Luận văn về quá trình lên men fed batch corynebacterium glutamicum và sản xuất L-lysine

Luận văn nghiên cứu quá trình lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum nhằm thu nhận L-lysine, một amino acid thiết yếu trong thức ăn chăn nuôi.

• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu quá trình lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum để sản xuất L-lysine
• Loại tài liệu: Luận văn tốt nghiệp

Mục lục chi tiết

• Lời cam đoan
• Lời cảm ơn
• MỞ ĐẦU
• 1. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
• 3. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC
• P.1. DANH MỤC CÁC BẢNG
• P.2. DANH MỤC CÁC HÌNH

Tóm tắt

I. Giới thiệu về quá trình lên men

Quá trình lên men là một phương pháp sinh học quan trọng trong sản xuất các sản phẩm hữu ích như amino acid, đặc biệt là L-lysine. Corynebacterium glutamicum là một trong những vi sinh vật chủ yếu được sử dụng trong quá trình này. Quá trình lên men diễn ra trong điều kiện kỵ khí, nơi vi sinh vật phân giải carbohydrate thành các sản phẩm như CO2 và ethanol. Việc hiểu rõ về quá trình lên men và các yếu tố ảnh hưởng đến nó là rất cần thiết để tối ưu hóa sản xuất. Theo nghiên cứu, việc áp dụng công nghệ fed batch có thể cải thiện đáng kể năng suất sản phẩm. "Quá trình lên men là một chuỗi các phản ứng sinh hóa phức tạp, trong đó vi sinh vật chuyển hóa các chất dinh dưỡng thành sản phẩm mong muốn".

1.1. Các hình thức lên men

Có nhiều hình thức lên men khác nhau, bao gồm lên men theo mẻ (batch), lên men liên tục và lên men fed-batch. Mỗi hình thức có ưu điểm và nhược điểm riêng. Lên men theo mẻ thường cho sản lượng thấp do không bổ sung dinh dưỡng trong suốt quá trình. Ngược lại, lên men liên tục duy trì pha log bằng cách bổ sung liên tục dinh dưỡng, nhưng có thể gặp khó khăn trong việc kiểm soát tạp nhiễm. Lên men fed-batch là hình thức kết hợp giữa hai phương pháp trên, cho phép bổ sung dinh dưỡng trong suốt quá trình mà không làm thay đổi thể tích dịch lên men quá nhiều. "Việc lựa chọn hình thức lên men phù hợp là rất quan trọng để đạt được năng suất tối ưu trong sản xuất L-lysine".

II. Đặc điểm của Corynebacterium glutamicum

Corynebacterium glutamicum là một vi sinh vật gram dương, có khả năng sinh tổng hợp các amino acid, đặc biệt là L-lysine. Vi sinh vật này có đặc điểm sinh lý và sinh hóa đặc biệt, cho phép nó phát triển tốt trong môi trường nuôi cấy. Nghiên cứu cho thấy rằng Corynebacterium glutamicum có khả năng sử dụng nhiều loại cơ chất khác nhau, từ glucose đến các nguồn carbon khác. "Đặc điểm sinh lý của Corynebacterium glutamicum cho phép nó phát triển mạnh mẽ trong điều kiện nuôi cấy khác nhau, từ đó tối ưu hóa quá trình sản xuất L-lysine". Việc hiểu rõ về đặc điểm này sẽ giúp cải thiện quy trình sản xuất và nâng cao năng suất.

2.1. Đặc điểm hình thái và phân loại

Corynebacterium glutamicum có hình thái đặc trưng với tế bào hình que, thường xuất hiện trong các cụm. Việc phân loại vi sinh vật này dựa trên các đặc điểm hình thái, sinh lý và di truyền. Nghiên cứu cho thấy rằng các chủng khác nhau của Corynebacterium có thể có khả năng sinh tổng hợp L-lysine khác nhau. "Sự phân loại chính xác các chủng vi sinh vật là cần thiết để lựa chọn giống phù hợp cho quá trình sản xuất L-lysine".

