Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu sản xuất PHB từ vi khuẩn E. coli tái tổ hợp

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu công nghệ sinh học nghiên cứu sản xuất phb từ chủng vi khuẩn e coli tái tổ hợp, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện pháp hoàn thiện

• Tác giả: Võ Hoàng Thắng
• Người hướng dẫn: TS. Trần Hoàng Dũng
• Trường học: Đại Học Quốc Gia Tp. Hcm
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Sản Xuất PHB Từ Vi Khuẩn E. Coli Tái Tổ Hợp
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Tp. Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Giới thiệu về PHB và vi khuẩn E

Poly-β-hydroxybutyrate (PHB) là một loại polymer sinh học thuộc họ polyhydroxyalkanoate (PHA), được tổng hợp tự nhiên bởi một số loại vi khuẩn E. coli. PHB có đặc tính sinh học cao, dễ phân hủy và tương thích với cơ thể sống, làm cho nó trở thành một lựa chọn lý tưởng cho các ứng dụng trong y học và công nghiệp. Việc sản xuất PHB từ vi khuẩn E. coli tái tổ hợp đã thu hút sự quan tâm lớn trong lĩnh vực công nghệ sinh học do khả năng sinh tổng hợp cao và chi phí sản xuất thấp. Theo nghiên cứu, vi khuẩn E. coli tái tổ hợp có thể đạt được tỷ lệ PHB lên tới 90% trọng lượng khô tế bào, cao hơn nhiều so với các chủng tự nhiên. Điều này cho thấy tiềm năng lớn của công nghệ sinh học trong việc phát triển các phương pháp sản xuất PHB hiệu quả và bền vững.

II. Quy trình sản xuất PHB từ vi khuẩn E

Quy trình sản xuất PHB từ vi khuẩn E. coli tái tổ hợp bao gồm nhiều bước quan trọng. Đầu tiên, quá trình sinh tổng hợp được tối ưu hóa thông qua việc điều chỉnh các yếu tố môi trường như pH, nồng độ carbon và nitrogen. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng pH tối ưu cho sự sinh trưởng của vi khuẩn E. coli là 7.0, điều này giúp tăng cường khả năng sinh tổng hợp PHB. Tiếp theo, phương pháp Plackett-Burman và RSM (phương pháp đáp ứng bề mặt) được áp dụng để xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sản lượng PHB. Các yếu tố như mật rỉ đường, thời gian nuôi cấy và pH được xác định là có tác động mạnh nhất đến sản lượng PHB. Cuối cùng, việc thu hồi và tinh sạch PHB được thực hiện qua các phương pháp hóa học như sử dụng sodium hypochlorite và chloroform, nhằm đảm bảo chất lượng của sản phẩm cuối cùng.

III. Ứng dụng và tiềm năng của PHB trong công nghiệp

PHB có nhiều ứng dụng tiềm năng trong các lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là trong sản xuất nhựa phân hủy sinh học. Với tính chất tự hủy sinh học và khả năng tương thích sinh học cao, PHB có thể thay thế các loại nhựa truyền thống trong nhiều ứng dụng như bao bì, sản phẩm y tế và nông nghiệp. Việc sản xuất PHB từ vi khuẩn E. coli tái tổ hợp không chỉ giúp giảm chi phí sản xuất mà còn góp phần bảo vệ môi trường bằng cách giảm thiểu lượng nhựa không phân hủy được thải ra. Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới cho ngành công nghiệp nhựa, giúp phát triển các sản phẩm thân thiện với môi trường và bền vững hơn.

IV. Kết luận và khuyến nghị

Nghiên cứu sản xuất PHB từ vi khuẩn E. coli tái tổ hợp cho thấy tiềm năng lớn trong việc phát triển các quy trình sản xuất bền vững và hiệu quả. Việc tối ưu hóa các yếu tố môi trường và cải tiến quy trình sản xuất sẽ giúp tăng cường năng suất và giảm chi phí. Để đạt được những mục tiêu này, cần có thêm nhiều nghiên cứu sâu hơn về các chủng vi khuẩn khác nhau cũng như các nguồn nguyên liệu thay thế. Hướng nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc cải thiện khả năng sinh tổng hợp của các chủng vi khuẩn thông qua kỹ thuật tái cấu trúc gen và các phương pháp sinh học phân tử hiện đại.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Công nghệ lên men. Khái quát về quá trình lên men. “Lên men” có nguồn gốc từ từ Latinh “fervere”, nghĩa là sự sôi do hoạt động của nấm men trong dịch chiết quả hoặc malt nghiền.

