CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu hệ gen thực vật Trên thế giới các nghiên cứu về hệ gen học đã bắt đầu phát triển từ những năm cuối thế kỷ 20 khi có sự ra đời của các thiết bị giải trình tự thế hệ thứ nhất, điển hình là việc nghiên cứu và thành lập hệ gen người tham chiếu bắt đầu từ năm 1990, hoàn thành vào năm 2003[1]. Tiếp sau đó là sự ra đời của công nghệ giải trình tự thế hệ mới những năm đầu thế kỷ 21 đã thúc đẩy sự phát triển của nhánh nghiên cứu hệ gen học. Đối với thực vật nói riêng những nghiên cứu đầu tiên về hệ gen của loài cây mô hình Arabidopsis thaliana khi sử dụng dữ liệu giải trình tự thế hệ mới đầu thế kỷ 21 là nghiên cứu tiền đề cho việc phát triển hệ gen học và tiến hoá thực vật.[2], [3] Đến năm 2008 rất nhiều hệ gen thực vật khác nhau được công bố và đề cập đến trong nghiên cứu của tác giả Gupta. Trong những năm gần đây khi có sự phát triển vũ bão của công nghệ giải trình tự thế hệ mới đặc biệt là công nghệ giải trình tự thế hệ thứ 3 và thứ 4, các công bố liên quan tới hệ gen thực vật ngày càng gia tăng.
Trong khoảng 20 năm phát Ảnh 1-1: Thống kê về số lượng hệ gen thực vật được công bố trong 20 năm qua [5] 3 4 triển của công nghệ giải trình tự đã có trên 1000 loài thực vật được giải trình tự gen. Cung cấp một lượng thông tin khổng lồ và hữu ích cho những nhà nghiên cứu về thực vật học cũng như tiến hoá.[5], [6] Nhìn vào hình 1-1 chúng ta có thể thấy rằng sự số lượng hệ gen thực vật được công bố tăng mạnh từ những năm 2014 khi Illumina ra mắt những hệ máy thông lượng cao của họ HiSeq, NovaSeq. Đặc biệt từ 2016 có sự tham gia của những hãng giải trình tự đoạn dài giúp gia tăng số lượng và chất lượng của hệ gen thực vật. Những đóng góp về hệ gen thực vật đã giúp các nhà phân loại thực vật phân loài chính xác các loài về đúng nhánh của chúng.
Năm 2011, chi Psilanthus có quan hệ gần gũi đã được gộp vào Coffea. Tuy nhiên, kết quả thu được vào năm 2017 - dựa trên 28.800 SNP - chỉ ra rằng không có hỗ trợ phát sinh gen đáng kể cho sự hợp nhất này.[7] Thêm vào đó những nghiên cứu về gen trong công bố của Yves Bawin năm 2021 chỉ ra rằng Coffea canephora và C. eugenioides đã được xác nhận là loài tổ tiên giả định của C. Những loài này rất có thể đã được lai tạo từ khoảng 1,08 triệu đến 543 000 năm trước, trùng với các thời kỳ biến động môi trường, có thể gây ra sự thay đổi phạm vi của các loài tổ tiên tạo điều kiện cho sự xuất hiện của C.[8] Ở Việt Nam cũng có những nghiên cứu về hệ gen thực vật nói chung là lục lạp nói riêng giúp ích cho việc phân loài, chọn giống, bảo tồn những loài 4 Ảnh 1-2: Kết quả giải trình tự lục lạp sâm ngọc linh và phân loài sâm ngọc linh trong nghiên cứu của GS.
Nông Văn Hải và các cộng sự 5 thực vật quý hiếm. Điển hình như nghiên cứu về lục lạp của loài sâm ngọc linh đặc hữu của Việt Nam của Gs. Nông Văn Hải và các công sự. Trong nghiên cứu này nhóm nghiên cứu đã tìm kiếm được 4 chỉ thị có tiềm năng làm mã vạch phân tử cho phân loại sâm Ngọc Linh và các loài khác thuộc chi Nhân sâm.
