc khung dẫn xuất thymol từ phân đoạn etyl axetat của cây Mần tưới (Eupatorium fortunei Turcz.) gồm: 7,8,9-trihydroxythymol (EfD4.1) và 8,10-didehydro-7,9-dihydroxythymol (EfD4.2), bổ sung dữ liệu phổ nghiệm và cấu trúc vào kho tàng hóa học các hợp chất thiên nhiên.
2. Xác định hoạt tính ức chế sinh trưởng của 02 chất mới trên đối với vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa TC3 trong dải nồng độ 1,0–50,0 µg/mL với hiệu quả ức chế đạt tương ứng 39,1 ÷ 41,2% và 20,0 ÷ 25,0% sau 72 giờ.
3. Làm sáng tỏ cơ chế tác động chọn lọc của cao chiết Mần tưới: Tác động gây tổn thương đặc hiệu lên siêu cấu trúc tế bào VKL M. aeruginosa (phá hủy màng thylakoid, biến dạng thành tế bào, giải phóng chất nguyên sinh) nhưng ít gây tổn hại đến vi tảo lục Chlorella vulgaris.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

1. Xác lập quy trình tạo cao chiết tổng và cao phân đoạn etyl axetat từ cây Mần tưới đạt hiệu quả ức chế sinh trưởng Microcystis aeruginosa $\ge 90%$ ở nồng độ 500 µg/mL trong điều kiện phòng thí nghiệm.
2. Chứng minh tính an toàn sinh thái của cao chiết Mần tưới khi ghi nhận độc tính lên giáp xác Daphnia magna và bèo tấm Lemna minor thấp hơn nhiều so với độc tính trên M. aeruginosa, an toàn hơn so với hóa chất diệt tảo truyền thống $\text{CuSO}_4$.
3. Ứng dụng thành công cao chiết Mần tưới để kiểm soát bùng phát vi khuẩn lam trong mẫu nước tự nhiên của hồ Hoàn Kiếm và hồ Láng ở quy mô 5L phòng thí nghiệm và đạt hiệu quả ức chế trên 60% ở quy mô ngoài trời 300L mà không làm xáo trộn tiêu cực các thông số thủy lý, thủy hóa của nước.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Đề xuất sử dụng cao chiết từ cây Mần tưới như một hoạt chất sinh học tự nhiên để kiểm soát hiện tượng phú dưỡng và tảo nở hoa tại các ao, hồ đô thị, thay thế cho việc sử dụng $\text{CuSO}_4$ và các hóa chất độc hại.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Thử nghiệm ngoài trời mới chỉ dừng lại ở quy mô thể tích 300L trên mẫu nước hồ Láng, chưa triển khai thử nghiệm diện rộng trên toàn bộ diện tích mặt nước hồ tự nhiên.
• Chưa khảo sát chi tiết tốc độ phân hủy sinh học và thời gian tồn lưu kéo dài của các dẫn xuất thymol trong nền trầm tích đáy hồ qua các mùa thời tiết khác nhau.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Tiếp tục mở rộng quy mô thử nghiệm thực địa tại các thủy vực nước ngọt tự nhiên có diện tích lớn.
• Nghiên cứu công nghệ bào chế, tối ưu hóa công thức chế phẩm sinh học từ cao chiết Mần tưới nhằm nâng cao tính ổn định của hoạt chất dưới tác động của nhiệt độ và ánh sáng mặt trời.
• Đánh giá ảnh hưởng lâu dài của chế phẩm lên chuỗi thức ăn thủy sinh và sự tích tụ sinh học trong các loài thủy sản.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo hữu ích cho các nhóm đối tượng sau:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên: Thuộc các chuyên ngành Kỹ thuật môi trường, Khoa học môi trường, Quản lý tài nguyên nước, Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Độc học sinh thái. Luận án cung cấp quy trình phân lập, bộ số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, 2D-NMR) của các dẫn xuất thymol và quy trình thử nghiệm sinh học chuẩn trên VKL, vi tảo, giáp xác và bèo tấm.
• Cơ quan quản lý môi trường và các đơn vị xử lý nước đô thị: Các đơn vị quản lý công viên, hồ cảnh quan đô thị (đặc biệt tại Hà Nội và các đô thị có hồ phú dưỡng) có thể tham khảo mô hình xử lý sinh học bằng thảo dược tự nhiên để kiểm soát hiện tượng bùng phát tảo nở hoa an toàn và bền vững.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phân lập được những hợp chất mới nào từ cây Mần tưới và hoạt tính của chúng ra sao?

