Chương 1. Đặt vẫn đề Trong những năm gan đây, sản lượng rau quả nước ta tăng nhanh về số lượng, tuy nhiên vẫn chưa đáp ứng được với nhu cầu của người tiêu dùng và xuất khâu nguyên nhân là do van dé an toàn thực phẩm. Theo Cục An toàn thực phẩm (Bộ Y tế, 12/ 2015), trung bình mỗi năm có khoảng 170 vụ ngộ độc thực phẩm với gan 7 nghìn người trúng độc và 37 người chết. Gan đây, ở trong nước đã có những nghiên cứu ứng dụng chuyên sâu về van dé bao quản trái cây ứng dụng công nghệ màng nano chitosan, một hướng của công nghệ hóa học xanh: thân thiện với môi trường, an toàn với con người, chi phí bao quản thấp.
Nghiên cứu đã đạt được những kết quả khả quan khi ứng dụng trong bảo quan ớt, thanh long, chông các loài nâm moc khác nhau. Chitosan được cau tạo từ các mắt xích D-glucosamin liên kết với nhau bởi liên kết a-(1 4)-glycoside. Là vật liệu phố biến trong tự nhiên, có nhiều trong vỏ các loài giáp xác, côn trùng và một sô loại nầm và là phụ phầm của ngành chê biên thủy sản. Nanochitosan không những mang đây đủ các tính chất của chitosan thông thường như không độc, có khả năng thích ứng sinh học cao, khả năng tự phân hủy, khả năng tạo mang.ma ở kích thước nanomet từ 20 — 100nm, có diện tích bề mặt lớn với điện tích dương lớn hon, do đó hoạt tính sinh học cao hơn so với chitosan và oligochitosan.
Chính đặc điểm khác biệt này đã tạo ra các ứng dụng chitosan ở kích thước nanomet trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong lĩnh vực nông nghiệp (kháng khuẩn, kháng nắm, kích thích sinh trưởng, bảo vệ cây trồng). Từ những yêu câu thực tê trên, với mong muôn được đưa nano chitosan vào ứng dụng rộng rãi hơn trong bảo quản nông sản thực phâm nói chung và rau quả nói riêng, chúng tôi tiên hành thực hiện dé tài “Nghiên cứu phương pháp tạo hạt nano chitosan định hướng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm” HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa Luận văn thạc sĩ 2 2. Mục tiêu đề tài Đề xuất quy trình tạo hạt nano chitosan băng sóng siêu âm, sóng siêu âm kết hợp đồng hóa áp lực cao Khảo sát điều kiện siêu âm tối ưu, nhăm tạo hạt có kích thước nhỏ nhất Khảo sát ở điều kiện tối ưu với nguyên liệu chitosan khác Khảo sát tính kháng nam của nano chitosan trong điều kiện in vitro 3. Nội dung nghiên cứu a) Khảo sát các yếu tổ ảnh hưởng tới quá trình tạo hạt nano bang phương pháp tạo gel ion với sodium tripolyphosphate có hỗ trợ của sóng siêu âm, sóng siêu âm kết hợp đồng hóa áp lực cao.
b) Khảo sát 4 yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo hạt VW pH dung dịch chitosan Tỷ lệ chitosan/S PP Thời gian siêu âm Công suất siêu âm Xác định điều kiện thích hợp để tạo hat nano chitosan bằng phương pháp thực nghiệm c) Ứng dụng thông số tối ưu từ kết quả nghiên cứu của chitosan Hùng Tiến, Can Thơ vào nguyên liệu chitosan trường Dai học Thủy sản Nha Trang d) Khảo sát khả năng kháng nam Colletotrichum acutatum của ché pham nano chitosan trong điều kiện in vitro Quá trình khảo sat được đánh giá dựa trên ba dap ứng: kích thước trung bình hat, độ đồng đều của hạt và thời gian bên của mâu nano chitosan HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa Luận văn thạc sĩ 3 4. Y nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Kết quả nghiên cứu của luận văn sẽ là co sở khoa học cho việc áp dụng phương pháp tạo gel ion với sodium tripolyphosphate có hỗ trợ của sóng siêu âm kết hợp đồng hóa áp lực cao để tạo hạt nano chitosan. Từ kết quả của luận văn cho phép xây dựng quy trình công nghệ sản xuất nano chitosan bằng phương pháp tạo gel ion với sodium tripolyphosphate có hỗ trợ của sóng siêu âm kết hợp đồng hóa áp lực HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa Luận văn thạc sĩ 4 Chương 2. TÔNG QUAN TÀI LIỆU 2.