III. Kỹ thuật lên men fed batch

Kỹ thuật lên men fed-batch là một phương pháp hiệu quả trong sản xuất L-lysine từ Corynebacterium glutamicum. Phương pháp này cho phép bổ sung dinh dưỡng trong suốt quá trình nuôi cấy, giúp duy trì pha log lâu hơn và tăng năng suất sản phẩm. Nghiên cứu cho thấy rằng lên men fed-batch có thể đạt được năng suất cao hơn so với lên men theo mẻ. "Việc áp dụng kỹ thuật fed-batch trong sản xuất L-lysine đã chứng minh được hiệu quả vượt trội trong việc tối ưu hóa năng suất và chất lượng sản phẩm". Điều này mở ra hướng đi mới cho ngành công nghiệp sản xuất amino acid.

3.1. Quy trình thực hiện

Quy trình lên men fed-batch bao gồm các bước chuẩn bị môi trường, nạp giống vi sinh vật, và bổ sung dinh dưỡng theo thời gian. Việc kiểm soát nồng độ dinh dưỡng và các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ là rất quan trọng để đảm bảo quá trình lên men diễn ra thuận lợi. "Quá trình bổ sung dinh dưỡng cần được thực hiện một cách chính xác để tránh tình trạng ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật". Nghiên cứu cho thấy rằng việc tối ưu hóa quy trình này có thể dẫn đến sự gia tăng đáng kể trong sản lượng L-lysine.

IV. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng việc áp dụng kỹ thuật lên men fed-batch đã cải thiện đáng kể năng suất sản xuất L-lysine từ Corynebacterium glutamicum. Các thí nghiệm cho thấy rằng việc tối ưu hóa môi trường nuôi cấy và điều kiện lên men đã dẫn đến sự gia tăng sản lượng lên đến 20% so với phương pháp truyền thống. "Kết quả này không chỉ khẳng định tính khả thi của phương pháp fed-batch mà còn mở ra cơ hội cho việc phát triển quy trình sản xuất L-lysine quy mô lớn". Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng về amino acid trong ngành công nghiệp thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.

4.1. Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu này không chỉ có giá trị về mặt lý thuyết mà còn có ý nghĩa thực tiễn lớn. Việc cải thiện quy trình sản xuất L-lysine từ Corynebacterium glutamicum sẽ giúp giảm chi phí sản xuất và nâng cao chất lượng sản phẩm. "Sự phát triển của công nghệ lên men fed-batch có thể tạo ra những bước tiến mới trong ngành công nghiệp sản xuất amino acid, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường". Điều này sẽ góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành công nghiệp thực phẩm và nông nghiệp.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

L-lysine là một amino acid không thay thế, đóng vai trò thiết yếu trong sự phát triển và sinh trưởng của người và động vật. Theo ước tính, nhu cầu L-lysine toàn cầu hàng năm đạt khoảng 600.000 tấn, trong đó sản lượng sử dụng làm phụ gia thực phẩm đạt gần 550.000 tấn với tốc độ tăng trưởng 7-10% mỗi năm. Thiếu hụt L-lysine gây ra nhiều vấn đề sức khỏe như giảm tổng hợp protein, chậm lớn ở trẻ em và giảm hiệu quả tiêu hóa. Việc sản xuất L-lysine bằng công nghệ vi sinh, đặc biệt sử dụng vi khuẩn Corynebacterium glutamicum, được xem là hướng đi hiệu quả và bền vững.

Luận văn tập trung nghiên cứu quá trình lên men fed-batch sử dụng chủng Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 nhằm tối ưu hóa môi trường lên men và nâng cao năng suất thu nhận L-lysine. Phạm vi nghiên cứu bao gồm tối ưu hóa môi trường lên men batch và thử nghiệm lên men fed-batch ở quy mô phòng thí nghiệm. Mục tiêu cụ thể là cải thiện các thông số lên men để tăng lượng L-lysine thu được, đồng thời xác định thời điểm và nồng độ bổ sung cơ chất phù hợp.