Luận án đã tách chiết và xác định cấu trúc của 02 hợp chất mới thuộc khung thymol từ phân đoạn etyl axetat của cây Mần tưới (Eupatorium fortunei Turcz.) gồm: 7,8,9-trihydroxythymol (ký hiệu EfD4.1) và 8,10-didehydro-7,9-dihydroxythymol (ký hiệu EfD4.2). Trong dải nồng độ từ 1,0 đến 50,0 µg/mL, hai hợp chất này ức chế sinh trưởng của vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa TC3 với hiệu quả lần lượt là 39,1 ÷ 41,2% và 20,0 ÷ 25,0% sau 72 giờ phơi nhiễm.

2. Hiệu quả ức chế của cao chiết Mần tưới đối với Microcystis aeruginosa đạt mức bao nhiêu ở quy mô phòng thí nghiệm và ngoài trời?

Ở quy mô phòng thí nghiệm, cao chiết tổng etanol và cao chiết phân đoạn etyl axetat ở nồng độ 500 µg/mL đạt hiệu quả ức chế sinh trưởng M. aeruginosa TC3 $\ge 90%$ sau 72 giờ. Ở quy mô ngoài trời (bể 300L với mẫu nước hồ Láng), cao chiết tổng etanol đạt hiệu quả ức chế sinh khối thực vật nổi trên 60% sau 10 ngày phơi nhiễm.

3. Cao chiết Mần tưới có tác động chọn lọc như thế nào giữa vi khuẩn lam độc và các sinh vật thủy sinh khác?

Cao chiết Mần tưới thể hiện tính chọn lọc cao khi ức chế mạnh Microcystis aeruginosa TC3 nhưng ít ảnh hưởng đến vi tảo lục Chlorella vulgaris ở cùng nồng độ 200 và 500 µg/mL. Đồng thời, độc tính của cao chiết đối với giáp xác Daphnia magna và bèo tấm Lemna minor thấp hơn nhiều so với ngưỡng tác dụng lên VKL, không gây suy giảm nghiêm trọng sinh khối bèo hay gây chết hàng loạt giáp xác như hóa chất đồng sunphat.

4. Cơ chế tác động của cao chiết Mần tưới lên tế bào Microcystis aeruginosa được giải thích như thế nào qua ảnh TEM?

Quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) cho thấy cao chiết Mần tưới tấn công cấu trúc nội bào của M. aeruginosa: làm màng thylakoid bóc tách khỏi tế bào chất, phá vỡ hệ thống phiến thylakoid (nơi diễn ra quá trình quang hợp), tạo các khoảng rỗng trong tế bào chất, làm biến dạng và nứt vỡ thành tế bào khiến chất nguyên sinh tràn ra ngoài, dẫn đến tế bào VKL bị tiêu diệt.

