MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, việc ứng dụng các công nghệ hiện đại để đáp ứng nhu cầu của con ngƣời ngày càng đƣợc nâng cao. Các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên dần đƣợc thay thế cho các hợp chất có nguồn gốc hóa học. Theo tổ chức y tế thế giới, nhu cầu sử dụng các hợp chất từ thiên nhiên trong công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm, dƣợc phẩm là một xu thế tất yếu, đặc biệt là các hợp chất tự nhiên đƣợc tổng hợp từ vi sinh vật đang là điểm đến của các nhà nghiên cứu. Bên cạnh đó, công nghệ nano hiện nay đang trở thành một công nghệ mới nổi và đang tạo ra một cuộc cách mạng trong những ứng dụng y sinh học nhờ vào khả năng giúp con ngƣời can thiệp tại kích thƣớc nano đƣợc sử dụng trong chẩn đoán và điều trị bệnh.
Các nhà khoa học mong muốn có đƣợc sự giao thoa giữa công nghệ sinh học và công nghệ nano bởi lẽ công nghệ nano mang lại cho sinh học những công cụ mới trong khi sinh học cho phép công nghệ nano đạt đƣợc các hệ thống có chức năng mới. Bạc từ lâu đã thể hiện tính chất kháng khuẩn và đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống, tuy nhiên khi ở trạng thái phân tán với kích thƣớc nano thì tính kháng khuẩn lại thể hiện mạnh mẽ hơn. Việc tổng hợp các hạt có kích thƣớc nano từ trƣớc đến nay đều đƣợc thực hiện theo các phƣơng pháp vật lý, hóa học truyền thống độc hại, chi phí cao, không thân thiện với môi trƣờng. Bên cạnh đó, các polysaccharide đƣợc nấm bài tiết dƣới dạng các chất polyme tái tạo là các hợp chất sinh học an toàn, thân thiện với môi trƣờng đƣợc chứng minh là có tính khử và ổn định các hạt nano đƣợc tổng hợp.
Các phƣơng pháp tƣơng thích sinh học này đã đƣợc nghiên cứu ở một số nơi trên thế giới, tuy nhiên ở Việt Nam chƣa có nhiều nghiên cứu theo hƣớng này. Xuất phát từ những yêu cầu thực tế cấp thiết đặt ra, tôi nghiên cứu và thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tinh sạch pullulan và tạo nano bạc Pu-AgNPs có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định”. Nghiên cứu đƣợc thực hiện với các nội dung chính sau: Luan van 6 1. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tinh sạch và thu nhận pullulan đƣợc lên men sinh tổng hợp từ chủng nấm Aureobasidium pullulans.
Nghiên cứu tổng hợp các hạt nano bạc sử dụng pullulan làm chất khử/chất ổn định và các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tạo nano bạc Pu- AgNPs. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của nano bạc Pu-AgNPs tổng hợp đƣợc. Luan van 7 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
TỔNG QUAN VỀ PULLULAN Pullulan là một polymer sinh học phân tử lƣợng lớn, có công thức hóa học (C6H10O5)n sản xuất bằng lên men hiếu khí từ tinh bột, đƣờng với chủng nấm Aureobasidium pullulans [1]. Pullulan có khả năng tạo liên kết sợi, tạo màng mỏng phân hủy tốt. Pullulan tan tốt trong nƣớc lạnh, tạo dịch keo nhớt, độ dính cao, trong suốt, chịu môi trƣờng pH dao động từ 2-12. Màng pullulan ngăn không khí thâm nhập, phủ bên ngoài sản phẩm chống oxy hóa, chống chảy nƣớc, tăng cƣờng khả năng chống mất màu của sản phẩm, sản xuất màng bao gói kẹo, bánh, thực phẩm.
Trong công nghệ mỹ phẩm, với khả năng kết dính cao pullulan đƣợc ứng dụng trong sản xuất dầu gội đầu, làm chất tạo sợi, tạo bọt. Pullulan đƣợc sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, mỹ phẩm, và các ngành công nghiệp dƣợc phẩm, và đang đƣợc ứng dụng trong y sinh học nhƣ trong công nghệ chuyển gen, dẫn thuốc tới đích, kỹ thuật mô, kỹ thuật hình ảnh, làm vỏ thuốc, làm chất cân bằng áp suất trong máu [2]… Hình 1.1: Sản phẩm pullulan dạng bột 1. Cấu trúc hóa học của pullulan Pullulan là một polysaccharide mạch thẳng đƣợc cấu tạo bởi chủ yếu các đơn vị maltotriose và một phần nhỏ các đơn vị maltotetraose theo liên kết Luan van 8 α-1,6 glucoside. Các đơn vị này đƣợc cấu tạo từ các đơn vị glucose theo liên kết α-1,4 glucoside [3].