Nghiên cứu có ý nghĩa khoa học trong việc khẳng định ưu điểm của kỹ thuật lên men fed-batch so với các phương pháp truyền thống, đồng thời góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất L-lysine trong thực tiễn công nghiệp, đặc biệt tại Việt Nam, nơi quy trình sản xuất còn chủ yếu ở quy mô phòng thí nghiệm với năng suất thấp.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Lý thuyết sinh trưởng vi sinh vật: Mô hình tăng trưởng theo pha lag, log, cân bằng và suy vong, với phương trình tăng trưởng cấp số nhân $\frac{dx}{dt} = \mu x$ và mô hình Monod mô tả sự phụ thuộc tốc độ sinh trưởng vào nồng độ cơ chất.
• Mô hình lên men fed-batch: Kỹ thuật lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất gián đoạn hoặc liên tục, giúp duy trì nồng độ cơ chất ổn định, tránh ức chế do nồng độ cao và kéo dài pha log.
• Cơ chế sinh tổng hợp L-lysine: Quá trình chuyển hóa glucose thành L-lysine qua chuỗi phản ứng sinh hóa, trong đó enzyme aspartate kinase do gen lysC mã hóa đóng vai trò then chốt, chịu sự ức chế ngược bởi methionine và threonine.

Các khái niệm chính bao gồm: lên men batch, lên men liên tục, lên men fed-batch, enzyme aspartate kinase, nồng độ cơ chất ức chế, và các yếu tố môi trường như pH, oxy hòa tan, nguồn carbon và nitơ.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Chủng vi khuẩn Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 được lấy từ Trung tâm lưu giữ giống vi sinh vật Đại học Quốc Gia Hà Nội. Các hóa chất và thiết bị được chuẩn bị theo tiêu chuẩn phòng thí nghiệm.
• Phương pháp phân tích: Sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm Plackett-Burman để sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng, tiếp theo là thiết kế bề mặt đáp ứng (RSM-CCD) để tối ưu hóa môi trường lên men. Định lượng L-lysine bằng phương pháp đo mật độ quang với thuốc thử ninhydrin, định lượng đường khử bằng phương pháp DNS.
• Timeline nghiên cứu:
  • Khảo sát đặc điểm sinh học và khả năng đồng hóa nguồn carbon, nitơ.
  • Thí nghiệm sàng lọc và tối ưu hóa môi trường lên men batch.
  • Xác định thời điểm và nồng độ bổ sung cơ chất.
  • Thử nghiệm lên men fed-batch thu nhận L-lysine.
  • Phân tích dữ liệu và đánh giá kết quả.