5. Kết quả thử nghiệm trên mẫu nước hồ Hoàn Kiếm và hồ Láng cho thấy điều gì về chất lượng nước?

Thử nghiệm trên mẫu nước hồ Hoàn Kiếm và hồ Láng cho thấy cao chiết Mần tưới làm giảm mạnh mật độ tập đoàn Microcystis và hàm lượng chlorophyll a sau 10 ngày, tương đương hiệu lực của $\text{CuSO}_4$ (5 µg/L). Khác với $\text{CuSO}_4$ vốn làm suy giảm mạnh oxy hòa tan và gây biến động xấu thông số môi trường, các lô xử lý bằng cao chiết Mần tưới duy trì giá trị DO và pH ổn định, đảm bảo an toàn cho môi trường nước.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Phạm Thanh Nga đã nghiên cứu thành công tác dụng ức chế sinh trưởng của cao chiết cây Mần tưới (Eupatorium fortunei Turcz.) lên vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa trong các thủy vực nước ngọt. Đề tài đã phân lập và xác định cấu trúc 07 hợp chất sạch từ phân đoạn etyl axetat, trong đó có 02 hợp chất mới thuộc khung thymol, đồng thời làm sáng tỏ cơ chế phá hủy màng thylakoid và thành tế bào VKL thông qua quan sát siêu cấu trúc dưới kính hiển vi điện tử truyền qua. Kết quả thử nghiệm khẳng định cao chiết Mần tưới có tính ức chế chọn lọc cao, an toàn cho giáp xác Daphnia magna, bèo tấm Lemna minor, vi tảo lục Chlorella vulgaris và kiểm soát hiệu quả sinh khối VKL độc trong mẫu nước tự nhiên của hồ Hoàn Kiếm và hồ Láng ở quy mô phòng thí nghiệm và ngoài trời. Công trình cung cấp cơ sở khoa học và dữ liệu thực nghiệm quan trọng cho việc phát triển các chế phẩm nguồn gốc thảo mộc nhằm kiểm soát hiện tượng phú dưỡng và tảo nở hoa thân thiện với môi trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ô nhiễm môi trường không khí, nước và đất đã trở thành vấn đề hàng đầu, gióng hồi chuông cảnh báo về sự suy giảm chất lượng cuộc sống và sức khỏe con người không chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều nơi trên thế giới. Ô nhiễm nguồn nước mặt là đặc biệt nghiêm trọng khi nhiều nơi trên thế giới người dân không có nước sạch để sử dụng cho ăn uống và sinh hoạt kéo theo tỉ lệ tử vong và bệnh tật gia tăng vì sử dụng nguồn nước không đạt yêu cầu. Nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn đến ô nhiễm nguồn nước mặt như xả trực tiếp các nguồn nước thải công nghiệp, nước thải sinh hoạt mà không qua xử lý hoặc lạm dụng quá mức phân bón hóa học và thuốc bảo vệ thực vật trong sản xuất nông nghiệp để nâng cao sản lượng lương thực đáp ứng sự gia tăng dân số thế giới trong những thập kỉ gần đây. Hậu quả dẫn đến gia tăng nguồn dinh dưỡng (chủ yếu là nitơ và photpho) trong các thủy vực gây nên hiện tượng phú dưỡng mà kéo theo là “tảo nở hoa” hoặc “nở hoa của nước”.

Sự nở hoa của nước bản chất là sự phát triển ồ ạt của Vi khuẩn lam (VKL) và vi tảo, có khả năng sản sinh độc tố kéo theo sự nhiễm độc và cái chết của thủy hải sản, động vật nuôi, động vật hoang dã và con người [1]. Sự nở hoa của nước thường gây ra những tác động xấu lên môi trường như làm đục nước, tăng giá trị pH, giảm hàm lượng oxy hòa tan, tăng độc tố đặc biệt là độc tố microcystin. Kết quả điều tra ở các thủy vực nước ngọt cho thấy trong các loài VKL độc gây hiện tượng nở hoa nước thì Microcystis aeruginosa chiếm đến 90% và sản sinh ba loại độc tố nguy hiểm là độc tố gan (hepatotoxins), độc tố thần kinh (neurotoxins) và độc tố gây dị ứng da. Điều nghiêm trọng là tần suất xuất hiện các loài VKL độc ngày càng tăng làm ảnh hưởng đến sức khỏe con người và động vật nuôi, động vật hoang dã do sử dụng nguồn nước có VKL độc.

Do đó ngăn ngừa và giảm thiểu sự phát triển bùng nổ của VKL độc là vấn đề quan trọng cần phải được quan tâm. Các phương pháp xử lý ô nhiễm môi trường nước gây ra bởi VKL độc đã được nghiên cứu và áp dụng từ những phương pháp cơ học đơn giản như hớt váng, che sáng hay pha loãng nước hồ đến các phương pháp lý - hóa như dùng sóng siêu âm, sử dụng ánh sáng cực tím, hoặc sử dụng các hợp chất hóa học diệt tảo, các hợp chất 2 có tính oxi hóa cao, các kim loại và nano kim loại. Những phương pháp này bên cạnh những ưu điểm dễ thấy như hiệu quả tác động nhanh, rõ rệt trong thời gian ngắn nhưng còn tồn tại những hạn chế như tốn kém kinh phí triển khai hoặc gây ra sự ô nhiễm môi trường thứ cấp, tác động không chọn lọc lên các loài sinh vật do đó gây suy giảm đa dạng sinh học đặc biệt sử dụng hóa chất sau một thời gian quan sát thấy hiện tượng nhờn thuốc và vì thế chúng bị hạn chế triển khai ở quy mô thực tế. Do đó phương pháp sinh học dùng các cao chiết có nguồn gốc thực vật để ức chế sinh trưởng VKL đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu vì tính hiệu quả và thân thiện với môi trường.