[9]– [11] Như vậy, vai trò của việc nghiên cứu hệ gen thực vật nói chung và hệ gen lục lạp nói riêng là rất quan trọng. Tuy nhiên, hiện nay phương pháp phân tích hệ gen lục lạp có rất nhiều. Và chưa có nhiều nghiên cứu về việc so sánh, đánh giá những phương pháp này. Vì vậy, việc tiến hành so sánh đánh giá các phương pháp này là rất cần thiết.2 Cấu trúc hệ gen lục lạp và ý nghĩa khoa học Lục lạp là một đơn vị chức năng trong tế bào và đóng vai trò là bào quan quang hợp chỉ có ở thực vật và tảo.
Nhờ có lục lạp mà thực vật, tảo có thể chuyển hóa năng lượng ánh sáng thành lượng tích trong chất hữu cơ. Ở thực vật, lục lạp có trong các bộ phận xanh của cây, trong đó có nhiều nhất là ở lá. Người đầu tiên phát hiện ra lục lạp là Julius von Sachs (1832–1897) - một nhà thực vật học và tác giả của nhiều cuốn sách giáo khoa cơ bản. Lục lạp cũng có cấu trúc màng hai lớp với màng ngoài rất dễ thấm còn màng trong thấm rất ít và ở giữa 2 lớp màng này có một khoang giữa màng.
Màng trong bao bọc một vùng không có màu xanh lục, được gọi là Stroma. Stroma là nơi diễn ra các phản ứng của pha tối và nó giống như chất nền matrix của ty thể, có chứa các enzyme, ARN, AND và các ribosome. Các ribosome là các hạt hình cầu có kích thước 15 - 20 cm. Nó ở trong chất nền cùng với các hạt tinh bột với kích thước khác nhau.
5 6 Trong lục lạp có chứa đến 80% loại protein không hòa tan có liên kết với lipit ở dạng lipoprotein. Clorophyl là một trong những thành phần thuộc hệ sắc tố quang hợp của lục lạp, bao gồm diệp lục a và diệp lục b. Các phân tử clorophyl có cấu trúc không đối xứng gồm một đầu ưa nước được do 4 vòng pirol xếp xung quanh nguyên tử magie tạo thành và một đuôi dài là mạch kị nước. Ảnh 1-3: Cấu tạo của lục lạp Bên cạnh Corophyl, Caroic cũng là những sắc tố khác màu có trong lục lạp, tuy nhiên, nó thường bị màu lục của clorophyl che lấp.
Chúng chỉ có cơ hội xuất hiện vào mùa thu, thời điểm mà lượng Clorophyl bị sụt giảm đi khá nhiều. Ở tảo và thực vật thủy sinh thì sắc tố quang hợp là Phicobilin. Đây là nhóm sắc tố đóng vai trò quan trọng trong việc hấp thụ ánh sáng lục (550 nm) và vàng (612 nm) trong ánh sáng mặt trời. Ngoài ra, trong lục lạp cũng có chứa axit nucleic, ARN (hàm lượng từ 2 - 4 % khối lượng khô), ADN (0,2 - 0,5% khối lượng khô), các chất truyền năng lượng, enzim, NADP, cytocrom, plastokinon, reductasa, atp-sintetase, plastoxiamin, ferredonxin và các enzim của chu trình calvin.