Polysaccharide ngoại bào của chủng nấm A. pullulans có hai dạng sản phẩm: polysaccharide dị hình và glucan trung hòa. Glucan trung hòa đƣợc gọi là pullulan, chứa liên kết α-1,6 glucoside và α-1,4 glucoside. Pullulan đƣợc xác định dựa trên cơ sở quay cực, thủy phân axit fomic, phổ hồng ngoại, phƣơng pháp phân tích methyl hóa.
Ngƣời ta đã đƣa ra tỷ lệ liên kết α-1,4 : α- 1,6 glucoside trong phân tử pullulan là 3:2 dựa trên phƣơng pháp methyl hóa và oxy hóa [4].2: Cấu trúc hóa học đơn giản của pullulan Khối lƣợng phân tử của pullulan dao động trong khoảng 2,5.105 dalton tùy thuộc vào thời gian lên men, pH và nồng độ photphat [4]. Tính chất của pullulan Pullulan bị phá hủy ở nhiệt độ cao 250-280oC. Pullulan không mùi, không vị, hòa tan trong nƣớc, không hòa tan trong dung môi hữu cơ trừ dimethylfocmandehide và dimethylsulfoxide [2]. Dung dịch pullulan nhớt nhƣng không tạo gel và ổn định.
Độ nhớt của pullulan phụ thuộc vào khối lƣợng phân tử của pullulan. Pullulan có khả năng hình thành 1 màng film trong suốt. Dung dịch pullulan có sức căng bề mặt cao và ổn định tốt, độ nhớt của nó không thay đổi khi có mặt các ion kim loại khác nhau có trong dung dịch. Với khả năng kết dính cao nên có thể nén trực tiếp dƣới nhiệt có ẩm.
Luan van 9 Pullulan có thể tạo thành các loại vật liệu có hình dạng khác nhau. Pullulan tạo thành màng có tính chất ngăn ngừa, không cho không khí thấm qua [5]. Nhiều viên nang đƣợc làm từ pullulan đƣợc sử dụng thay cho gelatin phù hợp cho bệnh nhân tiểu đƣờng và bệnh nhân có chế độ ăn hạn chế, Pullulan tan rất cao trong nƣớc do đó đƣợc sử dụng nhƣ một chất mang thuốc và giúp kiểm soát nồng độ trong huyết tƣơng. Pullulan đã đƣợc nghiên cứu nhƣ là chất nền tảng để xây dựng chế phẩm keo phân phối thuốc nhạy cảm với pH, tạo hạt nano, quá trình khớp nối lắp ráp với các hợp chất sinh học phân phối thuốc chống ung thƣ.
Hiện nay việc ứng dụng pullulan trong lĩnh vực y sinh học đang gia tăng nhờ có tính không độc hại, không kích thích miễn dịch, tƣơng thích sinh học và có tính trơ tự nhiên. So với dextran, tốc độ phân huỷ của pullulan trong huyết thanh nhanh hơn so với dextran [5].1: Tính chất điển hình của pullulan [4] Tính chất Giá trị Trạng thái Dạng bột màu trắng hoặc hơi vàng Sự hòa tan trong nƣớc (25oC) Dễ tan Độ ẩm < 6% Chất tro < 3% Protein < 0,5% Kim loại nặng < 5pp Arenic < 2ppm Độ nhớt của dung dịch 10% ở 30oC 132-179 mm2/s Trọng lƣợng phân tử 10-3000 kDa Luan van 10 1. Ứng dụng của pullulan 1. Ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm Với tính chất tạo đƣợc màng mỏng, ngăn cản đƣợc sự tiếp xúc của oxy với sản phẩm, pullulan đƣợc coi là chất lý tƣởng để bao gói bảo quản, phủ bên ngoài hoàn hảo cho các sản phẩm thực phẩm chống oxy hóa nhất là các sản phẩm có dầu, làm nổi trội màu và tăng cƣờng khả năng chống mất màu của sản phẩm.