Cỡ mẫu thí nghiệm được bố trí theo ma trận thiết kế với các mức biến đổi phù hợp, đảm bảo tính lặp lại và độ tin cậy của kết quả.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Đặc điểm sinh học của chủng Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632: Chủng có khuẩn lạc tròn đầy, màu vàng nhạt, tế bào dạng que ngắn xếp hình chữ V, Gram dương (+), có enzyme catalase, đồng hóa tốt nhiều nguồn carbon (glucose, sucrose, fructose, maltose) và nguồn nitơ (ure, peptone, (NH4)2SO4).
2. Yếu tố ảnh hưởng lớn đến sản lượng L-lysine: Qua thí nghiệm sàng lọc, hai yếu tố có ảnh hưởng đáng kể là (NH4)2SO4 và dịch bắp với giá trị P lần lượt là 0,021 và 0,029, chiếm ảnh hưởng lớn nhất trong 8 yếu tố khảo sát.
3. Môi trường lên men tối ưu: Thiết kế bề mặt đáp ứng xác định lượng L-lysine tối đa đạt khoảng 38,24 g/L khi (NH4)2SO4 và dịch bắp được điều chỉnh ở mức phù hợp. Mô hình hồi quy có hệ số phù hợp r2 = 99,17%, cho thấy độ chính xác cao.
4. Thời điểm bổ sung cơ chất: Xác định thời điểm bắt đầu bổ sung cơ chất là khi lượng đường trong môi trường giảm xuống dưới ngưỡng 20-30 g/L, giúp duy trì pha log kéo dài và tăng sản lượng L-lysine.
5. So sánh lên men batch và fed-batch: Lên men fed-batch cho năng suất L-lysine cao hơn đáng kể so với lên men batch, với lượng L-lysine tăng khoảng 15-20% và giảm lượng đường sót trong môi trường.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tối ưu hóa môi trường lên men, đặc biệt là điều chỉnh nồng độ (NH4)2SO4 và dịch bắp, có vai trò quyết định trong việc nâng cao năng suất L-lysine. Điều này phù hợp với các nghiên cứu quốc tế, trong đó nguồn nitơ và carbon là các yếu tố chính ảnh hưởng đến sinh trưởng và sinh tổng hợp amino acid.

Việc áp dụng kỹ thuật lên men fed-batch giúp duy trì nồng độ cơ chất ổn định, tránh ức chế do nồng độ cao và kéo dài pha sinh trưởng nhanh của vi khuẩn. Kết quả này tương đồng với các báo cáo của các tác giả nước ngoài, như năng suất L-lysine đạt 120 g/L sau 30 giờ lên men trong điều kiện fed-batch.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh lượng L-lysine và lượng đường sót giữa các phương pháp lên men batch và fed-batch, cũng như bảng phân tích phương sai mô hình hồi quy để minh họa mức độ ảnh hưởng của các yếu tố môi trường.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng quy trình lên men fed-batch với kiểm soát nồng độ cơ chất: Bổ sung cơ chất gián đoạn hoặc liên tục để duy trì nồng độ glucose trong khoảng 20-30 g/L nhằm tối ưu hóa pha log, tăng sản lượng L-lysine. Thời gian thực hiện: ngay trong giai đoạn sản xuất quy mô phòng thí nghiệm và mở rộng công nghiệp. Chủ thể thực hiện: các nhà sản xuất và phòng thí nghiệm nghiên cứu.
2. Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men: Ưu tiên điều chỉnh nồng độ (NH4)2SO4 và dịch bắp theo các thông số tối ưu đã xác định để tăng hiệu suất sinh tổng hợp L-lysine. Thời gian thực hiện: trong các giai đoạn chuẩn bị môi trường và thử nghiệm. Chủ thể thực hiện: kỹ thuật viên và nhà nghiên cứu.
3. Kiểm soát pH và oxy hòa tan tự động: Sử dụng hệ thống điều khiển tự động để duy trì pH ở mức 7,0 và cung cấp oxy đầy đủ nhằm đảm bảo điều kiện sinh trưởng tối ưu cho Corynebacterium glutamicum. Thời gian thực hiện: trong toàn bộ quá trình lên men. Chủ thể thực hiện: nhà máy sản xuất và phòng thí nghiệm.
4. Đào tạo kỹ năng vận hành thiết bị lên men fed-batch: Nâng cao năng lực vận hành và kiểm soát quá trình lên men để giảm thiểu tạp nhiễm và tăng tính ổn định của sản phẩm. Thời gian thực hiện: liên tục trong quá trình chuyển giao công nghệ. Chủ thể thực hiện: cán bộ kỹ thuật và quản lý sản xuất.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành công nghệ sinh học, vi sinh vật: Nghiên cứu cung cấp kiến thức chuyên sâu về kỹ thuật lên men fed-batch và tối ưu hóa môi trường lên men, hỗ trợ phát triển các đề tài liên quan đến sản xuất amino acid.
2. Doanh nghiệp sản xuất amino acid và phụ gia thức ăn chăn nuôi: Tham khảo để cải tiến quy trình sản xuất L-lysine, nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm, giảm chi phí nguyên liệu và vận hành.
3. Cơ quan quản lý và phát triển công nghiệp sinh học: Sử dụng làm tài liệu tham khảo trong việc xây dựng chính sách hỗ trợ phát triển công nghệ lên men vi sinh và sản xuất amino acid trong nước.
4. Các trung tâm lưu giữ và phát triển giống vi sinh vật: Áp dụng kết quả nghiên cứu để lựa chọn và phát triển chủng vi khuẩn có năng suất cao, ổn định trong sản xuất công nghiệp.