Cây Mần tưới Eupatorium fortunei Turcz., thuộc họ Cúc (Asteraceae) là loài cây cỏ lâu năm, được sử dụng trong dân gian như một loại thuốc chữa bệnh và được chứng minh hoạt tính kháng khuẩn trong nhiều nghiên cứu khác nhau. Năm 2013, Nguyễn Tiến Đạt và cộng sự đã tiến hành khảo sát và so sánh hoạt tính diệt VKL độc M. aeruginosa của nhiều loại cao chiết từ các loài thực vật khác nhau tại Việt Nam cho thấy cao chiết cây Mần tưới có hiệu quả nhất để kiểm soát bùng nổ VKL độc [2]. Kết luận này được khẳng định bởi các công bố của Phạm Thanh Nga trong những năm tiếp theo [3].

Tuy nhiên đây mới chỉ là những nghiên cứu bước đầu khảo sát hoạt tính diệt VKL độc của cao chiết cây Mần tưới. Từ những lý do trên đề tài luận án tiến sỹ: “Nghiên cứu tác dụng ức chế của cao chiết cây Mần tưới (Eupatorium fortunei Turcz.) lên sinh trưởng của Vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa Kutzing trong các thủy vực nước ngọt” đã được lựa chọn để thực hiện. Luận án đã đặt ra mục tiêu như sau: Tạo được cao chiết thực vật ức chế hiệu quả sinh trưởng của Vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa. Luận án có tính chất kế thừa kết quả của những nghiên cứu trước và sẽ giải quyết nhiều vấn đề còn tồn tại.

Luận án đã đặt ra những nội dung như sau: 1. Xây dựng quy trình tạo cao chiết tổng, cao chiết phân đoạn, các chất sạch phân lập từ cây Mần tưới. Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng ức chế của cao chiết tổng Mần tưới lên sinh trưởng của M. aeruginosa và đánh giá an toàn sinh thái.

Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng ức chế của cao chiết phân đoạn etyl axetat và cao chiết phân đoạn nước Mần tưới lên sinh trưởng của M. aeruginosa và đánh giá an toàn sinh thái. Nghiên cứu phân lập và đánh giá hoạt tính diệt VKL độc M.aeruginosa của 07 hợp chất hóa học được phân lập từ cây Mần tưới. Nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng cao chiết để kiểm soát bùng nổ Vi khuẩn lam trong các mẫu nước hồ tự nhiên.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án Ô nhiễm môi trường nước, đặc biệt hiện tượng phú dưỡng kéo theo sự bùng phát sinh khối VKL với việc giải phóng độc tố microcystin đã nhận được nhiều sự quan tâm, nghiên cứu trong thời gian gần đây. Sử dụng cao chiết từ thực vật để kiểm soát bùng nổ sinh khối VKL thể hiện nhiều ưu điểm vượt trội so với các phương pháp truyền thống được áp dụng trước đây. Kết quả của luận án cung cấp cơ sở khoa học, chứng minh tính ưu việt khi áp dụng cao chiết thực vật như một hoạt chất ức chế và diệt chọn lọc VKL độc để kiểm soát bùng phát sinh khối VKL độc. Tính mới của luận án - Tách chiết được 02 chất mới (7,8,9 - trihydroxythymol và 8,10-didehydro-7,9- trihydroxythymol) và đánh giá tác động của 02 chất này lên M.

aeruginosa trong dải nồng độ từ 1,0 µg/mL đến 50,0 µg/mL với hiệu quả ức chế sinh trưởng ghi nhận từ 39,1÷41,2 % và 20,0 – 25,0 %, tương ứng sau 72 giờ. - Bước đầu ghi nhận khả năng ức chế sinh trưởng M. aeruginosa ≥ 90 % tại nồng độ 500 µg/mL ở quy mô phòng thí nghiệm và hiệu quả trên 60 % ở quy mô ngoài trời với mẫu nước hồ tự nhiên. Độc tính của cao chiết tổng etanol Mần tưới đối với Daphnia magna và Lemna minor ghi nhận là thấp hơn so với M.