Do có khả năng ngăn cản không khí thấm qua nên màng pullulan còn đƣợc dùng nhiều trong việc giữ hƣơng, làm giảm mất mùi vị của sản phẩm và đồng thời tránh đƣợc sự oxy hóa chất béo và các chất dầu có trong thực phẩm, làm tăng thời hạn sử dụng. Ngoài ra do màng pullulan giữ đƣợc hình dạng trong suốt nên còn đƣợc ứng dụng để trang trí, vẽ tranh lên sản phẩm nhất là trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo. Dịch pullulan không màu, không mùi, có thể tạo lớp áo bóng, đẹp, bền màu cho sản phẩm. Pullulan tiêu hóa chậm không làm tăng glucoza trong máu khi ăn, ít calo có thể sử dụng khi pha chế làm thực phẩm cho ngƣời bị bệnh tiểu đƣờng.
Khả năng kết dính cao nên dùng để giữ hình dạng khác nhau của các sản phẩm: viên thịt, viên cá trong chế biến đồ hộp, thức ăn nhanh, xúc xích. Pullulan dùng cho đồ uống, cream, nƣớc sốt làm tăng độ nhớt, độ ổn định, ức chế nấm phát triển và là nguyên liệu tuyệt vời cho bảo quản thực phẩm [6].3: Các sản phẩm thực phẩm có sử dụng pullulan Luan van 11 1. Ứng dụng trong ngành công nghiệp dược phẩm, y học Hình 1.4: Vỏ bao thuốc sử dụng pullulan Ứng dụng trong kỹ thuật mô và cấy ghép: Heparin kết hợp với pullulan ức chế sự tăng sinh của các tế bào cơ trơn và do đó có thể đƣợc sử dụng nhằm mục đích gia tăng các tế bào nội mô mạch máu và ức chế sự tăng sinh của các tế bào cơ trơn [7]. Pullulan được coi như một vật liệu để phân phối thuốc: Các hydrogel pullulan nhƣ các hệ thống phân phối thuốc, đặc biệt ở dạng gel nhỏ và gel nano.
Lợi ích điều trị đạt đƣợc bằng cách phân phối thuốc chậm vào huyết tƣơng, và do đó làm thay đổi nồng độ các cấu hình thuốc. Hạt nano hydrogel của liên kết chéo giữa pullulan với glutaraldehyde đã đƣợc nghiên cứu tổng hợp để phát triển một hệ thống vận chuyển DNA tƣơng thích sinh học và sự ổn định. Đặc biệt, pullulan amphiphilic thu đƣợc từ cholesteryl, acetyl hoặc chloroacetyl ghép với nhóm hydroxyl tạo thành nanogel có khả năng bẫy các phân tử kị nƣớc, các protein hoặc các peptide và axit nucleic [7]. Thuốc chống ung thư dựa vào pullulan: Các hợp chất sinh học đƣợc tổng hợp bởi các dẫn xuất pullulan với doxorubicin hoặc doxorubicin với axit folic.
Những phát hiện này cho thấy rằng các hợp chất sinh học doxorubicin- pullulan phù hợp cho mục đích tiêu khối u thụ động. Luan van 12 Ứng dụng của pullulan trong chuyển gen [7]: Liệu pháp gen là một lĩnh vực mà các ứng dụng của pullulan đang đƣợc nghiên cứu. Chuyển gen thƣờng đƣợc chuyển trung gian qua đƣờng nội bào. Những cố gắng sử dụng liệu pháp gen virus đã đƣợc thực hiện nhƣng nhƣợc điểm lớn mà virus đƣợc biết đến nhƣ là miễn dịch, gây bệnh và có thể nguy hiểm.Vì vậy, cố gắng để phát triển vectơ không virus đƣợc thực hiện và các dẫn xuất của các cation polyme tự nhiên đã đƣợc nghiên cứu.
Pullulan trở thành chất sinh học thích hợp và không độc hại đƣợc nghiên cứu để áp dụng chuyển gen. Dẫn xuất pullulan trong đó có dƣ lƣợng kim loại và trộn với một DNA plasmid trong dung dịch chứa các ion Zn2+ để có đƣợc sự kết hợp của dẫn xuất pullulan và DNA plasmid phối hợp với Zn2+. Ngoài ra, trong y học Pullulan còn đƣợc sử dụng để duy trì áp suất thẩm thấu ở trong máu và mô tế bào và có thể làm tăng cung cấp huyết tƣơng.