Nghiên Cứu Phương Pháp Tách Chiết ADN Từ Dấu Vết Máu Trên Vải Sau Khi Giặt Bằng Xà Phòng

• Tác giả: Đặng Thị Thu Giang
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Văn Hà
• Trường học: Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên Cứu Phương Pháp Tách Chiết ADN Từ Dấu Vết Máu Trên Vải Sau Khi Giặt
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 0.1. Tính cấp thiết của việc nghiên cứu đề tài
• 0.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 0.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 0.4. Nội dung nghiên cứu
• 0.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Lịch sử giám định gen trong khoa học hình sự
• 1.2. Nhận thức chung về dấu vết máu trong khoa học hình sự
• 1.2.1. Khái niệm về máu
• 1.2.2. Cơ sở khoa học của giám định dấu vết máu
• 1.2.3. Ảnh hưởng của xà phòng lên dấu vết máu
• 1.2.4. Phát hiện dấu vết máu trên vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng
• 1.3. Phương pháp thu lượm dấu vết máu trên vật mang là vải
• 1.4. Giám định định hướng dấu vết máu và xác định tính đặc hiệu loài
• 1.5. Tách chiết ADN từ dấu vết máu
• 1.5.1. Định lượng ADN. Khuếch đại ADN (PCR)
• 1.5.2. Những khó khăn trong nâng cao hiệu quả PCR và chất lượng ADN
• 1.5.3. Kỹ thuật điện di
• 1.5.3.1. Nguyên lý của kỹ thuật điện di
• 1.5.3.2. Nguyên lý điện di trên máy giải trình tự gen ABI Prism 3130 Genetic Analyzer
• 1.5.4. Phân tích dấu vết ADN khi bị lẫn
• 1.5.5. Vấn đề nhiễm ADN
• 1.6. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước đối với lĩnh vực nghiên cứu của đề tài
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thiết bị máy móc
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp thu lượm dấu vết máu trên vật mang là vải
• 2.2.2. Phương pháp giám định định hướng dấu vết máu
• 2.2.3. Phương pháp miễn dịch khuếch tán kép – Ouchterlony
• 2.2.4. Phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu
• 2.2.5. Định lượng ADN
• 2.2.6. Phương pháp PCR
• 2.2.7. Kỹ thuật điện di trên máy điện di mao dẫn (Capillary Electrophoresis - CE)
• 2.2.8. Thiết kế bố trí thí nghiệm
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả nghiên cứu
• 3.1.1. Kết quả xác định định hướng dấu vết máu thu từ các vụ án với dung dịch phenolphthalein
• 3.1.2. Kết quả xác định protein loài sử dụng kỹ thuật khuếch tán miễn dịch kép theo Ouchterlony
• 3.1.3. Kết quả thực nghiệm tách chiết bằng phương pháp sử dụng chelex 5% và tách chiết bằng bộ kít PrepFiler
• 3.1.4. Kết quả tách chiết bằng phương pháp PrepFiler ứng dụng vào mẫu vụ án thực tế
• 3.1.5. Hình ảnh điện di một số mẫu thực nghiệm, mẫu án thực tế
• 3.2. Thảo luận kết quả nghiên cứu
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Tách Chiết ADN Từ Máu Trên Vải

Phân tích ADN từ dấu vết máu đã trở thành yếu tố then chốt trong giám định hình sự và điều tra phá án. Việc này cho phép truy nguyên cá thể, xác định nạn nhân, và tìm kiếm người mất tích. Mỗi năm, Viện Khoa học hình sự tiếp nhận hàng trăm yêu cầu giám định ADN, chủ yếu từ dấu vết máu, tinh trùng, tóc, và các mẫu sinh học khác. Tuy nhiên, việc tách chiết ADN từ máu trên vải, đặc biệt sau khi giặt, gặp nhiều thách thức do chất lượng và số lượng ADN giảm đáng kể. Điều này đòi hỏi các phương pháp tách chiết hiệu quả hơn để đảm bảo thành công trong giám định.

1.1. Tầm quan trọng của giám định ADN trong hình sự

Giám định ADN đóng vai trò quan trọng trong việc xác định tội phạm, truy tìm tung tích nạn nhân và xác định quan hệ huyết thống. Phương pháp này ngày càng được hoàn thiện và phát triển, trở thành một công cụ giám định toàn cầu. Theo thống kê năm 2014 tại Viện Khoa học hình sự, có 421 vụ án yêu cầu giám định ADN, trong đó có 146 vụ liên quan đến dấu vết máu.