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4 1. Vi khuẩn lam độc và hiện tượng phú dưỡng trong các thủy vực nước ngọt 1. Vi khuẩn lam độc (VKL) Vi khuẩn lam (Cyanobacteria, Cyanoprokaryota, Cyanophyta, Blue-green microalgae) là một trong những sinh vật xuất hiện trên Trái Đất cách đây hàng tỷ năm và mang nhiều tên gọi khác nhau trong quá trình nghiên cứu. Từ năm 1854, Kopp đã coi vi khuẩn và tảo lam là một nhóm có chung nguồn gốc phát sinh.

Theo những đặc điểm hình thái khác nhau, VKL được chia làm 4 bộ, Chlorococcales, Oscillatoriales, Nostocales và Stigonematales. Theo các tài liệu công bố, hiện nay có khoảng 100 loài VKL độc nước ngọt thuộc 40 chi trong đó Microcystis đặc biệt là Microcystis aeruginosa, một trong những chi thường gặp nhất phổ biến nhất với tỉ lệ trên 75 % [1, 4]. Microcystis aeruginosa có dạng tập đoàn, dạng hình cầu hoặc mắt lưới với các khoảng trống giữa các tế bào, tế bào phân bố trong tập đoàn có dạng hình cầu, màu xanh nhạt, xếp chồng lên nhau. Cấu trúc cơ thể, hình dạng và kích thước: Trong phân loại hiện đại, VKL và vi khuẩn có nhiều những nét chung như sinh vật chưa có nhân điển hình, chỉ có chất nhân và nhiễm sắc thể.

Màng tế bào cấu tạo từ murein một loại gluco aminopeptid trong tế bào chất có nhiều riboxom, có khả năng đồng hóa được N2 tự do và có khả năng quang hợp. Tế bào chứa sắc tố quang hợp và hấp thụ bước sóng từ 430-440 nm và từ 660-680 nm [5]. Ngược lại với vi tảo nhân thật, VKL không có màng nhân mà chỉ có lớp màng peptidoglycan và chứa ribosom loại 70 S [1]. Chi Microcystis thường tồn tại dưới dạng tập đoàn gồm hàng nghìn tế bào riêng lẻ có kích thước từ 3-10 µm dao động phụ thuộc vào từng loài.

Dinh dưỡng và sinh sản: Phần lớn VKL là những cơ thể quang tự dưỡng hiếu khí. VKL có khả năng dự trữ các chất dinh dưỡng thiết yếu và đồng hóa bên trong tế bào chất, có thể quan sát dưới kính hiển vi các hạt glycogen, giọt lipip, các hạt cyanophycin, các thể polyphosphate hay carboxysome. VKL chỉ sinh sản vô tính. Các loài dạng sợi thường sinh sản bằng cách phân đoạn các trichome hoặc hình thành các đoạn tảo (hormogonia).

Đoạn tảo là những đoạn sợi sinh sản phân biệt. Chúng được tạo thành nhờ chuyển động trượt và dần dần phát triển thành những trichome mới, các loài dạng sợi thường sinh sản bằng cách phân đoạn. 5 Phân bố VKL: Sự phân bố của VKL phụ thuộc vào nhiều yếu tố thủy văn và khí hậu của từng vùng đặc biệt là điều kiện dinh dưỡng của môi trường sống. Đa số các loài VKL trong tế bào đều chứa không bào khí.

Đó là các thể nội bào dạng túi chứa khí giúp điều khiển sự nổi của tế bào giúp cho chúng có ưu thế trong cạnh tranh ánh sáng và dinh dưỡng. VKL phân bố rộng, chúng có trong nước, đất, ở các nơi khô hạn, trên cây, băng tuyết. Độc tố VKL: Neurotoxin là nhóm các chất độc thần kinh, hợp chất độc hại nhất do VKL sản sinh ra và chúng can thiệp vào hệ thần kinh, gây tê liệt các cơ quan hô hấp, gây tử vong chỉ sau vài phút tác động. Độc tố LD50-24 h (Lethal dose, 50%) của các nhóm là khác nhau nhưng nhìn chung là rất độc dao động từ 10 đến 200 μg/kg, độc nhất phải kể đến Saxitoxin với LD50-24 h là 10 μg/kg, LD50 của nhóm Microcystin-LR là 50 μg/kg [6].

Microcystin là phân tử peptit có cấu trúc vòng, hiện nay ghi nhận hơn 80 loại biến thể cấu trúc, trong đó ba loại phổ biến nhất được trình bày tại hình 1. Microcystin có thể được tạo ra từ các loài thuộc chi Microcystis, Anabaena, Nostoc, Oscillatoria và Hapalosphon.