Ứng dụng của nano chitosan Công nghệ nano phát triển mạnh mẽ và thu hút nhiều nhà nghiên cứu vì những ứng dụng tuyệt vời trong các lĩnh vực: sinh học, hóa học, y học. tao ra các vật liệu ứng dụng khác nhau, trong đó nano chitosan. Sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ nano đã mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn trong cuộc sống và mở ra nhiều nghiên cứu khác.Nano chitosan đang được quan tâm và nghiên cứu tập trung vào các lĩnh vực: dùng làm chất kháng khuan[1], [2]., chat chong oxi hóa [7], [8].[10], chất kháng khối u [11], chất gây hiệu ứng tăng cường miễn dich[12], [13], chất kích kháng bệnh và thúc day tăng trưởng cho cây trồng [141. chất mang dược phẩm [16].
Đặc biệt oligochitosan có độ polyme hóa từ 7 — 10 có hiệu ứng chống xâm nhiễm của nhiều loại nam gây bệnh thực vật thông qua cơ chế tự tạo kháng sinh (phytoalexin) [18] Đáng chú ý. việc ứng dụng nanochitosan dé kháng khuẩn, kháng nam gây hại trên các đối tượng rau quả sau thu hoạch đang thu hút nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm. Năm 2009 Ying Ma và cộng sự tiến hành nghiên cứu khả năng kháng Escherichia coli và Staphylococcus aureus với nanochitosan (thu được từ việc cắt mạch chitosan bang HạOs, kích thước 36nm). Kết quả nghiên cứu cho thay đối với E.
coli tại nông độ 5mg/mL tỷ lệ kháng khuẩn xấp xi đạt 95%, với S. aureus tỷ lệ này chỉ đạt 81% [19] Một nghiên cứu khác của Ling Yien Ing và cộng sự (2012) cho thấy hiệu quả sử dụng nanochitosan theo phương pháp tạo gel ionic được chuẩn bị từ chitosan có trọng lượng phân tử thấp (LMW), va chitosan có trọng lượng phân tử cao (HMW) trong ứng dụng kháng Candida albicans, Fusarium solanivaAspergillus niger. Kết quả cho thấy, nông độ ức chế tối thiểu 50% (MIC) của các loại nanochitosan đều thấp hon rất nhiều so với chitosan thông thường, ngoài ra tác giả còn nhận thay sự tác động lên cấu trúc của nanochitosan LMW và HMW với Aspergillus niger[20]. HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa Luận văn thạc sĩ 5 Cũng trong năm 2012, N.
Ali và cộng sự nghiên cứu tac dụng của nanochitosan ở kích thước 200nm, 600nm và 1000nm đối với Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh than thư trên quả thanh long. Kết quả cho thấy với kích thước 600nm đạt hiệu quả kháng nam tốt nhất trong điều kiện in vitro, thé hiện ở việc ức chế sự thình thành bào tử, nảy mam của bào tử và sinh khối [21]. Một nghiên cứu khác cua A. Ali va cộng sự khi sử dụng nanochitosan có kích thước (nm): 200, 400, 600, 800 và 1000 ở các nồng độ khác nhau trong điều kiện invitro với các chủng thán thư phân lập từ chuối, đu đủ và thanh long.
Kết quả cho thay ở kích thước hạt 200nm đối với chuối, 600nm đối với thanh long va du đủ ở cùng nồng độ 1% là tốt nhất trong việc ức chế sự hình thành bệnh và duy trì chất lượng ở tất cả trái cây sau 28 ngày bảo quản lạnh [22]. Chookhongkha va cộng sự đã nghiên cứu tác động cua mang bao chitosan và nanochitosan (tao gel ionic) đến sự tăng trưởng của 4 chủng nam và chất lượng của hạt ớt giống sau bảo quản. Bốn đối tượng nam được nghiên cứu ở đây bao gồm Rhizopus sp, Colletotrichum capsici, C. gloeosporioides, và Aspergillus niger.