Câu hỏi thường gặp

1. Lên men fed-batch khác gì so với lên men batch truyền thống?
   Lên men fed-batch bổ sung cơ chất trong quá trình lên men, duy trì nồng độ dinh dưỡng ổn định, giúp kéo dài pha sinh trưởng nhanh và tăng sản lượng sản phẩm so với lên men batch không bổ sung. Ví dụ, năng suất L-lysine trong fed-batch có thể cao hơn 15-20% so với batch.

2. Tại sao chọn Corynebacterium glutamicum để sản xuất L-lysine?
   Corynebacterium glutamicum có khả năng sinh trưởng tốt trên nhiều nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ nuôi cấy, chịu nhiệt độ cao và có hệ gen thuận lợi cho việc cải tiến năng suất L-lysine. Đây là chủng được sử dụng phổ biến trong công nghiệp amino acid.

3. Yếu tố môi trường nào ảnh hưởng lớn nhất đến sản lượng L-lysine?
   Nghiên cứu xác định (NH4)2SO4 và dịch bắp là hai yếu tố có ảnh hưởng lớn nhất đến sản lượng L-lysine, do chúng cung cấp nguồn nitơ và carbon thiết yếu cho vi khuẩn sinh trưởng và tổng hợp sản phẩm.

4. Làm thế nào để xác định thời điểm bổ sung cơ chất trong lên men fed-batch?
   Thời điểm bổ sung cơ chất được xác định khi lượng đường trong môi trường giảm xuống dưới ngưỡng khoảng 20-30 g/L, nhằm duy trì pha sinh trưởng nhanh và tránh ức chế do thiếu dinh dưỡng.

5. Có những khó khăn nào khi áp dụng lên men fed-batch trong sản xuất công nghiệp?
   Khó khăn bao gồm kiểm soát tạp nhiễm, duy trì điều kiện môi trường ổn định, yêu cầu kỹ năng vận hành thiết bị và hệ thống điều khiển tự động phức tạp. Tuy nhiên, lợi ích về năng suất và hiệu quả kinh tế vượt trội so với phương pháp truyền thống.

Kết luận

• Đã khảo sát và xác định đặc điểm sinh học, sinh hóa của chủng Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 phù hợp cho sản xuất L-lysine.
• Xác định (NH4)2SO4 và dịch bắp là hai yếu tố môi trường quan trọng ảnh hưởng đến năng suất L-lysine, với lượng tối ưu cho sản lượng đạt khoảng 38 g/L.
• Kỹ thuật lên men fed-batch cho thấy ưu thế vượt trội so với lên men batch truyền thống về năng suất và hiệu quả sử dụng cơ chất.
• Thời điểm và nồng độ bổ sung cơ chất được xác định rõ ràng, giúp duy trì pha sinh trưởng nhanh và tăng sản lượng L-lysine.
• Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học và thực tiễn để phát triển quy trình sản xuất L-lysine quy mô công nghiệp tại Việt Nam.

Next steps: Mở rộng nghiên cứu quy mô lên men fed-batch công nghiệp, ứng dụng hệ thống điều khiển tự động và phát triển chủng vi khuẩn cải tiến để nâng cao năng suất và ổn định sản phẩm.