Trong hóa sinh, lên men có nghĩa là sự tạo thành năng lượng nhờ quá trình dị hóa các hợp chất hữu cơ. Trong công nghệ sinh học, lên men được sử dụng để chỉ việc nuôi cấy các vi sinh vật kị khí và hiếu khí để sinh tổng hợp nên các sản phẩm mong muốn[4,31]. Quá trình lên men là quá trình phân giải carbohydrate trong điều kiện kị khí. Bắt đầu quá trình lên men, các hợp chất chứa carbohydrate được phân giải thành glucose, trải qua quá trình chuyển hóa, sản phẩm cuối cùng được tạo thành là CO2 và một số hợp chất carbon chưa được oxy hóa hoàn toàn như ethanol, acid acetic, ketone, …Người ta thường dùng tên sản phẩm điển hình tích lũy trong từng loại lên men để gọi quá trình lên men ấy.

Chẳng hạn như quá trình lên men tích lũy chủ yếu acid lactic được gọi là quá trình lên men lactic[5]. Một số vi sinh vật hiếu khí có khả năng oxy hóa cơ chất trong điều kiện hiếu khí, nhưng lại tạo ra những sản phẩm chưa được oxy hóa hoàn toàn giống quá trình trình lên men kị khí như acid acetic, keto acid, … Quá trình này dù cũng được gọi là lên men nhưng thực chất là quá trình oxy hóa hiếu khí. Rất nhiều quá trình oxy hóa không hoàn toàn có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp lên men vì tạo ra những sản phẩm có giá trị[5]. Phương pháp lên men.

Lên men theo mẻ. Lên men theo mẻ là phương pháp mà trong suốt quá trình lên men, ta không bổ sung thêm chất dinh dưỡng vào môi trường, cũng không loại bỏ các sản phẩm cuối của quá trình trao đổi chất. Trong lên men theo mẻ, vi sinh vật phải trải qua các giai đoạn sinh trưởng: pha lag, pha log, pha cân bằng và pha suy vong [29]. 8 Pha lag là giai đoạn đầu, khi vi sinh vật mới được đưa vào môi trường nuôi cấy mới, sự tăng sinh tế bào xảy ra không đáng kể.

Lúc này, vi sinh vật bắt đầu thích ứng với môi trường mới và bắt đầu tổng hợp các chất cần cho sự sinh trưởng. Các loài vi sinh vật khác nhau có độ dài pha lag khác nhau. Pha lag cũng có thể kéo dài nếu giống cấy ban đầu quá lâu hoặc đã được đông lạnh. Trong sản xuất, để hệ thống lên men nhanh chóng bước vào pha tăng trường và tổng hợp sản phẩm, cần rút ngắn thời gian pha lag càng ngắn càng tốt [29].

Pha log là pha vi sinh vật sinh trưởng và phân chia mạnh. Tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nguồn dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy và sản phẩm tạo ra từ quá trình trao đổi chất của vi sinh vật [29]. Trong pha cân bằng, sự tăng sinh tế bào bắt đầu chậm lại, số lượng tế bào duy trì ở mức ổn định do số tế bào sinh ra bằng số tế bào chết đi, hoặc do tế bào ngừng phân chia dù vẫn còn hoạt động trao đổi chất. Một trong những nguyên nhân khiến vi sinh vật bắt đầu chuyển sang pha cân bằng là do sự giới hạn một yếu tố dinh dưỡng nào đó trong môi trường.

Đây chính là giai đoạn mà sự sinh tổng hợp PHB ở Ralstonia eutropha diễn ra mạnh. Các sản phẩm thừa tạo ra từ quá trình trao đổi chất của vi sinh vật cũng có thể làm sự tăng trưởng giảm. Chẳng hạn như R. eutropha có thể sản sinh nhiều butyric và các acid hữu cơ khác trong pha tăng trưởng, điều này khiến pH môi trường giảm, làm ức chế sự sinh trưởng của tế bào [29].