1.2. Thách thức khi tách chiết ADN từ mẫu máu đã giặt

Việc tách chiết ADN từ các mẫu máu trên vải sau khi giặt gặp nhiều khó khăn do chất tẩy rửa phá hủy và rửa trôi dấu vết. Điều này làm giảm đáng kể số lượng và chất lượng ADN, gây khó khăn cho công tác giám định. Trong nhiều trường hợp, dấu vết máu trên vải là nguồn chứng cứ duy nhất, do đó việc tách chiết ADN thành công là vô cùng quan trọng.

II. Vấn Đề Ảnh Hưởng Của Giặt Đến ADN Từ Dấu Vết Máu

Trong các vụ án hình sự, việc xác định dấu vết máu của nạn nhân trên quần áo nghi phạm hoặc trên các vật dụng tại hiện trường là vô cùng quan trọng. Tuy nhiên, thủ phạm thường cố gắng loại bỏ bằng chứng bằng cách giặt quần áo hoặc vật dụng dính máu. Quá trình giặt, đặc biệt với xà phòng và chất tẩy rửa, gây ảnh hưởng lớn đến độ bền ADN, làm giảm khả năng tách chiết ADN thành công. Do đó, cần có các phương pháp đặc biệt để xử lý các mẫu này.

2.1. Tác động của xà phòng và chất tẩy rửa lên ADN

Xà phòng và chất tẩy rửa có thể phá hủy cấu trúc ADN, làm giảm số lượng và chất lượng ADN thu được. Các chất này có thể gây biến tính ADN, làm ảnh hưởng đến quá trình khuếch đại ADN (PCR) và phân tích điện di. Vì vậy, cần có các phương pháp tách chiết đặc biệt để loại bỏ các chất ức chế này.

2.2. Khó khăn trong giám định ADN từ mẫu đã qua xử lý

Khi mẫu máu đã qua giặt, việc tách chiết ADN bằng các phương pháp thông thường thường không hiệu quả. Lượng ADN thu được thường không đủ để thực hiện phản ứng PCR, hoặc chất lượng ADN kém, gây khó khăn cho việc phân tích kiểu gen. Điều này đòi hỏi các nhà khoa học phải nghiên cứu và áp dụng các phương pháp tách chiết tiên tiến hơn.

III. Phương Pháp Tách Chiết ADN Hiệu Quả Từ Máu Đã Giặt

Để giải quyết vấn đề trên, cần áp dụng các phương pháp tách chiết ADN tiên tiến, có khả năng loại bỏ các chất ức chế và thu được lượng ADN đủ để phân tích. Hai phương pháp phổ biến hiện nay là sử dụng dung dịch Chelex 5% và bộ kít tách chiết PrepFiler. Mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp phù hợp phụ thuộc vào tình trạng và đặc điểm của mẫu.

3.1. Tách chiết ADN bằng dung dịch Chelex 5

Phương pháp tách chiết bằng Chelex 5% là phương pháp thông dụng, giá thành rẻ, dễ thao tác và nhanh chóng. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi chất lượng ADN phải tốt, số lượng ADN phải tương đối nhiều và có độ tinh khiết cao. Do đó, phương pháp này phù hợp với các mẫu có chất lượng tương đối tốt và ít bị biến tính.

3.2. Sử dụng bộ kít tách chiết PrepFiler cho mẫu ADN degraded

Bộ kít tách chiết PrepFiler cho hiệu quả cao và tối ưu, đặc biệt đối với các mẫu có hàm lượng ADN thấp, bị biến tính và lẫn nhiều tạp chất, chất ức chế. Tuy nhiên, phương pháp này có giá thành cao và dễ bị nhiễm trong quá trình thao tác. Do đó, cần có những khảo sát để có được sự lựa chọn phù hợp.

3.3. So sánh hiệu quả giữa Chelex 5 và PrepFiler

Việc so sánh hiệu quả giữa hai phương pháp tách chiết là rất quan trọng để lựa chọn phương pháp phù hợp với từng loại mẫu cụ thể. Lượng ADN thu được, chất lượng ADN và hình ảnh điện di là các tiêu chí quan trọng để đánh giá hiệu quả của từng phương pháp. Việc lựa chọn đúng phương pháp tách chiết sẽ giúp tiết kiệm chi phí và thời gian.

IV. Ứng Dụng Thực Tế Giám Định ADN Từ Vụ Án Cụ Thể

Trong thực tế, việc áp dụng các phương pháp tách chiết ADN vào các vụ án cụ thể đòi hỏi sự linh hoạt và kinh nghiệm của giám định viên. Việc lựa chọn phương pháp phù hợp, tối ưu hóa quy trình và đánh giá kết quả là những yếu tố then chốt để đảm bảo thành công trong giám định. Các kết quả thu được từ giám định ADN có thể cung cấp bằng chứng quan trọng để xác định tội phạm và giải quyết vụ án.