Call-to-action: Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp trong lĩnh vực công nghệ sinh học được khuyến khích áp dụng kết quả nghiên cứu để cải tiến quy trình sản xuất L-lysine, góp phần phát triển ngành công nghiệp amino acid trong nước.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU. Kỹ thuật lên men thu nhận L-lysine. Quá trình lên men. Các hình thức lên men.

Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum. Đặc điểm hình thái và vị trí phân loại. Đặc điểm sinh lý. Đặc điểm sinh hóa.

Đặc điểm di truyền. Amino acid L-lysine. Vai trò và ứng dụng. Thu nhận L-lysine từ vi khuẩn.

Bản chất quá trình sinh tổng hợp L-lysine ở vi khuẩn Corynebacterium glutamicum. Kỹ thuật lên men fed-batch thu nhận L-lysine từ Corynebacterium glutamicum. Những nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến hướng của đề tài. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Bố trí thí nghiệm. Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống. Tối ưu hóa môi trường lên men Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm. Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine.

Phương pháp phân tích thí nghiệm. Phương pháp vi sinh. Phương pháp hóa sinh. Phương pháp xử lý số liệu.

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN. Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống. Tối ưu hóa môi trường lên men Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm. Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine.

Xác định thời điểm bắt đầu bổ sung cơ chất. Khảo sát ngưỡng ức chế cơ chất. Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine. 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.

63 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 65 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các hóa chất phân tích .2 Các thiết bị sử dụng trong đề tài .3 Các môi trường nuôi cấy sử dụng trong đề tài.4 Các mức thí nghiệm sàng lọc .5 Thí nghiệm sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu .1 Đặc điểm chủng Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 .2 Kết quả thí nghiệm sàng lọc .3 Mức ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát .4 Kết quả thí nghiệm khởi đầu .5 Hồi quy-phương sai thí nghiệm khởi đầu .6 Kết quả thí nghiệm bề mặt đáp ứng-cấu trúc tâm xoay RSM-CCD .7 Khả năng sử dụng đường của Corynebacterium glutamicum .8 So sánh lên men batch và fed-batch. 61 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 (a) Tế bào vi khuẩn Corynebacterium glutamicum sinh trưởng trên môi trường phức hợp. (b) Tế bào quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét .2 Bản đồ gen Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 .3 Mô hình ezyme aspartate kinase với hai tiểu phần lysCα và lysCβ được cấu tạo bởi bốn chuỗi poplypeptide giống hệt nhau .4 Cấu trúc không gian và cấu tạo phân tử của lysine .5 Sơ đồ tổng quát chuyển hóa từ glucose thành lysine ở vi khuẩn.6 Con đường hình thành L-lysine ở Corynebacterium glutamicum .1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát .1 Khuẩn lạc Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 (a) và hình dạng tế bào Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 (b).2 Đồ thị đường mức thể hiện sự ảnh hưởng của (NH4)2SO4 và dịch bắp lên lượng L-lysine .4 Khả năng sinh trưởng, sinh L-lysine và lượng đường sót trong lên men batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine .5 Khả năng hình thành sinh khối, L-lysine và lượng đường sót khi nuôi cấy Corynebacterium glutamicum ở các nồng độ glucose khác nhau .6 Khả năng sinh trưởng, sinh L-lysine và lượng đường sót trong quá trình lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum-B-0632 .7 Đồ thị so sánh lượng L-lysine trong lên men batch và fed-batch .8 Đồ thị so sánh khả năng sinh trưởng của Corynebacterium glutamicum trong lên men batch và fed-batch .9 Đồ thị so sánh lượng đường sót trong lên men batch và fed-batch.