Pha suy vong, số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo lũy thừa do sự cạn kiệt dinh dưỡng và tích lũy một số sản phẩm độc hại cho vi sinh vật, một số enzyme phân giải tế bào. Ở Ralstonia eutropha, tốc độ suy vong có thể giảm trong trường hợp vi khuẩn sử dụng nguồn năng lượng dự trữ là PHB tích lũy trong tế bào [29]. Phương pháp này có một số ưu điểm là đơn giản, dễ tiến hành do không phải bổ sung thêm bất kỳ thành phần nào trong quá trình vận hành, giảm khả năng bị nhiễm, thu hồi sản phẩm đạt mức tối ưu, giảm chi phí sản xuất. Tuy nhiên, phương pháp này cho sản lượng thấp do vi sinh vật không được cung cấp thêm nguồn dinh dưỡng nên nhanh chóng bước vào pha suy vong khi nguồn cơ chất cạn kiệt, giữa các mẻ nuôi phải ngắt quãng thời gian [4].

Lên men theo mẻ có bổ sung (lên men fed-batch). Trong hệ thống lên men này, môi trường mới được bổ sung liên tục theo giai đoạn vào bình nuôi nhưng không loại bỏ dịch nuôi khỏi bình cho đến khi kết thúc quá trình lên men. Phương pháp này có ưu điểm là giữ được các điều kiện trong quá trình nuôi cấy, tránh được việc cạn kiệt nguồn dinh dưỡng và hạn chế ảnh hưởng của các sản phẩm độc trong môi trường [4]. Lên men liên tục.

Môi trường được bổ sung liên tục vào bình lên men, đồng thời lấy ra dịch lên men để thu nhận sản phẩm theo từng giai đoạn đã định trước. Lên men liên tục có ưu điểm là làm cho tốc độ sinh trưởng riêng của vi sinh vật cao, thu được lượng sinh khối cao, tiết kiệm do không có thời gian chết và tối ưu dễ dàng điều kiện nuôi cấy bằng cách thêm chất dự trữ hoặc thay đổi các thông số. Tuy nhiên, phương pháp này cũng có một số nhược điểm như dễ bị tạp nhiễm, dễ xảy ra hiện tượng đột biến, … [4]. Đối với quá trình lên men gồm hai giai đoạn là tăng trưởng và sinh tổng hợp PHB như ở R.

eutropha, lên men liên tục có thể đạt năng suất không cao bằng lên men theo mẻ hay lên men theo mẻ có bổ sung do tế bào luôn ở trạng thái pha log [29]. Nhựa phân huỷ sinh học. Sơ lược về nhựa phân huỷ sinh học. Nhựa phân huỷ sinh học là những polymer có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp, có đặc tính dễ bị phân huỷ hoàn toàn bởi các tác nhân sinh học như vi khuẩn, nấm.

Qúa trình phân huỷ xảy ra trong điều kiện hiếu khí hoặc yếm khí, phân cắt polymer thành các đơn phân, sau đó tiếp tục chuyển hoá bởi hệ emzim của vi sinh vật tạo sản phẩm cuối cùng là CO2 và H2O. Có thể phân loại thành 2 nhóm lớn sau:  Nhựa phân huỷ sinh học tổng hợp: điển hình là các polymer thuộc nhóm poly – α-hydroxyalkanoic acid như poly lactic-glycolic acid (PLA), poly glycolic acid (PGA), dạng đồng trung hợp poly lactic-glycolic acid (PLGA)…Đây là những polymer được tổng hợp hoá học từ các đơn phân là vật liệu sinh học như lactic acid, glycolic acid. Đây là các polymer có nguồn gốc tự nhiên được tổng hợp trong tế bào của nhiều loại vi khuẩn. Nhựa phân huỷ sinh học tổng hợp.

 Poly glycolic acid (PGA). PGA là một polyester mạch thẳng đơn giản nhất từ các đơn phân glycolic acid PGA có độ bền cao, nhiệt độ nóng chảy 220-2250C và khó hoà tan trong các dung môi hữu cơ ngoại trừ hexafluoroisopropanol. PGA được hình thành do phản ứng trung hợp mở vòng glycolide, một dạng nhị phân của glycolic acid, nên PGA còn được gọi với tên thông thường là polu glycolide [9]  Poly lactic acid (PLA). PLA là một loại polyester phân huỷ sinh học được sử dụng rất phổ biến đặc biệt trong y học.