6 7 Bảng các thành phần hóa học của lục lạp: Hàm lượng Chất Các cấu thành % Protein 35 - 55 80% không hòa tan Mỡ 50%, colin 46%, sterin 20%, sáp 16%, Lipit 20 - 30 photphatit 2-7%, etanolamin 8% Gluxit Thay đổi Tinh bột, đường có photphat Clorophyl 9 Clorophyl α 75%, Clorophyl β75% Carotinoit 4.5 Xantophyl 75%, carotin 25% ARN 2-4 ADN 0.5 Mặc dù chỉ chiếm 0.5% thành phần của lục lạp nhưng bộ gen lục lạp lại có ý nghĩa rất lớn trong việc nghiên cứu tiến hoá và di truyền. Hệ gene lục lạp nói chung là hệ gen lục lạp của cà phê nói riêng có cấu trúc là hệ DNA dạng vòng gồm 4 phần: vùng sao chép đơn dài (LSC - long single copy section), vùng sao chép đơn ngắn (SSC - short single copy section) và 2 vùng lặp lại đảo ngược IRA và IRB. Các đoạn lặp đảo ngược có độ dài rất khác nhau, mỗi đoạn dài từ 4.[11] Sự lặp lại nghịch đảo ở thực vật có xu hướng ở giới hạn trên của phạm vi này, mỗi lần lặp lại có chiều dài 20.[9] [13] Các vùng lặp đảo ngược thường chứa ba RNA ribosome và hai gen tRNA, nhưng chúng có thể được mở rộng hoặc thu nhỏ để chứa ít nhất bốn hoặc nhiều nhất là trên 150 gen. 7 8 Bộ gen lục lạp của cà phê là một phân tử DNA hình tròn có kích thước 155 189 bp với cấu trúc bốn phần đặc trưng của phần lớn các nhiễm sắc thể lục lạp thực vật trên cạn.
Nó bao gồm hai vùng lặp lại đảo ngược (IRa và IRb) 25 943 bp được phân tách bằng các vùng sao chép đơn lớn (LSC) và nhỏ (SSC) lần lượt là 85 166 và 18 137 bp. Tỷ lệ các chuỗi protein, RNA vận chuyển (tRNA), RNA ribosome (rRNA), trình tự intron và liên gen lần lượt là 51%, 2%, 6%, 9% và 32%. Trong số 130 gen có trong bộ gen, 112 gen hiện diện dưới dạng một bản sao duy nhất và 18 gen được sao chép trong IR. Vùng mã hóa bao gồm 79 gen protein, 29 tRNA và 4 rRNA.
Bộ gen lục lạp cà phê có 59,35% trình tự mã hóa, trong đó 51,76% mã hóa cho protein. Mười tám gen chứa intron, 15 gen có hai exon và ba gen có ba exon. Mười hai gen mã hóa protein và sáu tRNA có intron. Một phần gen rps19 được nhân đôi tại ranh giới IRA–LSC do sự mở rộng của IR.
Sự sao chép tương tự các phần của rps19 xảy ra ở tất cả các thành viên của họ Solanaceae ngoại trừ thuốc lá. Ngoài ra, trong trường hợp cà phê, các nhà khoa học quan sát thấy gen infA còn nguyên vẹn, trong khi đó nó là gen giả ở Ảnh 1-4: Cấu trúc hệ gen lục lạp loài cà phê arabica 8 9 thuốc lá và ở hầu hết các thành viên khác của họ Solanaceae. Hàm lượng AT và GC của bộ gen lục lạp cà phê lần lượt là 63% và 37%, rất giống với hàm lượng của lúa, ngô, cam quýt, bông và thuốc lá.3 Công nghệ giải trình tự NGS và dữ liệu giải trình tự NGS Thuật ngữ “Next generation sequencing - giải trình tự thế hệ tiếp theo” thể hiện rằng công nghệ giải trình tự đã bước sang một giai đoạn mới, công nghệ mới, đột phá về công suất, giá thành cũng như chất lượng giải trình tự. Hiện nay, NGS đã có đến thế hệ thứ 4.
Thế hệ thứ 2 là thế hệ giải trình tự đoạn ngắn của các hãng như: Illumina, MGI, Genemind, Ion Torrent… Thế hệ thứ 3 là thế hệ giải trình tự đoạn dài bằng công nghệ SMRT sequencing – giải trình tự thời gian thực của hãng Pacbio và hãng Oxford Nanopore công bố rằng họ là thế hệ giải trình tự thế hệ thứ 4 – công nghệ giúp giải trình tự được những đoạn trình tự Ultra-longread trong những thiết bị nhỏ gọn, linh hoạt và thời gian nhanh. Phương pháp SBS còn xa hơn nữa là công nghệ giải trình tự Sanger, không có đầu cuối dideoxy, kết hợp với các chu kỳ tổng hợp, hình ảnh và phương pháp lặp đi lặp lại để kết hợp các nucleotide bổ sung trong chuỗi ngày càng tăng.