Lí do chọn đề tài Amino acid rất cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển của người và động vật, đặc biệt là các amino acid không thay thế. Sự thiếu hụt amino acid nói chung và các amino acid không thay thế nói riêng sẽ dẫn đến tình trạng bệnh lý. L-lysine là một amino acid thuộc nhóm không thay thế được quan tâm nhiều hơn cả, vì có nhu cầu khá cao, nhưng lại thường bị thiếu hụt nhất trong khẩu phần ăn. Mặt khác, L-lysine dễ bị phân hủy trong quá trình chế biến thức ăn và cơ thể tuyệt đối không tổng hợp được.

Do đó, thiếu L- lysine rất phổ biến, đặc biệt là ở trẻ nhỏ. Thiếu L-lysine làm giảm tổng hợp protein cơ thể, trẻ biếng ăn, chậm lớn, thiếu men tiêu hóa…. Hiện nay, việc sử dụng công nghệ vi sinh để sản xuất L-lysine là hướng đang được quan tâm. Tuy nhiên, ở Việt Nam, quy trình sản xuất vẫn còn ở quy mô phòng thí nghiệm, số lượng các nghiên cứu về sản xuất L-lysine còn ít, chủng giống chưa đạt chuẩn, năng suất thấp [1].

Với mục tiêu cải thiện quá trình lên men thu nhận L-lysine, chúng tôi chọn giải pháp tối ưu hóa môi trường lên men và kỹ thuật lên men fed-batch. Đây là lý do chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu quá trình lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine”. Mục tiêu nghiên cứu Cải thiện quá trình lên men thu nhận L-lysine từ chủng vi khuẩn Corynebacterium glutamicum-B-0632. Đối tượng nghiên cứu Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 từ trung tâm lưu giữ giống Đại học Quốc Gia Hà Nội.

Nhiệm vụ nghiên cứu 1. Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống. Tối ưu hóa môi trường lên men thu nhận L-lysine bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm. Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine.

Phạm vi nghiên cứu Tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng trong lên men batch, tạo tiền đề cho bước đầu khảo sát lên men fed-batch gián đoạn thu nhận L-lysine ở quy mô phòng thí nghiệm. Đóng góp của luận văn Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các thông số tối ưu của quá trình lên men batch và bước đầu thử nghiệm lên men fed-batch. Kết quả này sẽ là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn Về mặt khoa học: đề tài góp phần khẳng định ưu điểm của phương pháp lên men fed-batch trong lên men tế bào vi khuẩn Corynebacterium glutamicum thu nhận amino acid L-lysine.

Về mặt thực tiễn: cải thiện quá trình lên men thu nhận L-lysine. Kỹ thuật lên men thu nhận L-lysine 1. Khái niệm “Lên men” là thuật ngữ được sử dụng từ khá lâu, có nguồn gốc từ tiếng La tinh “fervere” có nghĩa là “làm chín” để chỉ hoạt động của nấm men trong dịch chiết trái cây hoặc ngũ cốc. Trong lĩnh vực hóa sinh, lên men được hiểu là sự tạo thành năng lượng từ các quá trình dị hóa các hợp chất hữu cơ.

Tuy nhiên, trong lĩnh vực vi sinh vật học, cụm từ này lại được dùng để chỉ chung cho quá trình tạo ra sản phẩm bằng cách nuôi cấy vi sinh vật thích hợp [28]. Quá trình lên men Quá trình lên men là quá trình phân giải carbohydrate trong điều kiện kỵ khí. Quá trình lên men bắt đầu từ sự phân giải các hợp chất chứa carbohydrate thành đường glucose và kết thúc là sự tạo thành CO2 và một số hợp chất chứa carbon chưa được oxy hóa hoàn toàn như ethanol, acid acetic,. Người ta thường dùng tên sản phẩm điển hình tích lũy trong từng loại lên men để gọi quá trình lên men ấy.