Do có độ mềm dẻo hơn PGA, PLA rất thích hợp để sử dụng làm vỏ bọc cho các loại thuốc sử dụng dần trong cơ thể. Ngoài ra, PLA còn được sử dụng làm mô cấy thay thế trong cơ thể người cũng như thay thế nhựa truyền thống trong nhiều ứng dụng khác. PLA được hình thành từ phản ứng trung hợp mở vòng lactide, một dạng nhị phân của lactic nên PLA còn được gọi với tên thông thường là poly lactide[9]. Nhựa phân huỷ sinh học tự nhiên.

Đa số các loại nhựa phân huỷ sinh học tự nhiên thuộc nhóm poly-β- hydroxyalkanoic acid (PHA) hay còn gọi với một tên khác là poly-β-hydroxyalkanoate. Đây là những polyester của các đơn phân hydroxyalkanoic acid, với công thức tổng quát là: Hình 1.Công thức cấu trúc tổng quát của PHA [9] PHA được tổng hợp ở nhiều loài vi khuẩn Gram dương và Gram âm như nguồn dự trữ carbon dưới dạng các vi thể trong tế bào chất khi điều kiện dinh dưỡng (nguồn nitơ, phosphate và các loại khoáng khác) bị hạn chế. Với các đặc tính tương tự nhựa 11 truyền thống và ưu thế dễ phân huỷ sinh học, PHA được ứng dụng rất nhiều trong y học và công nghiệp. Có khoảng 150 loại PHA khác nhau được ghi nhận, trong đó chú ý nhất là poly-β-hydroxybutyrate (PHB) và dạng đồng trung hợp poly-β- hydroxybutyrate- valerate (PHBV).

Tổng quan về PHB. Poly –β-hydroxybutyrate (PHB) là loại polymer sinh học thuộc nhóm PHA. Nó được phát hiện trong Bacillus megaterium vào năm 1926 bởi nhà khoa học người Pháp Lemoige [25]. Cấu trúc và đặc tính lí hóa của PHB.

PHB là polyester được tế bào tích lũy dưới dạng thể vùi lipid. Thành phần thể vùi PHB gồm khoảng 97 – 98% PHB, 2% protein và 0,5% lipid [33]. Với công thức hóa học (C4H6O2)n , cấu trúc phân tử PHB được thể hiện trong hình 1.Công thức cấu trúc tổng quát của PHB[17] PHB có một số đặc tính lí hóa sau: - Khối lượng phân tử 100 000 – 800 000 Da. - PHB không tan trong nước và có sức chống chịu tương đối với các phản ứng thủy phân.

Đây chính là điểm khác biệt của PHB so với các loại nhựa phân hủy sinh học khác, hầu hết tan trong nước hoặc nhạy độ ẩm. - PHB không bị phá vỡ cấu trúc bởi tia UV nhưng rất dễ bị hủy bởi acid hoặc base và dễ tan trong các dung môi hữu cơ như chloroform, methylene chloride, … - Khả năng khuếch tán oxygen tương đối kém. Nhờ tính chất này mà các sản phẩm bao bì đựng thực phẩm làm từ PHB có thể hạn chế sự oxygen hóa gây hỏng thực phẩm. - Tính tương thích sinh học cao nên rất thích hợp để ứng dụng trong y học.

- Có khả năng chịu lực căng khoảng 40Mpa, tương đương với polypropylene. - Nhanh chóng bị phân hủy trong tự nhiên và thân thiện với môi trường, PHB đang được quan tâm như một loại vật liệu mới thay thế cho các loại nhựa từ dầu mỏ như polyetylene (PE), polypropylene (PP),… bởi PHB mang những đặc tính tương tự như các loại nhựa truyền thống.1 cho thấy PHB dù cứng và dễ gãy hơn nhưng trong hầu hết các đặc tính khác thì loại polymer này tốt hơn hoặc tương đương với PP [3].