4.1. Quy trình giám định ADN trong một vụ án hình sự

Quy trình giám định ADN bao gồm nhiều bước, từ thu thập mẫu, tách chiết ADN, khuếch đại ADN (PCR), điện di và phân tích kết quả. Mỗi bước đều đòi hỏi sự cẩn thận và chính xác để đảm bảo tính tin cậy của kết quả. Việc sử dụng các kỹ thuật định lượng ADN bằng Real-time PCR giúp đánh giá hàm lượng ADN và điều chỉnh hàm lượng ADN khuôn đưa vào mỗi phản ứng PCR.

4.2. Phân tích kết quả và đánh giá chất lượng ADN

Kết quả giám định ADN được thể hiện qua các bảng kết quả nồng độ ADN tổng số được tách chiết trực tiếp từ dấu vết máu; biểu đồ về hình thái các peak biểu thị cho các alen thu được ở 16 locus gen theo hệ STR (IdentifilerTM). Qua đó, giúp giám định viên gián tiếp đánh giá số lượng và chất lượng đối với từng alen của ADN tách chiết được từ mẫu máu cần khảo sát.

V. Kết Luận Tối Ưu Hóa Quy Trình Tách Chiết ADN Pháp Y

Nghiên cứu và ứng dụng các phương pháp tách chiết ADN hiệu quả từ dấu vết máu trên vải sau khi giặt có ý nghĩa quan trọng trong công tác giám định hình sự. Việc lựa chọn phương pháp phù hợp, tối ưu hóa quy trình và đánh giá kết quả là những yếu tố then chốt để đảm bảo thành công trong giám định. Các kết quả thu được từ giám định ADN có thể cung cấp bằng chứng quan trọng để xác định tội phạm và giải quyết vụ án.

5.1. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của nghiên cứu

Từ kết quả nghiên cứu, đã tách chiết được lượng ADN hiệu quả nhất nhờ lựa chọn đúng phương pháp phù hợp đối với dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự, góp phần rút ngắn thời gian, tiết kiệm chi phí. Ứng dụng để tách chiết thành công ADN đối với các dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự.

5.2. Hướng phát triển trong tương lai của giám định ADN

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp tách chiết ADN tiên tiến hơn, có khả năng xử lý các mẫu có chất lượng kém và lẫn nhiều tạp chất. Đồng thời, cần tăng cường đào tạo và nâng cao trình độ chuyên môn cho các giám định viên để đáp ứng yêu cầu ngày càng cao của công tác giám định ADN.

## Tổng quan nghiên cứu

Phân tích dấu vết ADN đã trở thành công cụ không thể thiếu trong công tác giám định hình sự, giúp truy nguyên và nhận dạng cá thể trong các vụ án hình sự, tìm tung tích nạn nhân, xác định quan hệ huyết thống. Năm 2014, Viện Khoa học hình sự tiếp nhận 421 vụ án yêu cầu giám định ADN, trong đó 146 vụ liên quan đến dấu vết máu và 54 vụ có dấu vết máu trên vật mang là vải với 144 mẫu cần giám định. Nhiều mẫu vải đã bị giặt bằng xà phòng, làm giảm đáng kể số lượng và chất lượng ADN, gây khó khăn lớn cho công tác giám định. 

Mục tiêu nghiên cứu là đánh giá và so sánh hiệu quả của hai phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu trên vật mang là vải đã bị giặt bằng xà phòng, nhằm tìm ra quy trình tối ưu phục vụ công tác giám định ADN hình sự. Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an, với các mẫu thu thập từ các vụ án hình sự trên toàn quốc, trong khoảng thời gian từ năm 2014 đến 2015. Kết quả nghiên cứu góp phần nâng cao hiệu quả giám định ADN, rút ngắn thời gian, tiết kiệm chi phí và tăng độ chính xác trong truy nguyên cá thể từ dấu vết máu trên vải đã qua giặt.

## Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

### Khung lý thuyết áp dụng

- **Giám định ADN trong khoa học hình sự**: Dựa trên nguyên lý ADN có tính cá biệt cao, phân tích các đoạn lặp ngắn STR (Short Tandem Repeats) giúp nhận dạng cá thể chính xác.
- **Ảnh hưởng của xà phòng lên dấu vết máu**: Xà phòng chứa các muối natri của axit béo có khả năng phá hủy và rửa trôi dấu vết máu, làm giảm lượng ADN thu được và gây ức chế phản ứng PCR.
- **Phản ứng PCR và kỹ thuật điện di mao quản**: PCR khuếch đại ADN mục tiêu từ lượng rất nhỏ, kết hợp với điện di mao quản giúp phân tích kiểu gen chính xác.
- **Phương pháp tách chiết ADN**: So sánh hai phương pháp chính là tách chiết bằng dung dịch Chelex 5% và bộ kit PrepFiler, trong đó PrepFiler ưu việt hơn với mẫu có lượng ADN thấp và bị biến tính.

### Phương pháp nghiên cứu

- **Nguồn dữ liệu**: 144 mẫu dấu vết máu trên vật mang là vải đã bị giặt bằng xà phòng, thu thập từ các vụ án hình sự trên toàn quốc.
- **Thiết kế thí nghiệm**: Tạo mẫu máu trên các loại vải khác nhau, giặt bằng các loại xà phòng phổ biến (Ô mô, Tide, Ariel), giặt tay và giặt máy, với các biến số như lượng máu, thời gian tồn tại trước giặt, chất liệu và màu sắc vải.
- **Phân tích**: Tách chiết ADN bằng hai phương pháp Chelex 5% và PrepFiler, định lượng ADN bằng Real-time PCR, khuếch đại ADN bằng bộ kit Identifiler, phân tích kết quả bằng kỹ thuật điện di mao quản trên máy ABI Prism 3130.
- **Timeline nghiên cứu**: Thực hiện trong năm 2014-2015, bao gồm thu thập mẫu, thí nghiệm tách chiết, phân tích PCR và điện di, tổng hợp và đánh giá kết quả.

## Kết quả nghiên cứu và thảo luận

### Những phát hiện chính

- **Hiệu quả tách chiết ADN**: Phương pháp PrepFiler cho lượng ADN tách chiết cao hơn trung bình 2-3 lần so với Chelex 5%, đặc biệt với mẫu vải đã giặt bằng xà phòng.
- **Ảnh hưởng của loại xà phòng**: Mẫu giặt bằng bột giặt Ô mô cho kết quả tách chiết ADN tốt hơn so với Tide và Ariel, với nồng độ ADN trung bình lần lượt là khoảng 15 ng/µl, 10 ng/µl và 8 ng/µl.
- **Ảnh hưởng của phương pháp giặt**: Giặt tay giữ lại lượng ADN nhiều hơn giặt máy khoảng 20%, do giặt máy làm phân tán và rửa trôi dấu vết máu mạnh hơn.
- **Ảnh hưởng của thời gian tồn tại dấu vết trước giặt**: Dấu vết máu để khô 24 giờ trước khi giặt cho kết quả tách chiết ADN tốt hơn 72 giờ khoảng 15%.
- **Ảnh hưởng của chất liệu và màu sắc vải**: Vải cotton dày cứng giữ lại ADN tốt hơn vải polyester mỏng mềm khoảng 25%. Màu vải trắng cho kết quả tách chiết ADN cao hơn màu đen và đỏ.

### Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy bộ kit PrepFiler vượt trội trong việc tách chiết ADN từ dấu vết máu trên vải đã giặt, do khả năng loại bỏ tạp chất và chất ức chế PCR hiệu quả hơn. Sự khác biệt về loại xà phòng và phương pháp giặt ảnh hưởng trực tiếp đến lượng ADN còn lại trên vải, phù hợp với cơ chế hoạt động của các thành phần trong xà phòng và tác động vật lý của giặt máy. Thời gian tồn tại dấu vết máu trước giặt càng ngắn thì ADN càng ít bị phân hủy, tăng khả năng tách chiết thành công. Chất liệu và màu sắc vải ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ và giữ lại dấu vết máu, từ đó ảnh hưởng đến lượng ADN thu được. Các dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh nồng độ ADN tách chiết theo từng nhóm mẫu, giúp minh họa rõ ràng hiệu quả của từng yếu tố.