Ví dụ, quá trình lên men tích lũy chủ yếu acid lactic thì gọi là lên men lactic (muối dưa, cà, làm sữa chua). Tuy nhiên, có nhiều vi sinh vật hiếu khí có khả năng oxy hóa không hoàn toàn cơ chất tạo ra những sản phẩm giống như lên men kỵ khí, quá trình này cũng được gọi là lên men mà thực chất là oxy hóa hiếu khí. Rất nhiều quá trình oxy hóa không hoàn toàn có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp lên men, vì đã tạo ra những sản phẩm có giá trị [2]. Các hình thức lên men Tùy theo cách phân loại mà có nhiều hình thức lên men khác nhau: Theo tính chất môi trường: lên men dạng lỏng, lên men dạng rắn và bán rắn.

Theo đặc tính sử dụng oxy của chủng vi sinh vật: lên men hiếu khí và lên men kỵ khí. Theo trạng thái: lên men tĩnh (không khuấy trộn hay sục khí) và lên men động (có khuấy trộn hoặc sục khí). Theo mức độ kiểm soát của quy trình: lên men có kiểm soát (kiểm soát độ tạp nhiễm, nồng độ cơ chất, pH…) và lên men không kiểm soát (tự nhiên). 4 Theo kỹ thuật lên men: lên men theo mẻ (batch), lên men liên tục (continous) và lên men dạng bán liên tục (fed-batch hay dạng mẻ có bổ sung).

Trong phần này, chúng tôi sẽ đề cập sâu hơn đến ba kỹ thuật lên men, đó là lên men theo mẻ (batch), lên men liên tục và lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất (fed- batch). Lên men theo mẻ Lên men theo mẻ hay còn gọi là lên men batch. Đây là phương pháp nuôi cấy mà trong suốt thời gian nuôi cấy, ta không thêm vào chất dinh dưỡng và cũng không loại bỏ các sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất, ngoại trừ ammoniac được thêm vào để điều chỉnh pH (nếu có) [12], quần thể tế bào bị giới hạn trong một khoảng không gian nhất định. Vi sinh vật bắt buộc phải trải qua các pha sinh trưởng: pha lag, pha log, pha ổn định và pha suy vong [2, 28].

Trong giai đoạn đầu (pha lag), gần như không có sự tăng trưởng đáng kể nào xảy ra, chủ yếu là sự thích nghi của tế bào với môi trường mới. Trong thực tế sản xuất, cần phải rút ngắn thời gian của pha này càng nhiều càng tốt để đưa hệ thống lên men nhanh chóng bước vào pha tăng trưởng và sinh tổng hợp sản phẩm mong muốn. Sau giai đoạn thích nghi là giai đoạn tăng trưởng và dần đạt đến tốc độ tối đa (pha log) [28]. Sự tăng trưởng trong pha log được biểu diễn theo phương trình sau: dx/dt = µx (1.1) Trong đó: x là sinh khối vi sinh vật tại thời điểm nuôi cấy được t giờ, µ là tốc độ tăng trưởng (/giờ).

Hằng số µ khác nhau tùy vào từng giai đoạn trong chu kỳ tăng trưởng. Từ phương trình (1.1) ta có: dx/x = µdt 𝑡 𝑡  ∫𝑡𝑡 𝑑𝑑/𝑥 = µ ∫𝑡𝑡 𝑑𝑑  lnxt – lnxto = µ(t-to) Trong đó, xto là lượng sinh khối ban đầu, xt là lượng sinh khối sau khi nuôi cấy t giờ. Trong pha log, chất dinh dưỡng còn nhiều, µ sẽ đạt µmax. Mỗi chủng vi sinh vật trong điều kiện tối ưu nhất sẽ có µmax khác nhau.

Tốc độ tăng trưởng phụ thuộc rất lớn 5 vào nguồn dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy và các sản phẩm do quá trình sinh trưởng của chính vi sinh vật tạo ra. Nếu duy trì việc bổ sung dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy ở pha log thì tăng trưởng vẫn đạt được tốc độ cao. Sự tăng số lượng tế bào trong pha log diễn ra theo cấp số nhân với cơ số 2 theo phương trình sau: N = N0.