Kết qua ở điều kiện in vitro cho thay nanochitosan ở nồng độ 0.6% có tác dụng ức chế mạnh mẽ hơn đối với sự sinh trưởng của các chủng nắm so với chitosan thông thường [23] Theo nghiên cứu của M. Mustafa và cộng sự cho thấy sau 20 ngày bảo quản cà chua ở nhiệt độ 15°C, độ âm 70-80%; nanochitosan (400, 600, 800nm) có tác dụng hạn chế các biến đổi về khối lượng, màu sắc, độ cứng và hàm lượng chlorophyll hơn so với công thức đôi chứng là mẫu xử lý bang nước cất và mẫu xử lý bằng 5% (v/v) chất nhũ hóa. Tuy kết quả không chỉ ra được kích thước hạt như thế nào là đạt hiệu quả bảo quản tối ưu, nhưng nghiên cứu đã cho thấy các công thức xử lý bởi nanochitosan có thé làm chậm quá trình chín tới 5 ngay[24]. Ở trong nước những năm gần đây cũng đã có những nghiên cứu chuyên sâu vào ứng dụng của nano chitosan: Năm 2011, Dương Thị Ánh Tuyết và cộng sự [25 ]đã nghiên cứu chế tạo nano chitosan băng phương pháp tao gel ion làm chất hap phụ protein ứng dung trong dẫn truyền thuốc.
Kết quả cho thấy với tỷ lệ chitosan/STPP là 6:1 tại pH 4 cho chế HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa Luận văn thạc sĩ 6 phẩm nano chitosan có kích thước nhỏ nhất 48/70 nm. Sử dụng chế phẩm này làm chất hap phụ protein cho thay kha năng hấp phụ cao 96,41 % (1,93 mg/mg) tại 0,5 mg hạt nano chitosan. Năm 2011 Nguyễn Anh Dũng và cộng sự đã thực hiện thành công ở quy mô phòng thí nghiệm quy trình tao hat nano chitosan, sản phẩm hat nano chitosan có kích thước trung bình từ 80 — 106 nm. Hat nano chitosan này được sử dụng làm tá dược hấp phụ chất kích thích miễn dịch cho vaccin cúm A/HINI.
Theo Nguyễn Anh Dũng nghiên cứu cho thay, hạt nano chitosan giúp gia tăng khả năng đáp ứng miễn dich, khả năng hình thành khang thé đặc hiệu với kháng nguyên cúm A/HINI khi được thí nghiệm trên chuột. [26] Trong lĩnh vực kháng khuẩn, La Thị Kim Ngân và cộng sự đã công bố kết quả sử dụng nano chitosan tao ra băng phương pháp say phun với kích thước hạt 95,5 — 395 nm và điện thé zeta là 39.3 - 45,7 mV ứng dụng kháng Staphylococcus aureus. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy nano chitosan ức chế mạnh mẽ sự phát triển của S.aureus, nông độ ức chế tối thiểu (MIC) ở mức 20/g/mL thấp hơn rất nhiều so với chitosan thông thường hoặc thuốc kháng sinh amoxicillin.[27] Các khảo sát này bước đầu cho thay những kết quả khả quan trong việc ứng dụng chitosan. Tuy nhiên, những nghiên cứu này chưa đi sâu vào khảo sát thực nghiệm và đánh giá kết quả tao hạt nano chitosan, chưa đáp ứng được hết những tiềm năng to lớn mà công nghệ tạo hạt nano chitosan hứa hẹn sẽ mang đến cho con nguoi.
Tổng quan về chitosan 2. Cấu trúc của chitosan Chitosan là một polymer carbohydrate tự nhiên có thể tạo ra băng cách deacetyl hóa chitin. Chitosan có thé tìm thấy trong tự nhiên từ động vật giáp xác như tôm, cua. Chitosan còn có thê tìm thay từ những vi sinh vật như nam, men.
HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa Luận văn thạc sĩ 7 OH Chitin-Deacetylase CH20H HO HO NH, H HO Chitosan NH, “ Hình2. 1: Công thức cấu tao cua Chitin và chitosan Chitin là polymer sinh học có nhiều trong thiên nhiên chỉ đứng sau xenluloza. Cau trúc hóa học của Chitin gần giống với xenluloza.