## Đề xuất và khuyến nghị

- **Áp dụng phương pháp tách chiết PrepFiler** cho các mẫu dấu vết máu trên vải đã giặt nhằm tối ưu hóa lượng ADN thu được, nâng cao tỷ lệ thành công trong giám định ADN. Thời gian thực hiện: ngay lập tức tại các phòng thí nghiệm giám định.
- **Ưu tiên thu thập mẫu vải màu sáng và chất liệu cotton** trong công tác thu thập chứng cứ để tăng khả năng phân tích ADN thành công. Chủ thể thực hiện: cán bộ điều tra và giám định.
- **Khuyến cáo giặt tay thay vì giặt máy** khi xử lý các vật chứng có dấu vết máu để giảm thiểu mất mát ADN. Thời gian áp dụng: trong quá trình bảo quản và xử lý vật chứng.
- **Rút ngắn thời gian giữa việc để dấu vết máu và thu thập mẫu** nhằm hạn chế sự phân hủy ADN, tăng hiệu quả giám định. Chủ thể thực hiện: lực lượng khám nghiệm hiện trường.
- **Tăng cường đào tạo và trang bị kỹ thuật phòng tránh nhiễm ADN** trong quá trình thu thập và phân tích mẫu để đảm bảo độ chính xác và tin cậy của kết quả giám định.

## Đối tượng nên tham khảo luận văn

- **Cán bộ điều tra hình sự**: Nắm bắt kỹ thuật thu thập và xử lý mẫu dấu vết máu trên vải đã giặt, nâng cao hiệu quả thu thập chứng cứ.
- **Chuyên viên giám định ADN**: Áp dụng phương pháp tách chiết tối ưu, cải thiện chất lượng phân tích ADN từ mẫu khó.
- **Nhà nghiên cứu sinh học pháp lý**: Tham khảo cơ sở lý thuyết và thực nghiệm về ảnh hưởng của xà phòng và các yếu tố vật lý lên dấu vết máu.
- **Sinh viên ngành sinh học thực nghiệm và pháp y**: Học tập quy trình nghiên cứu, phương pháp phân tích và ứng dụng thực tiễn trong giám định ADN hình sự.

## Câu hỏi thường gặp

1. **Tại sao dấu vết máu trên vải đã giặt khó phân tích ADN?**  
   Xà phòng và quá trình giặt làm phân hủy, rửa trôi dấu vết máu, giảm lượng ADN còn lại và gây ức chế phản ứng PCR, làm giảm hiệu quả phân tích.

2. **Phương pháp tách chiết nào hiệu quả nhất cho mẫu vải đã giặt?**  
   Bộ kit PrepFiler cho hiệu quả cao hơn Chelex 5% nhờ khả năng loại bỏ tạp chất và giữ lại ADN nguyên vẹn, phù hợp với mẫu có lượng ADN thấp.

3. **Ảnh hưởng của loại xà phòng đến kết quả giám định ADN như thế nào?**  
   Các loại xà phòng khác nhau có thành phần và cơ chế hoạt động khác nhau, ảnh hưởng đến mức độ phá hủy dấu vết máu và lượng ADN còn lại trên vải.

4. **Có thể tăng số chu kỳ PCR để cải thiện kết quả không?**  
   Có thể tăng số chu kỳ PCR (đến khoảng 34 chu kỳ) để khuếch đại ADN từ mẫu có lượng thấp, nhưng cần cẩn trọng vì tăng chu kỳ cũng làm tăng nguy cơ nhiễm và sai lệch kết quả.

5. **Làm thế nào để tránh nhiễm ADN trong quá trình thu thập và phân tích mẫu?**  
   Thực hiện nghiêm ngặt quy trình phòng tránh nhiễm như sử dụng găng tay, khẩu trang, thay đổi dụng cụ thường xuyên, phân chia khu vực làm việc riêng biệt và lưu giữ kiểu gen của người thu thập mẫu.

## Kết luận

- Đã xác định được phương pháp tách chiết ADN tối ưu là sử dụng bộ kit PrepFiler cho dấu vết máu trên vải đã giặt bằng xà phòng.  
- Các yếu tố như loại xà phòng, phương pháp giặt, thời gian tồn tại dấu vết và chất liệu vải ảnh hưởng rõ rệt đến chất lượng và số lượng ADN thu được.  
- Kết quả nghiên cứu góp phần nâng cao hiệu quả giám định ADN trong các vụ án hình sự, đặc biệt với mẫu khó như dấu vết máu trên vải đã giặt.  
- Đề xuất áp dụng quy trình tách chiết và thu thập mẫu phù hợp nhằm tăng tỷ lệ thành công và độ chính xác trong giám định.  
- Khuyến khích tiếp tục nghiên cứu mở rộng và ứng dụng công nghệ mới để hoàn thiện hơn nữa công tác giám định ADN hình sự.

Hành động tiếp theo: Triển khai áp dụng quy trình tách chiết ADN tối ưu tại các phòng giám định, đào tạo cán bộ và cập nhật hướng dẫn kỹ thuật.  
Hãy liên hệ Viện Khoa học hình sự để được hỗ trợ và cập nhật các phương pháp giám định ADN tiên tiến nhất.